本發(fā)明涉及體外診斷免疫檢測領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種化學(xué)發(fā)光免疫檢測類風(fēng)濕因子IgG試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）檢測在臨床上是比較常用的檢測項(xiàng)目，主要用在對自身免疫性疾病的診斷，特別是對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷。類風(fēng)濕因子（RF）是一種以變性IgG為靶抗原的自身抗體，主要為19S的IgM，也可見7S的IgG及IgA。是由于溶血性鏈球菌或其它細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、慢性病毒等感染因子所引起的。
一般認(rèn)為, RF 有兩種來源, 一種是自然發(fā)生的RF，另一種是病理性RF。自然發(fā)生的RF發(fā)揮其調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)、激活補(bǔ)體加快清除微生物感染和清除免疫復(fù)合物使機(jī)體免受循環(huán)復(fù)合物的損傷等生理作用。病理性RF 則具有致病作用, 使RA 患者病情活動(dòng)、關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞、出現(xiàn)壞死性血管炎和類風(fēng)濕結(jié)節(jié)等。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率女性高于男性，女性是男性的2～3倍；歐美國家的發(fā)病率明顯高于國人。
RF 最初由Rose 和Waller（1984 年）在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者血清中發(fā)現(xiàn)。有研究表明RF 陽性率在正常人中只有2%，在老年人中是5%，而在RA 患者體內(nèi)可高達(dá)80%，因此普遍認(rèn)為RF 是RA 患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最有診斷價(jià)值的自身抗體，RA 患者的RF 越高，病越嚴(yán)重。它可以和自體、異體或異種的天然或變性的IgG結(jié)合, 有IgG、IgM、IgA、IgE和IgD多種抗體類型RF,主要存在于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清和關(guān)節(jié)液中。RA是一個(gè)累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性炎癥性疾病，是造成患者喪失勞動(dòng)力和致殘的主要原因之一。目前對RA的診斷主要依靠臨床癥狀和血清學(xué)檢查，RF 是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診治中最常用的一個(gè)臨床檢測指標(biāo)。
IgM 類RF的含量與RA的活動(dòng)性無密切關(guān)系；IgG類RF的含量與RA患者的滑膜炎、血管炎和關(guān)節(jié)外癥狀密切相關(guān)。IgA類RF見于RA、硬皮病、Felty 綜合征和SLE，是RA臨床活動(dòng)的一個(gè)指標(biāo)。IgD類RF研究甚少。IgE類RF除RA患者外，也見于Felty綜合征和青年型RA。在RA患者，高效價(jià)的RF存在并伴有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)功能受限時(shí)，常提示預(yù)后不良。在非類風(fēng)濕患者中，RF的陽性率隨年齡的增加而增加，但這些人以后發(fā)生RA者極少。
臨床檢測類風(fēng)濕因子IgG的主要方法為酶聯(lián)免疫吸附法，但該方法存在著下述的不足之處：
（1） 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應(yīng)容器，在使用時(shí)只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進(jìn)行獨(dú)立的、單人份的檢測；
（2） 定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時(shí)都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；
（3） 缺少對檢測信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識(shí)才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；
（4） 檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；
（5） 檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯(cuò)，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；
（6） 在檢測項(xiàng)目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項(xiàng)目數(shù)×48/96人份，如果需要檢測10 個(gè)項(xiàng)目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10 個(gè)不同的項(xiàng)目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
目前類風(fēng)濕因子IgG檢測技術(shù)存在以下缺點(diǎn)：檢測成本高、檢測靈敏度低、檢測線性范圍窄、重現(xiàn)性低、不能定量、操作復(fù)雜等。
本發(fā)明正是為了克服以上所述缺點(diǎn)，公開了一種檢測成本低、靈敏度高、檢測線性范圍廣、重現(xiàn)性高、可以定量、操作簡單的類風(fēng)濕因子IgG試劑盒及其制備方法。本發(fā)明首先制備化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，主要包括：類風(fēng)濕因子IgG單克隆抗體包被的磁顆粒、羊抗人IgG標(biāo)記的吖啶酯以及類風(fēng)濕因子IgG定標(biāo)品；然后利用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對定標(biāo)品進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置于電腦軟件，測試實(shí)際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計(jì)算樣本濃度；最后對類風(fēng)濕因子IgG全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行性能（靈敏度、線性、精密度、干擾性）的評價(jià)。
本發(fā)明與目前技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明選擇吖啶酯作為標(biāo)記材料，并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學(xué)發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學(xué)發(fā)光相比，該反應(yīng)不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；
2、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測靈敏度高，能夠達(dá)到0.7 AU/mL，相比其它的類風(fēng)濕因子IgG檢測方法靈敏度至少提高了5倍；
3、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達(dá)到4-240 AU/mL，其它的類風(fēng)濕因子IgG化學(xué)發(fā)檢測方法的檢線性范圍為10-200 AU/mL；
4、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復(fù)性高，批內(nèi)及批間差均在5%以內(nèi)，這是其它化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達(dá)到的；
5、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；
6、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。
附圖說明
圖1為實(shí)施例3得到的抗Jo-1抗體IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：類風(fēng)濕因子IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒制備方法
（1）類風(fēng)濕因子IgG單克隆抗體包被的納米磁珠制備：
取50mg羧基化的磁微粒（粒徑為0.05-1um）懸浮液，磁分離去上清，用0.02 M，pH為5.5 MES緩沖液重懸，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5 mg 類風(fēng)濕因子IgG單克隆抗體，室溫下混懸2-10 h，磁分離，去除上清，用含2% BSA 的0.1 M pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到類風(fēng)濕因子IgG單克隆抗體包被的磁顆粒，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（2）羊抗人IgG標(biāo)記的吖啶酯的制備：
取50 uL 25mg/mL的羊抗人IgG，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混勻，室溫下避光反應(yīng)，1-2 h后取出，用2 mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進(jìn)行處理，最后加入得到的羊抗人IgG標(biāo)記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到羊抗人IgG標(biāo)記的吖啶酯，每瓶5 mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（3）類風(fēng)濕因子IgG定標(biāo)品的制備：
用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）將類風(fēng)濕因子IgG配置成濃度為0.0 AU/mL、5.2 AU/mL、20.8 AU/mL、50.5 AU/mL、102.2 AU/mL、299.2 AU/mL，每瓶0.5 mL分裝，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(4)化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入80uL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的雙氧水(H2O2)、1.0克疊氮化鈉、1.5克吐溫20，搖勻后避光存放。
(5)化學(xué)發(fā)光激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入0.6克氫氧化鈉、0.5克PC300、0.5g疊氮化鈉、1.5克Triton 405，搖勻后避光存放。
實(shí)施例2：類風(fēng)濕因子IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法：
本發(fā)明以全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，本發(fā)明的方法學(xué)模式為間接法，即儀器依次加入5 uL的樣品（1:20稀釋）、50 uL的類風(fēng)濕因子IgG單克隆抗體包被的磁顆粒反應(yīng)10 min后，清洗，加入100 uL的羊抗人IgG標(biāo)記的吖啶酯，反應(yīng)10 min后，進(jìn)行磁分離，儀器將反應(yīng)混合物送入暗室，依次加入50uL化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液、50uL化學(xué)發(fā)光激發(fā)液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，最后記錄發(fā)光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測樣品的 類風(fēng)濕因子IgG含量。
實(shí)施例3：類風(fēng)濕因子IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒性能評價(jià)
檢測曲線見附圖1。
靈敏度的檢測：
參照CLSI EP17-A 文件推薦實(shí)驗(yàn)方案，計(jì)算類風(fēng)濕因子IgG化學(xué)發(fā)光免疫層析試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為0.7 AU/ mL。
線性的檢測：
對濃度為5.2 AU/mL、20.8 AU/mL、50.5 AU/mL、102.2 AU/mL、299.2 AU/mL標(biāo)準(zhǔn)品做線性分析，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，r=0.9996，另外，該試劑盒對類風(fēng)濕因子IgG樣品檢測的線性范圍為4-240 AU/mL。
精密度測定：
取濃度為42.5 AU/mL及202.4 AU/mL兩個(gè)類風(fēng)濕因子IgG樣品，每個(gè)樣本每個(gè)濃度各做3個(gè)平行，用三批試劑盒進(jìn)行檢測，計(jì)算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5%。
干擾性實(shí)驗(yàn)：
取混合血清分別添加干擾物包括： 結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照 1: 20 進(jìn)行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計(jì)算二者之間的偏差，以 ±10%為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達(dá)到 NCCLS 的文件標(biāo)準(zhǔn)，可用于臨床實(shí)驗(yàn)室類風(fēng)濕因子IgG狀況的準(zhǔn)確評估。
實(shí)施例4:類風(fēng)濕因子IgG化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的靈敏度對比實(shí)驗(yàn)
分別用化學(xué)發(fā)光檢測方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法對濃度為0 AU/mL的校準(zhǔn)品或樣本稀釋液為樣本進(jìn)行檢測，重復(fù)測定20次，得出20次測量結(jié)果的RLU值（相對發(fā)光值），計(jì)算其平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），得出M+2SD，將該發(fā)光值代入校準(zhǔn)曲線計(jì)算得到相應(yīng)的濃度值。采用化學(xué)發(fā)光檢測方法得到的濃度值為0.7 AU/mL，相對于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法最低檢測限3.8 AU/mL，提高了約5倍。