專(zhuān)利名稱(chēng)：經(jīng)修飾的因子ix的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尤其是用于對(duì)人施用的、特別是用于治療的多肽。所述的多肽是經(jīng)修飾的多肽，其中所述的修飾使得上述多肽在施用于人體時(shí)引起免疫應(yīng)答的傾向減弱。本發(fā)明特別涉及對(duì)人因子IX的修飾，該修飾使得體內(nèi)使用時(shí)這些人因子IX蛋白基本上無(wú)免疫原性，或比任一未經(jīng)修飾的相應(yīng)蛋白的免疫原性低。
背景技術(shù)：
有許多例子表明治療蛋白的效率受限于針對(duì)所述治療蛋白的干擾性免疫反應(yīng)。已有若干種小鼠單克隆抗體表現(xiàn)出治療多種人類(lèi)疾病的前景，但在某些情況下由于誘導(dǎo)出相當(dāng)程度的人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答而未能成功應(yīng)用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對(duì)于單克隆抗體，已開(kāi)發(fā)了多種技術(shù)以試圖減弱HAMA應(yīng)答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。這些重組DNA方法通常是減少最終的抗體構(gòu)建體中小鼠的遺傳信息，同時(shí)增加最終構(gòu)建體中人的遺傳信息。盡管如此，在許多情況下，所得的“人源化”抗體仍然引起患者的免疫應(yīng)答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420]。
抗體不是唯一一類(lèi)作為治療劑施用的可引起免疫應(yīng)答的多肽分子。即使是人源的并在人與人之間具有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)仍可在人體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。明顯的實(shí)例包括粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的治療性應(yīng)用(Wadhwa，M.等人(1999)臨床癌研究(Clin.Cancer Res.)51353-1361)和干擾素α2的治療性應(yīng)用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New Engl.J.Med.)3181409-1413)。在這些人蛋白具有免疫原性的情況下，可能發(fā)生了對(duì)這些蛋白的免疫耐受的破壞，否則對(duì)這些蛋白的免疫耐受將在這些受試者體內(nèi)運(yùn)行。
當(dāng)人蛋白被作為替代治療，例如在蛋白的組成性缺乏如血友病A、血友病B、高歇氏病(Gauchers disease)和許多其他疾病的遺傳性疾病中，情況就不同了。在這些情況下，治療學(xué)替代蛋白可能一開(kāi)始就作為外來(lái)分子而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且當(dāng)個(gè)體能夠產(chǎn)生針對(duì)該治療劑的免疫應(yīng)答時(shí)，該治療的功效將大打折扣。
不管該蛋白治療劑被宿主免疫系統(tǒng)視作外來(lái)分子還是本來(lái)存在的對(duì)該分子的耐受被克服了，對(duì)該蛋白的免疫反應(yīng)的機(jī)理是相同的。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的主要因素是在蛋白中存在可經(jīng)由MHC II類(lèi)分子的呈遞作用激活T-細(xì)胞活性的肽(即所謂的T-細(xì)胞表位)。此類(lèi)T-細(xì)胞表位通常定義為任何能夠與MHC II類(lèi)分子結(jié)合的氨基酸殘基序列。隱含地，″T-細(xì)胞表位″是指當(dāng)其與MHC分子結(jié)合時(shí)可被T-細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別的表位，并且至少原則上，這種表位可以通過(guò)與TCR相互作用而激活這些T-細(xì)胞以促進(jìn)T-細(xì)胞應(yīng)答。
MHC II類(lèi)分子為一組在T輔助細(xì)胞的選擇和活化中起中心作用的高度多態(tài)性蛋白質(zhì)。人類(lèi)白細(xì)胞抗原群DR(HLA-DR)為該組蛋白質(zhì)的主要同種型，但是，同種型HLA-DQ和HLA-DP行使相類(lèi)似的作用。人群中的每一個(gè)體具有二至四個(gè)DR等位基因，兩個(gè)DQ和兩個(gè)DP等位基因。已解析了許多DR分子的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)具有一些可結(jié)合肽的疏水殘基(口袋殘基)的疏水口袋的敞口肽結(jié)合溝[Brown等人，自然(Nature)(1993)36433；Stern等人(1994)自然(Nature)368215]。確定II類(lèi)分子的不同同種異型的多態(tài)性促成了肽結(jié)合溝內(nèi)用于結(jié)合肽的不同表面的大量多樣性，并在群體水平上確保了在識(shí)別外源蛋白質(zhì)并引起對(duì)病原生物體的免疫應(yīng)答的能力方面有最大的靈活性。
針對(duì)治療性蛋白的免疫應(yīng)答通過(guò)MHC II類(lèi)肽呈遞途徑進(jìn)行。其間外來(lái)蛋白經(jīng)吞噬和加工后與DR、DQ或DP型MHC II類(lèi)分子結(jié)合以進(jìn)行呈遞。MHC II類(lèi)分子由專(zhuān)門(mén)抗原呈遞細(xì)胞(APC)如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等表達(dá)。通過(guò)MHC II類(lèi)肽復(fù)合體與T細(xì)胞表面的關(guān)聯(lián)性T-細(xì)胞受體的相互作用，及與某些其他共受體，如CD4分子的交聯(lián)結(jié)合可誘導(dǎo)T-細(xì)胞進(jìn)入激活狀態(tài)。上述激活作用可導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放，進(jìn)一步激活其他淋巴細(xì)胞如B細(xì)胞產(chǎn)生抗體或激活T殺傷細(xì)胞形成完整的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
T細(xì)胞表位的鑒定是消除表位的第一步，然而，本領(lǐng)域中少有將表位鑒定和表位去除整合為一個(gè)方案的清楚的例子。因此，WO98/52976和WO00/34317中公開(kāi)了鑒定具有與人MHC II類(lèi)DR同種異型亞群結(jié)合的潛在能力的多肽序列的計(jì)算機(jī)穿線方法(computational threadingapproaches)。這些教導(dǎo)中，利用目的蛋白中合理的氨基酸置換除去預(yù)測(cè)的T細(xì)胞表位。然而，在該方案和其他基于計(jì)算的表位鑒定方法[Godkin，A.J.等人(1998)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)161850-858；Stumiolo，T.等人(1999)自然生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.) 17555-561]中，預(yù)測(cè)的能夠結(jié)合MHC II類(lèi)分子的肽可能不會(huì)在所有情況下(尤其是在體內(nèi)由于加工途徑或其他現(xiàn)象)都起T細(xì)胞表位的作用。
同樣，例如用限定的MHC同種異型B細(xì)胞系作為MHC II類(lèi)結(jié)合表面的來(lái)源以測(cè)量合成肽結(jié)合MHC II類(lèi)分子的能力的體外方法可以應(yīng)用于MHC II類(lèi)配體的鑒定[Marshall K.W.等人(1994)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1524946-4956；O′Sullivan等人(1990)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1451799-1808；Robadey C.等人(1997)免疫學(xué)雜志(J.Immunol)1593238-3246]。然而，這些技術(shù)不適于篩選各種MHC同種異型的多種潛在表位，也不能確定結(jié)合肽能夠起T細(xì)胞表位的作用。
最近利用重組MHC分子與合成肽的可溶性復(fù)合體的技術(shù)已經(jīng)得到應(yīng)用[Kern，F(xiàn).等人(1998)自然醫(yī)藥(Nature Medicine)4975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫學(xué)趨勢(shì)(TRENDS in Immunology)22583-588]。這些試劑和方法用于鑒定人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物受試者的外周血樣中能結(jié)合特定MHC-肽復(fù)合物的T細(xì)胞克隆的存在，但是這些試劑和方法不適于篩選各種MHC同種異型的多種潛在表位。
T細(xì)胞活化的生物學(xué)測(cè)定提供了一個(gè)解讀試驗(yàn)肽/蛋白序列引起免疫應(yīng)答的能力的實(shí)用選擇。該類(lèi)方法的例子包括Petra等人用對(duì)細(xì)菌蛋白葡萄球菌激酶的T細(xì)胞增殖進(jìn)行測(cè)定，然后用合成肽刺激T細(xì)胞系的表位作圖[Petra，A.M.等人(2002)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)168155-161]。類(lèi)似地，使用破傷風(fēng)毒素蛋白的合成肽進(jìn)行T細(xì)胞增殖測(cè)定導(dǎo)致明確了該毒素免疫顯性的表位區(qū)[Reece J.C.等人(1993)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1516175-6184]。WO99/53038公開(kāi)了一種方法，該方法利用分離的人免疫細(xì)胞亞型，促進(jìn)它們的體外分化，在合成的目的肽存在時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞，并測(cè)定培養(yǎng)的T細(xì)胞中任何誘導(dǎo)的增殖來(lái)確定受試蛋白的T細(xì)胞表位。同樣的技術(shù)也被Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)免疫治療雜志(J.Immunotherapy)23654-660]描述過(guò)，在這兩個(gè)例子中，該方法都用于檢測(cè)細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶的T細(xì)胞表位。這種技術(shù)需要小心應(yīng)用細(xì)胞分離技術(shù)和補(bǔ)充多種細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)基以得到所需的免疫細(xì)胞亞型(樹(shù)突狀細(xì)胞、CD4+和/或CD8+T細(xì)胞)，并且無(wú)助于使用多種供體樣品的快通量篩選。
根據(jù)上述描述，由此可能期望鑒定、去除或至少減少給定的原則上具有治療價(jià)值但原本具有免疫原性的肽、多肽或蛋白中的T-細(xì)胞表位。人因子IX(這里簡(jiǎn)寫(xiě)為FIX)是這些有治療價(jià)值的分子之一，其是人體中血液凝固途徑的關(guān)鍵組分。
FIX為維生素K依賴(lài)的血漿蛋白，其在鈣離子、磷脂和因子VIIIa存在下通過(guò)將因子X(jué)轉(zhuǎn)化為其活性形式而參與血液凝固的固有途徑。FIX的主要催化能力是作為特異的絲氨酸蛋白酶對(duì)因子X(jué)中特定的精氨酸-異亮氨酸鍵起作用。通過(guò)因子X(jué)Ia活化FIX，所述因子X(jué)Ia從FIX切除活性肽而產(chǎn)生活化的FIX，其包含由一個(gè)或多個(gè)二硫鍵連接的兩條鏈。FIX的缺乏引起退行性X-連鎖的血友病B。
本發(fā)明涉及人凝血因子IX(FIX)并涉及含有前肽(粗體)和激活肽(下劃線)的FIX蛋白分泌形式的氨基酸序列，以單字母代碼描述如下TVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT本發(fā)明的一個(gè)特別的目的是提供經(jīng)修飾的FIX蛋白，其中通過(guò)減少潛在的T細(xì)胞表位數(shù)而改變免疫特性。
其他人已提供了FIX分子[US5,171,569；EP0195592；EP0430930]及其重組產(chǎn)生和純化的方案[US5,714,583；US4,770,999]，但是這些教導(dǎo)沒(méi)有說(shuō)明T細(xì)胞表位對(duì)該蛋白免疫原性的重要性，根據(jù)本發(fā)明的方案不認(rèn)為這些教導(dǎo)以特異性或受控制的方式直接影響所述特性。
非常希望提供具有減少或者沒(méi)有可能在人類(lèi)受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的FIX。
發(fā)明概述和描述本發(fā)明提供了修飾形式的FIX，其中，通過(guò)減少或去除大量潛在的T-細(xì)胞表位的方式對(duì)該因子的免疫學(xué)特性進(jìn)行修飾。
本發(fā)明公開(kāi)了在FIX一級(jí)序列內(nèi)鑒定到的由于具有與MHC II類(lèi)分子結(jié)合的可能性而是潛在T-細(xì)胞表位的序列。該公開(kāi)尤其涉及本文上面所給的人FIX蛋白序列，其含有433個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明公開(kāi)了在人中具免疫原性的FIX一級(jí)序列的主要區(qū)域，因此，本發(fā)明提供了對(duì)這些序列進(jìn)行修飾以消除或者降低這些位點(diǎn)的免疫原性效力所需的關(guān)鍵信息。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含有免疫原性區(qū)的合成肽可以在藥物組合物中提供以促進(jìn)對(duì)整個(gè)分子的耐受原應(yīng)答。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的在表位區(qū)內(nèi)修飾的FIX分子可以用于藥物組合物。
總之，本發(fā)明涉及下述內(nèi)容●一種經(jīng)修飾的分子，其具有FIX的生物學(xué)活性，且當(dāng)其在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)基本上無(wú)免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物學(xué)活性但未經(jīng)修飾的分子；●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過(guò)從原始的未經(jīng)修飾的分子中去除一個(gè)或多個(gè)T-細(xì)胞表位而實(shí)現(xiàn)的；●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過(guò)減少能與來(lái)自所述分子的肽相結(jié)合的MHC同種異型的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的；●如上所述的分子，其中，去除了一個(gè)T-細(xì)胞表位；●如上所述的分子，其中，所述原本存在的T-細(xì)胞表位是MHC II類(lèi)配體或通過(guò)呈遞在II類(lèi)分子上后有刺激或結(jié)合T-細(xì)胞的能力的肽序列；●如上所述的分子，其中該肽序列選自如表1中所示的肽序列；●如上所述的分子，其中在任何原本存在的T細(xì)胞表位中1-9個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選地1個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了改變；●如上所述的分子，其中，氨基酸殘基的改變?yōu)樵谔囟ㄎ稽c(diǎn)處用另外的氨基酸殘基替代原本存在的氨基酸殘基、向原本存在的氨基酸殘基添加另外的氨基酸殘基或?qū)⒃敬嬖诘陌被釟埢笔В弧袢缟纤龅姆肿?，其中，按?所示進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替代；●如上所述的分子，其中(額外地)如表3中所示進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替代，以減少能夠結(jié)合源自該分子的肽的MHC同種異型的數(shù)目；●如上所述的分子，其中，如果必要，一般可通過(guò)替代、添加或缺失特定氨基酸進(jìn)行額外的進(jìn)一步改變，以恢復(fù)所述分子的生物學(xué)活性；●如上所述的FIX分子，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代在相應(yīng)于表2或表3中特定的任何氨基酸位置進(jìn)行；●如上所述的FIX分子，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代在相應(yīng)于表2或表3中特定的任何氨基酸位置進(jìn)行，但是排除任何那些從血友病B突變數(shù)據(jù)庫(kù)已知的與功能蛋白不匹配的替代；●藥物組合物，其包含具有結(jié)合MHC II類(lèi)活性的上面的肽或修飾肽的任何一種；●DNA序列或分子，其編碼如上或如下所定義的任何一種所述特異修飾的分子；●藥物組合物，其包含如上述和/或權(quán)利要求中定義的具有FIX生物學(xué)活性的經(jīng)修飾分子，并可任選地包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑；●用于制備具有FIX生物學(xué)活性的修飾分子的方法，所述修飾分子為在以上引用的權(quán)利要求的任一項(xiàng)中所定義的修飾分子，所述方法包括以下步驟(i)確定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通過(guò)任意方法，包括利用體外或硅片上(in silico)的技術(shù)或生物學(xué)試驗(yàn)確定所述肽與MHC分子的結(jié)合，由此鑒定所述蛋白的氨基酸序列中潛在的一個(gè)或多個(gè)T-細(xì)胞表位；(iii)設(shè)計(jì)新的序列變體，其中，經(jīng)鑒定的潛在T-細(xì)胞表位內(nèi)有一個(gè)或多個(gè)氨基酸經(jīng)過(guò)修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細(xì)胞表位的活性，這一效果可由體外或硅片上(in silico)的技術(shù)或生物學(xué)試驗(yàn)通過(guò)所述肽與MHC分子的結(jié)合來(lái)確定；(iv)通過(guò)重組DNA技術(shù)構(gòu)建所述序列變體，并檢測(cè)所述的變體以便鑒定一個(gè)或多個(gè)具有所需性質(zhì)的變體；和(v)任選地重復(fù)步驟(ii)-(iv)；●如上所述的方法，其中步驟(iii)是通過(guò)在任何原本存在的T-細(xì)胞表位中替代、添加或缺失1-9個(gè)氨基酸殘基來(lái)進(jìn)行的；●如上所述的方法，其中，所述的改變是參照同源蛋白質(zhì)序列和/或硅片上(in silico)建模技術(shù)進(jìn)行的；●如上所述的方法，其中以上步驟(ii)是通過(guò)下述步驟進(jìn)行的(a)選擇具有已知氨基酸殘基序列的肽的一個(gè)區(qū)域；(b)然后由所選擇的區(qū)域中順序抽取預(yù)定統(tǒng)一大小且至少由3個(gè)氨基酸殘基組成的重疊氨基酸殘基片段；(c)通過(guò)對(duì)存在于抽樣氨基酸殘基片段中的每個(gè)疏水氨基酸殘基側(cè)鏈賦值求和，計(jì)算每一抽樣片段的MHC II類(lèi)分子結(jié)合分值；和(d)根據(jù)計(jì)算出的該片段的MHC II類(lèi)分子結(jié)合分值鑒定至少一個(gè)適于修飾的片段，以在基本上不減弱所述肽的治療功效的前提下改變肽的整體MHCII類(lèi)結(jié)合分值；步驟(c)優(yōu)選地通過(guò)下述步驟利用經(jīng)改進(jìn)而包含了12-6范德華配體-蛋白能量排斥項(xiàng)和配體構(gòu)象能量項(xiàng)的Bhm評(píng)分函數(shù)(scoringfunction)進(jìn)行，所述步驟為(1)提供MHC II類(lèi)分子模型第一數(shù)據(jù)庫(kù)；(2)提供所述MHC II類(lèi)分子模型的容許肽主鏈(allowed peptide backbone)的第二數(shù)據(jù)庫(kù)；(3)從第一數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選模型；(4)從第二數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選容許肽主鏈；(5)鑒定在每個(gè)抽樣片段中存在的氨基酸殘基側(cè)鏈；(6)確定存在于每個(gè)抽樣片段中的所有側(cè)鏈的結(jié)合親和性值；以及對(duì)每一所述模型和每一所述主鏈重復(fù)步驟(1)到(5)；●選自表1的具有潛在的MHC II類(lèi)結(jié)合活性且由未經(jīng)修飾的FIX產(chǎn)生的13聚體(mer)T-細(xì)胞表位肽，及其在制備在體內(nèi)使用時(shí)基本上沒(méi)有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物學(xué)活性的任何未修飾分子的FIX中的用途；●由上述的13mer T-細(xì)胞表位肽中的至少9個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成的肽序列，及其在制備在體內(nèi)使用時(shí)基本上沒(méi)有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物學(xué)活性的任何未修飾分子的FIX中的用途；●在生物學(xué)T細(xì)胞測(cè)定中使用一組合成肽以對(duì)人FIX的免疫原性區(qū)作圖；●在生物學(xué)T細(xì)胞測(cè)定中使用一組FIX蛋白變體以選擇顯示體外最小免疫原性的變體；●在生物學(xué)T細(xì)胞測(cè)定中使用一組合成肽以選擇顯示體外最小免疫原性的肽序列；●使用T細(xì)胞刺激的生物學(xué)分析以選擇在幼稚T細(xì)胞測(cè)定中刺激指數(shù)小于2.0、優(yōu)選小于1.8的蛋白變體；
●用分離自健康供體的PBMC構(gòu)建FIX蛋白的T細(xì)胞表位圖和包括下面步驟的篩選方法i)用合成肽或者完整蛋白免疫原進(jìn)行體外抗原接觸，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)7天；ii)加入IL-2并培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)3天；iii)加入接觸過(guò)抗原的T細(xì)胞到自體照射的PBMC中并且用抗原再次攻擊，培養(yǎng)時(shí)間為4天和iv)通過(guò)任何合適的方法測(cè)量增殖指數(shù)；●在幼稚T細(xì)胞測(cè)定中能夠引起刺激指數(shù)大于1.8、優(yōu)選大于2.0的FIX衍生肽序列；●在幼稚T細(xì)胞測(cè)定中刺激指數(shù)大于1.8、優(yōu)選大于2.0的FIX衍生肽序列，其中肽被最小程度地修飾并在幼稚T細(xì)胞測(cè)定中檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其刺激指數(shù)小于2.0；●FIX衍生肽序列和野生型蛋白序列具有100％的氨基酸同一性，并且能夠在T細(xì)胞測(cè)定中引起的刺激指數(shù)為1.8或者更大、優(yōu)選大于2.0；●如上所述的FIX肽序列，其被修飾而和野生型蛋白序列的氨基酸同一性小于100％，并且在T細(xì)胞測(cè)定中引起的刺激指數(shù)小于2.0；●一種含有經(jīng)修飾的肽序列的FIX分子，當(dāng)該修飾的肽序列單獨(dú)測(cè)試時(shí)，其在T細(xì)胞測(cè)定中引起的刺激指數(shù)小于2.0；●一種含有經(jīng)修飾的FIX分子，該修飾使得在T細(xì)胞測(cè)定中測(cè)試時(shí)引起比未修飾的蛋白分子降低的刺激指數(shù)；●一種FIX分子，其中用T細(xì)胞測(cè)定對(duì)免疫原性區(qū)進(jìn)行了作圖，然后對(duì)其進(jìn)行修飾，使得在T細(xì)胞測(cè)定中重新試驗(yàn)時(shí)，修飾的蛋白引起的刺激指數(shù)比親本(未修飾的)分子小、最優(yōu)選小于2.0；●一種FIX分子，其中用T細(xì)胞測(cè)定對(duì)免疫原性區(qū)進(jìn)行作圖，T細(xì)胞測(cè)定利用來(lái)自血友病B病人的細(xì)胞，然后對(duì)免疫原性區(qū)進(jìn)行修飾，使得在T細(xì)胞測(cè)定中重新試驗(yàn)時(shí)，該修飾蛋白引起的刺激指數(shù)小于親本(未修飾的)分子所引起的刺激指數(shù)。
術(shù)語(yǔ)″T細(xì)胞表位″根據(jù)本發(fā)明的理解是指這樣的氨基酸序列，其可以結(jié)合MHC II類(lèi)分子、可刺激T細(xì)胞和/或也可在與MHC II類(lèi)的復(fù)合體中結(jié)合(不必可測(cè)得地活化)T細(xì)胞。
此處及后附權(quán)利要求中所用的術(shù)語(yǔ)“肽”是指包含兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的化合物。氨基酸之間通過(guò)肽鍵(定義見(jiàn)下)相連。肽的生物生產(chǎn)中涉及20種不同的天然氨基酸，任意數(shù)量的所述氨基酸可按任意的順序連接形成肽鏈或環(huán)。用于生物生產(chǎn)肽中的天然氨基酸全部具有L-構(gòu)型。可應(yīng)用常規(guī)的合成方法利用L-氨基酸、D-氨基酸或兩種不同構(gòu)型的氨基酸的各種組合制備合成肽。一些肽僅包含少量的氨基酸單元。例如含有不到10個(gè)氨基酸單元的短肽有時(shí)被稱(chēng)作“寡肽”。其他的包含大量氨基酸殘基，例如達(dá)100個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的肽稱(chēng)作“多肽”。習(xí)慣上將含有3個(gè)或3個(gè)以上氨基酸的任何肽鏈看作“多肽”，而通常將“寡肽”視為特定類(lèi)型的短“多肽”。因而本文所提到的“多肽”應(yīng)理解為也包括“寡肽”。而且，所提到的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白。不同的氨基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，多肽的數(shù)量以及可形成的不同蛋白的數(shù)量實(shí)際上是無(wú)限的。“α碳(Cα)”是肽鏈的碳-氫(CH)組分中的碳原子?！皞?cè)鏈”是Cα的側(cè)基，其可包含簡(jiǎn)單的或復(fù)雜的基團(tuán)或部分，且具有與所述肽的大小相比可顯著變化的外形大小。
本發(fā)明可應(yīng)用于與此處公開(kāi)的FIX具有基本上相同的一級(jí)氨基酸序列的任何FIX分子，因此包括利用基因工程手段或其他方法獲得的、可能包含多于或少于433個(gè)氨基酸殘基的FIX分子。本公開(kāi)的許多肽序列和從非人源FIX蛋白得到的肽序列一樣或者至少和那些非人FIX蛋白得到的肽序列基本一樣。這些蛋白序列因此同樣都位于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明是為了克服實(shí)際應(yīng)用中存在的下述問(wèn)題，即將可溶性蛋白引入自體生物中可引發(fā)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生可與所述可溶性蛋白相結(jié)合的宿主抗體。本發(fā)明通過(guò)提供施用于人宿主時(shí)引起免疫應(yīng)答的傾向發(fā)生改變的FIX蛋白以試圖解決這個(gè)問(wèn)題。根據(jù)本文描述的方法，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了含有驅(qū)動(dòng)對(duì)該蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答的關(guān)鍵性T細(xì)胞表位的FIX分子區(qū)域。
本發(fā)明中形成經(jīng)修飾的FIX的總的方法包括下述步驟
(a)確定多肽或其中一部分的氨基酸序列；(b)通過(guò)任意方法，包括利用體外或硅片上(in silico)的技術(shù)或生物學(xué)試驗(yàn)確定所述肽與MHC分子的結(jié)合，由此鑒定所述蛋白的氨基酸序列中潛在的一個(gè)或多個(gè)T-細(xì)胞表位；(c)設(shè)計(jì)新的序列變體，其中，經(jīng)鑒定的潛在T-細(xì)胞表位內(nèi)有一個(gè)或多個(gè)氨基酸經(jīng)過(guò)修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細(xì)胞表位的活性，這一效果可由體外或硅片上(in silico)的技術(shù)或生物學(xué)試驗(yàn)通過(guò)所述肽與MHC分子的結(jié)合來(lái)確定。構(gòu)建此序列變體以避免由所述的序列變體產(chǎn)生新的潛在T-細(xì)胞表位，否則所述的新的潛在T細(xì)胞表位又通過(guò)此種方式進(jìn)行修飾以基本上減弱或消除T-細(xì)胞表位活性；和(d)根據(jù)已知的重組技術(shù)通過(guò)重組DNA技術(shù)構(gòu)建所述序列變體，并檢測(cè)所述的變體以便鑒定一個(gè)或多個(gè)具有所需性質(zhì)的變體。
對(duì)于步驟(b)中對(duì)潛在T-細(xì)胞表位的鑒定可依照本領(lǐng)域已公知的方法進(jìn)行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317中也公開(kāi)了適當(dāng)?shù)姆椒?，并?yōu)選用于鑒定從FIX衍生的肽對(duì)MHC II類(lèi)分子的結(jié)合傾向。
在實(shí)施例1中公開(kāi)了另一種非常有效的通過(guò)計(jì)算鑒定T-細(xì)胞表位的方法，它是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
涉及人FIX蛋白序列的根據(jù)上述方案中步驟(b)的分析結(jié)果列于表1。
表1人FIX中具有潛在人MHC II類(lèi)結(jié)合活性的肽序列TVFLDHENANKIL，VFLDHENANKILN，NKILNRPKRYNSG，KILNRPKRYNSGK，KRYNSGKLEEFVQ，GKLEEFVQGNLER，EEFVQGNLERECM，EFVQGNLERECME，GNLERECMEEKCS，ECMEEKCSFEEAR，CSFEEAREVFENT，REVFENTERTTEF，
EVFENTERTTEFW，TEFWKQYVDGDQC，EFWKQYVDGDQCE，KQYVDGDQCESNP，QYVDGDQCESNPC，PCLNGGSCKDDIN，DDINSYECWCPFG，NSYECWCPFGFEG，ECWCPFGFEGKNC，CPFGFEGKNCELD，F(xiàn)GFEGKNCELDVT，CELDVTCNIKNGR，LDVTCNIKNGRCE，CNIKNGRCEQFCK，EQFCKNSADNKVV，NKVVCSCTEGYRL，KVVCSCTEGYRLA，EGYRLAENQKSCE，YRLAENQKSCEPA，PAVPFPCGRVSVS，VPFPCGRVSVSQT，GRVSVSQTSKLTR，VSVSQTSKLTRAE，SKLTRAEAVFPDV，EAVFPDVDYVNST，AVFPDVDYVNSTE，PDVDYVNSTEAET，VDYVNSTEAETIL，DYVNSTEAETILD，ETILDNITQSTQS，TILDNITQSTQSF，DNITQSTQSFNDF，QSFNDFTRVVGGE，NDFTRVVGGEDAK，TRVVGGEDAKPGQ，RVVGGEDAKPGQF，GQFPWQVVLNGKV，F(xiàn)PWQVVLNGKVDA，WQVVLNGKVDAFC，QVVLNGKVDAFCG，VVLNGKVDAFCGG，GKVDAFCGGSIVN，DAFCGGSIVNEKW，GSIVNEKWIVTAA，SIVNEKWIVTAAH，EKWIVTAAHCVET，KWIVTAAHCVETG，WIVTAAHCVETGV，HCVETGVKITVVA，TGVKITVVAGEHN，VKITVVAGEHNIE，ITVVAGEHNIEET，TVVAGEHNIEETE，HNIEETEHTEQKR，RNVIRIIPHHNYN，NVIRIIPHHNYNA，IRIIPHHNYNAAI，RIIPHHNYNAAIN，HNYNAAINKYNHD，AAINKYNHDIALL，NKYNHDIALLELD，HDIALLELDEPLV，IALLELDEPLVLN，ALLELDEPLVLNS，LELDEPLVLNSYV，EPLVLNSYVTPIC，PLVLNSYVTPICI，LVLNSYVTPICIA，NSYVTPICIADKE，SYVTPICIADKEY，TPICIADKEYTNI，ICIADKEYTNIFL，KEYTNIFLKFGSG，TNIFLKFGSGYVS，NIFLKFGSGYVSG，IFLKFGSGYVSGW，LKFGSGYVSGWGR，SGYVSGWGRVFHK，GYVSGWGRVFHKG，SGWGRVFHKGRSA，GRVFHKGRSALVL，RVFHKGRSALVLQ，SALVLQYLRVPLV，ALVLQYLRVPLVD，LVLQYLRVPLVDR，LQYLRVPLVDRAT，QYLRVPLVDRATC，LRVPLVDRATCLR，VPLVDRATCLRST，PLVDRATCLRSTK，TCLRSTKFTIYNN，TKFTIYNNMFCAG，F(xiàn)TIYNNMFCAGFH，TIYNNMFCAGFHE，NNMFCAGFHEGGR，NMFCAGFHEGGRD，AGFHEGGRDSCQG，PHVTEVEGTSFLT，TEVEGTSFLTGII，TSFLTGIISWGEE，SFLTGIISWGEEC，TGIISWGEECAMK，GIISWGEECAMKG，ISWGEECAMKGKY，CAMKGKYGIYTKV，GKYGIYTKVSRYV，YGIYTKVSRYVNW，GIYTKVSRYVNWI，TKVSRYVNWIKEK，SRYVNWIKEKTKL，RYVNWIKEKTKLT
肽是13肽，氨基酸用單字母代碼表示。
涉及本發(fā)明的經(jīng)修飾分子的根據(jù)上述方案中步驟(c)和(d)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建結(jié)果列于表2和表3。
表2導(dǎo)致人FIX T細(xì)胞表位去除的替代(WT＝野生型殘基)
表3導(dǎo)致相應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)MHC同種異型的潛在T-細(xì)胞表位去除的額外替代
檢測(cè)T細(xì)胞表位的另一個(gè)技術(shù)方法是通過(guò)生物學(xué)T細(xì)胞測(cè)定。對(duì)于檢測(cè)人FIX分子內(nèi)的T細(xì)胞表位，一個(gè)特別有效的方法將是檢驗(yàn)表1中所有或者任何肽序列引起體外培養(yǎng)的人T細(xì)胞的增殖性應(yīng)答的能力。優(yōu)選的方法將是利用血友病B個(gè)體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，實(shí)際上，由于個(gè)體中的遺傳缺陷，F(xiàn)IX蛋白抗原可以成為外來(lái)蛋白。從這種意義上說(shuō)，該蛋白很可能代表體內(nèi)的強(qiáng)抗原，并且本發(fā)明人已經(jīng)建立了現(xiàn)在可從這些個(gè)體的PBMC體外建立多克隆或單克隆T細(xì)胞系，并且這些細(xì)胞系可以用作蛋白中T細(xì)胞表位作圖的有效細(xì)胞系。這可以通過(guò)將T細(xì)胞進(jìn)行幾輪抗原(FIX)體外刺激后立即在IL-2存在下增殖而完成。為了建立多克隆T細(xì)胞系，2-3輪抗原刺激通常足夠產(chǎn)生大量抗原特異性細(xì)胞。這些細(xì)胞被用于篩選大量的合成肽(例如以肽庫(kù)的形式)，并且它們可以低溫保藏以備用。在包括將FIX抗原和PBMC共同孵育7天后的最初一輪完成后，隨后在最優(yōu)選的作為抗原呈遞細(xì)胞的自體經(jīng)照射PBMC存在下，進(jìn)行抗原的再次攻擊。這些輪的抗原選擇進(jìn)行3-4天，并且引入包括用IL-2刺激的增殖階段，可以每3天加入IL-2，總的時(shí)間約9天。最后的再次攻擊用已經(jīng)“靜息”的T細(xì)胞(即沒(méi)有被IL-2刺激已經(jīng)約4天了)進(jìn)行。如前所述使用最優(yōu)選的自體抗原呈遞細(xì)胞，用抗原(例如合成肽或完整蛋白)刺激這些細(xì)胞約4天，隨后測(cè)量增殖應(yīng)答(如果有的話)?？梢杂萌魏畏奖愕姆椒y(cè)量增殖應(yīng)答，一種公知的方法例如是使用3H-胸腺嘧啶摻入測(cè)定。
所以，本文上面所實(shí)施的方法包括產(chǎn)生來(lái)自血友病B個(gè)體的PBMC樣品的T細(xì)胞系或者寡克隆培養(yǎng)物、用合成肽或者完整蛋白制品體外刺激所述細(xì)胞系或培養(yǎng)物、體外測(cè)定單獨(dú)的合成肽或蛋白的增殖效果(如果存在)、產(chǎn)生單個(gè)合成肽或完整蛋白的修飾變體、重新檢驗(yàn)所述修飾肽或蛋白的促進(jìn)T細(xì)胞系或培養(yǎng)物產(chǎn)生顯著增殖性應(yīng)答的后續(xù)能力。
尤其有用的是建立個(gè)體的寡克隆培養(yǎng)物的T細(xì)胞系，在這些個(gè)體中已經(jīng)開(kāi)始了先前的治療性替代治療并且該替代治療已經(jīng)導(dǎo)致對(duì)該治療性蛋白的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。在該方案中，尤其希望利用來(lái)自這類(lèi)所謂的“抑制劑病人(inhibitor patient)”的PBMC樣品，因?yàn)轭A(yù)期有許多這些個(gè)體的T細(xì)胞庫(kù)所定義的FIX蛋白的表位圖將代表能夠進(jìn)行體內(nèi)呈遞的大多數(shù)優(yōu)勢(shì)肽表位。在這種意義上說(shuō)，來(lái)自在先前顯示出免疫應(yīng)答的病人的PBMC構(gòu)成了體內(nèi)接觸治療性蛋白的產(chǎn)物，并且如果來(lái)自這些個(gè)體的PBMC細(xì)胞系原則上是用于體外免疫記憶測(cè)定，它還提供了實(shí)際的好處有能力對(duì)任何給定的刺激肽或蛋白進(jìn)行更大幅度的增殖性應(yīng)答。這降低了進(jìn)行增殖測(cè)定的技術(shù)挑戰(zhàn)，并且在這種情況下可以有機(jī)會(huì)定義免疫顯性表位的可能的序位，如對(duì)于FIX，本文中通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)其含有多種MHC II類(lèi)肽配體并因此含有多種或者復(fù)雜的(即重疊的)T細(xì)胞表位。
盡管從以前用治療性FIX替代治療導(dǎo)致誘導(dǎo)對(duì)FIX產(chǎn)生免疫應(yīng)答的個(gè)體建立寡克隆培養(yǎng)物的T細(xì)胞系是尤其有用的，但是這些個(gè)體不是唯一的可用于對(duì)體內(nèi)相關(guān)的免疫原性表位作圖的細(xì)胞的來(lái)源。也可以使用健康共同的幼稚T細(xì)胞，然而，此時(shí)對(duì)任何個(gè)體肽所得到的刺激指數(shù)的大小較低而需要敏感的測(cè)量從背景中看出該肽或蛋白所誘導(dǎo)的刺激。本發(fā)明人已經(jīng)用熟知的技術(shù)建立了這種測(cè)定的實(shí)施方法，其中等于或大于2.0的刺激指數(shù)可用以測(cè)量誘導(dǎo)的增殖，其中刺激指數(shù)為測(cè)得的受試(多)肽的增殖分值(例如如果用3H-胸腺嘧啶摻入，則為每分鐘的計(jì)數(shù))與沒(méi)用受試(多)肽接觸的細(xì)胞中測(cè)得的增殖分值的商。這種類(lèi)型的合適方法在實(shí)施例2中詳述。
當(dāng)在生物學(xué)測(cè)定中鑒定了多種潛在表位，尤其是發(fā)現(xiàn)許多肽序列能夠刺激T細(xì)胞時(shí)，也可以進(jìn)行該蛋白的結(jié)構(gòu)特征與其通過(guò)MHC II類(lèi)呈遞途徑引起免疫應(yīng)答的傾向的認(rèn)識(shí)。例如，當(dāng)知道了目的蛋白的晶體結(jié)構(gòu)時(shí)，可以分析晶體學(xué)B因子分值以證明該蛋白內(nèi)的結(jié)構(gòu)無(wú)序，該晶體學(xué)B因子分值參數(shù)被認(rèn)為與鄰近生物學(xué)相關(guān)的免疫顯性肽表位相關(guān)[Dai G.等(2001)生物化學(xué)雜志(J.Biological Chem.) 27641913-41920]。當(dāng)在FIX絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和FIX的EGF樣結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)上進(jìn)行這種分析[PDB ID1RFN，Hopfner，K.P.等(1999)結(jié)構(gòu)(Structure)7.989]時(shí)表明很可能在絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域中存在多個(gè)免疫顯性表位，在該結(jié)構(gòu)域的235個(gè)氨基酸殘基中有至少11個(gè)高于B因子平均分值的峰。相反，較小(57個(gè)殘基)的EGF樣結(jié)構(gòu)域顯示出2個(gè)高于B因子平均分值的峰，這表明可能有兩個(gè)生物學(xué)相關(guān)的T細(xì)胞表位位于該結(jié)構(gòu)域。所以，在本發(fā)明的方案中，該數(shù)據(jù)表明在表2和表3所列出的氨基酸替代中，最優(yōu)選的替代包括那些針對(duì)包含在EGF樣結(jié)構(gòu)域的133-161位殘基和分散在整個(gè)絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域但從250位纈氨酸殘基開(kāi)始的殘基的替代。
在實(shí)踐中，將產(chǎn)生許多的變體FIX蛋白并且檢驗(yàn)所需的免疫和功能特征。可以參考血友病B突變的公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)[例如數(shù)據(jù)庫(kù)“http//www.umds.ac.uk/molgen/”]，也可以將在表2和表3中列出的已知為血友病B的致病突變排除于分析之外，或者為了恢復(fù)該蛋白的功能活性，可以選擇地進(jìn)行補(bǔ)償突變。在一切情況下，最優(yōu)選通過(guò)熟知的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)變體蛋白，雖然可以考慮包括FIX片段的化學(xué)合成的其他方法。
本發(fā)明涉及這樣的FIX類(lèi)似物，其中至少一個(gè)氨基酸殘基的替代在導(dǎo)致該蛋白的活性顯著降低或一個(gè)或多個(gè)潛在T細(xì)胞表位被除去的位置處進(jìn)行。最優(yōu)選提供FIX分子，其中氨基酸修飾(例如替代)在親本分子的免疫原性最強(qiáng)區(qū)進(jìn)行。本發(fā)明主要的優(yōu)選實(shí)施方案包括這樣的FIX分子，其中改變?nèi)魏蜯HC II類(lèi)配體以消除肽對(duì)MHC同種異型的結(jié)合或者減少該肽結(jié)合MHC同種異型的數(shù)目。
為了除去T細(xì)胞表位，優(yōu)選在所預(yù)測(cè)的肽序列中合適的位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸替代以完成T細(xì)胞表位活性的減小或者消除。實(shí)踐中，合適的位點(diǎn)優(yōu)選等同于在MHC II類(lèi)結(jié)合溝所提供的口袋之一中結(jié)合的氨基酸殘基。
最優(yōu)選的是在所述肽的稱(chēng)作P1或P1錨的位置改變?cè)诹芽p的第一口袋內(nèi)的結(jié)合。公認(rèn)地，肽的P1錨殘基和MHC II類(lèi)結(jié)合溝的第一口袋之間的結(jié)合相互作用的質(zhì)量是整個(gè)肽的總結(jié)合親和性的主要決定因素。在所述肽的這一位置的適當(dāng)替代是替代為不易容納到所述口袋中的殘基，例如替代為更親水的殘基。所述肽中處于如下位置的氨基酸殘基也被認(rèn)為是落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述位置為與MHC結(jié)合裂縫的其他口袋區(qū)域結(jié)合的位置。
可以理解，由給定的潛在T-細(xì)胞表位內(nèi)的單一氨基酸替代導(dǎo)致該表位去除的路線是最優(yōu)選的。也可以在單一表位內(nèi)進(jìn)行組合替代，例如，這可能對(duì)于單獨(dú)定義的表位間彼此重疊的情況特別適宜。此外，在給定的表位內(nèi)的單氨基酸替代或在一個(gè)表位內(nèi)的組合氨基酸替代也可以在非對(duì)應(yīng)于MHC II類(lèi)結(jié)合溝的″口袋殘基″的位置，而是在所述肽序列內(nèi)的任意位點(diǎn)上進(jìn)行。替代可參照同源結(jié)構(gòu)或由本領(lǐng)域已知的硅片上(insilico)技術(shù)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)方法進(jìn)行，也可以根據(jù)本發(fā)明分子的已知結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行。所有此類(lèi)替代均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
也可以考慮在上面所鑒定的肽之外進(jìn)行氨基酸替代，特別是與在所列肽內(nèi)進(jìn)行的替代相結(jié)合的情況下。例如可以考慮利用某種改變恢復(fù)變體分子的結(jié)構(gòu)或生物學(xué)活性。這種補(bǔ)償性的改變和在FIX多肽中缺失或添加特定的氨基酸殘基以得到具有所需活性的變體的改變，以及在任何本發(fā)明公開(kāi)的肽中進(jìn)行的改變均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的范圍涉及經(jīng)修飾的FIX，含有上述經(jīng)修飾的FIX蛋白或經(jīng)修飾的FIX蛋白片段的組合物及其相關(guān)的組合物應(yīng)認(rèn)為均落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另一方面，本發(fā)明涉及編碼經(jīng)修飾的FIX實(shí)體的核酸。另一方面本發(fā)明涉及利用經(jīng)修飾的FIX蛋白對(duì)人進(jìn)行治療的方法。
實(shí)施例1有多種因素對(duì)決定蛋白或多肽的總體結(jié)構(gòu)起重要作用。首先是肽鍵，即將氨基酸連接在一起形成鏈的鍵，它是一種共價(jià)鍵。這種鍵是平面結(jié)構(gòu)的，實(shí)質(zhì)上是一種取代的酰胺?！磅０贰敝负?CONH-基團(tuán)的一組有機(jī)化合物中的任何一個(gè)化合物。
連接相鄰氨基酸的Cα的平面肽鍵如下所示 由于O＝C和C-N原子位于一個(gè)相對(duì)剛性的平面中，所以不會(huì)發(fā)生沿這些軸的自由旋轉(zhuǎn)。因此，圖中虛線所示的平面有時(shí)被稱(chēng)作“酰胺”平面或“肽平面”，肽主鏈中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氫(H)原子位于其中。Cα原子位于酰胺平面中相對(duì)的角上。由于肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上不發(fā)生旋轉(zhuǎn)，所以多肽鏈包含一系列連接Cα原子的平面肽鍵。
第二個(gè)對(duì)決定多肽或蛋白的整體結(jié)構(gòu)或構(gòu)象起重要作用的因素是每一酰胺平面繞共有Cα鍵的轉(zhuǎn)角。此后術(shù)語(yǔ)″轉(zhuǎn)角″和″扭轉(zhuǎn)角″是等同的術(shù)語(yǔ)。假定O、C、N和H原子保留在酰胺平面中(這通常是一種正確的假設(shè)，盡管在一些構(gòu)象中這些原子會(huì)輕微的偏移平面)，這些轉(zhuǎn)角確定了N和R多肽主鏈構(gòu)象，即相鄰殘基之間的結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)轉(zhuǎn)角稱(chēng)為φ和Ψ。因此，一套φi和Ψi角(其中，腳標(biāo)i代表多肽鏈中的特定殘基)有效地規(guī)定了多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在文獻(xiàn)中定義了用于確定φ和Ψ角的慣例，即在給定的多肽中酰胺平面形成0度角的參考點(diǎn)，以及哪個(gè)角是φ角，哪個(gè)角是Ψ角的定義。參見(jiàn)Ramachandran等，Adv.Prot.Chem.23283-437(1968)，285-94頁(yè)，這些頁(yè)中的內(nèi)容在此引入作為參考。
本發(fā)明的方法可應(yīng)用于任何蛋白，并部分基于下述發(fā)現(xiàn)，即人MHCII類(lèi)分子結(jié)合溝的主要口袋1錨定位點(diǎn)對(duì)特定氨基酸側(cè)鏈具有設(shè)計(jì)好的特異性。這一口袋的特異性由MHC II類(lèi)分子β鏈第86位的氨基酸的身份來(lái)確定。這一位點(diǎn)位于口袋1的底部并決定可容納于這一口袋中的氨基酸側(cè)鏈的大小。Marshall，K.W.，J.Immunol.，1524946-4956(1994)。如果這一殘基是甘氨酸，則所有的疏水性脂肪族和芳香族氨基酸(疏水性脂肪族氨基酸是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸，芳香族氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容納于所述的口袋中，優(yōu)選芳香族側(cè)鏈。如果這一口袋殘基是纈氨酸，則該氨基酸的側(cè)鏈伸到口袋中并限制了可容納的肽側(cè)鏈的大小，所以只有疏水性脂肪族側(cè)鏈可容納進(jìn)去。因此在氨基酸殘基序列中，無(wú)論哪里發(fā)現(xiàn)了帶有疏水性脂肪族或芳香族側(cè)鏈的氨基酸，即有存在MHC II類(lèi)限制性T-細(xì)胞表位的可能性。但是，如果所述的側(cè)鏈?zhǔn)鞘杷灾咀鍌?cè)鏈，其與T-細(xì)胞表位相關(guān)的可能性約是芳香族側(cè)鏈的兩倍(假定1型口袋近似平均地分布于全球種群中)。
將本發(fā)明具體化的計(jì)算機(jī)方法描繪出肽區(qū)域包含T-細(xì)胞表位的可能性，該方法如下(1)掃描預(yù)定長(zhǎng)度肽片段的一級(jí)序列，并鑒定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族側(cè)鏈。(2)對(duì)疏水性脂肪族側(cè)鏈賦予比芳香族側(cè)鏈高的值；優(yōu)選約兩倍于賦予芳香族側(cè)鏈的值，例如，給疏水性脂肪族側(cè)鏈賦值為2，給芳香族側(cè)鏈賦值為1。(3)將所述肽中的預(yù)定統(tǒng)一長(zhǎng)度的每一重疊氨基酸殘基片段(窗口)中確定存在的值總和起來(lái)，再將某一特定片段(窗口)的總值賦予該片段(窗口)中間位置的某個(gè)單個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選賦予大約處于抽樣片段(窗口)中間點(diǎn)的氨基酸。將這一過(guò)程對(duì)每一抽樣的重疊氨基酸殘基片段(窗口)重復(fù)進(jìn)行。因此，所述肽的每一氨基酸殘基均被賦予了一個(gè)值，該值與T-細(xì)胞表位存在于此特定片段(窗口)中的可能性相關(guān)。(4)用按照上述步驟3中的描述計(jì)算、賦予的值對(duì)被評(píng)估的整個(gè)氨基酸殘基序列的氨基酸坐標(biāo)作圖。(5)序列中具有預(yù)定值(例如該值為1)的所有部分均被認(rèn)為可能包含T細(xì)胞表位，并且在需要時(shí)可進(jìn)行修飾。在這一方面本發(fā)明提供了通用的方法，由此可描述可能包含T-細(xì)胞表位的肽區(qū)域。在這些區(qū)域中對(duì)所述的肽進(jìn)行修飾有可能改變MHC II類(lèi)的結(jié)合特性。
依照本發(fā)明的另一方面，可利用考慮了肽與MHC II等位基因模型之間的相互作用的更復(fù)雜計(jì)算方法來(lái)更精確地預(yù)測(cè)T-細(xì)胞表位。根據(jù)這一方面，對(duì)肽中存在的T細(xì)胞表位的計(jì)算預(yù)測(cè)考慮到基于所有已知MHCII類(lèi)分子的結(jié)構(gòu)構(gòu)建至少42個(gè)MHC II類(lèi)等位基因模型；使用這些模型計(jì)算鑒定T細(xì)胞表位的方法；對(duì)每一模型構(gòu)建肽主鏈文庫(kù)以允許在相關(guān)肽主鏈α碳(Cα)位置具有已知的變異性；在肽和MHC II類(lèi)分子間相互作用關(guān)鍵的位置處，對(duì)與每一模型對(duì)接(dock)的每一主鏈，相對(duì)于20種氨基酸選項(xiàng)中每一種構(gòu)建氨基酸側(cè)鏈構(gòu)象文庫(kù)；以及將這些主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象文庫(kù)與評(píng)分函數(shù)結(jié)合用于選擇與特定MHC II類(lèi)分子對(duì)接的特定肽的最佳主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象并得出該相互作用的結(jié)合分值。
MHC II類(lèi)分子模型可從Brookhaven蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(″PDB″)中的許多類(lèi)似的結(jié)構(gòu)出發(fā)通過(guò)同源建模推導(dǎo)得出。它們可通過(guò)使用引入了模擬退火算法的半自動(dòng)同源建模軟件(Modeller，Sali A. & Blundell TL.，1993.J.Mol Biol 234779-815)并結(jié)合用于能量最小化的CHARMm力場(chǎng)(購(gòu)自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)來(lái)制備。也可以應(yīng)用其他的建模方法。
本發(fā)明的方法與下述的其他計(jì)算方法有著顯著的不同，這些方法在于利用從實(shí)驗(yàn)中得來(lái)的關(guān)于一小組MHC II類(lèi)分子結(jié)合溝中每一位點(diǎn)的每一種氨基酸選項(xiàng)的結(jié)合數(shù)據(jù)文庫(kù)(Marshall，K.W.等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1(3)157-162)(1995)；或利用類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)結(jié)合數(shù)據(jù)以定義所述的溝中特定結(jié)合口袋類(lèi)型的結(jié)合特性(同樣利用相對(duì)小的MHC II類(lèi)分子亞組)然后將這一口袋文庫(kù)中的口袋類(lèi)型進(jìn)行‘混合和匹配’以人工構(gòu)建更“實(shí)際的”MHC II類(lèi)分子(Sturniolo T.等，Nat.Biotech，17(6)555-561(1999)。這兩種現(xiàn)有方法的主要缺陷在于實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和需要合成大量的肽變體造成僅有少量的MHC II類(lèi)分子可通過(guò)實(shí)驗(yàn)掃描。因此第一種已知的方法僅能預(yù)測(cè)少量的MHC II類(lèi)分子。第二種已知的方法還假設(shè)在不同II類(lèi)等位基因的背景下在一個(gè)分子中襯有類(lèi)似氨基酸的口袋將具有相同的結(jié)合特性，故其另外的缺陷在于，僅僅可“實(shí)際地”地構(gòu)建出那些包含口袋文庫(kù)中所包含的口袋的MHC II類(lèi)分子。利用本發(fā)明的建模方法可推導(dǎo)出任意數(shù)量和類(lèi)型的MHC II類(lèi)分子的結(jié)構(gòu)，因此可特異性地選擇等位基因以代表全球種群的特征。此外，掃描的MHC II類(lèi)分子的數(shù)量可通過(guò)構(gòu)建更多的模型而增加而無(wú)需通過(guò)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)獲得額外的數(shù)據(jù)。利用主鏈文庫(kù)使得被掃描的各種肽在與特定的MHC II類(lèi)分子結(jié)合時(shí)其Cα原子位置處可進(jìn)行變化。這也與上述現(xiàn)有技術(shù)中的計(jì)算機(jī)方法不同，在那些方法中依賴(lài)于利用簡(jiǎn)化的肽主鏈來(lái)掃描結(jié)合在特定口袋中的氨基酸。這些簡(jiǎn)化的主鏈不可能代表在“真正的”肽中存在的主鏈構(gòu)象，從而導(dǎo)致對(duì)肽結(jié)合的預(yù)測(cè)不準(zhǔn)確。本發(fā)明的主鏈文庫(kù)是通過(guò)疊加蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中所有與MHC II類(lèi)分子結(jié)合的肽的主鏈，并考慮到位于結(jié)合溝內(nèi)的11個(gè)氨基酸的每個(gè)氨基酸的Cα原子之間的均方根(RMS)差而構(gòu)建的。盡管該文庫(kù)可來(lái)自少量合適的可獲得的小鼠和人的結(jié)構(gòu)(當(dāng)前為13種)，但為了允許存在甚至更大變異的可能性，將每一C″-α位點(diǎn)的RMS數(shù)提高50％。然后確定每一氨基酸的平均Cα位置，圍繞這一點(diǎn)劃一個(gè)球，其半徑等于在該位置的RMS差加50％。該球體代表所有可允許的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸殘基的Cα，等同于結(jié)合溝中11個(gè)殘基的位置2)起運(yùn)作，將所述的球三維網(wǎng)格化，網(wǎng)格內(nèi)的每個(gè)頂點(diǎn)作為該氨基酸的Cα的可能位置。將后續(xù)的酰胺平面(相應(yīng)于與后續(xù)氨基酸的肽鍵)移動(dòng)到這些Cα的每一個(gè)上面，將φ和Ψ角以設(shè)定的間隔逐步地轉(zhuǎn)動(dòng)以便于安置后續(xù)的Cα。如果后續(xù)的Cα落入對(duì)這一Cα而言‘可被允許的位置球’中，則此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外則所得的二肽不能被接受。對(duì)每一后續(xù)Cα位置均重復(fù)這一過(guò)程，使肽從所述的口袋1Cα‘種子’開(kāi)始生長(zhǎng)，直到全部9個(gè)后續(xù)的Cα的位置均根據(jù)之前Cα的所有可能排列確定下來(lái)。然后對(duì)口袋1前的單個(gè)Cα重復(fù)上述步驟1次以上以構(gòu)建定位于結(jié)合溝內(nèi)的主鏈Cα位置文庫(kù)。
生成的主鏈數(shù)目取決于幾種因素‘可被允許的位置球’的大??；對(duì)口袋1位點(diǎn)處′最初的球′網(wǎng)格化的細(xì)度；用于定位后續(xù)Cα的φ和Ψ角逐步旋轉(zhuǎn)的細(xì)度。利用這一程序可以構(gòu)建大的主鏈文庫(kù)。主鏈文庫(kù)越大越可能發(fā)現(xiàn)對(duì)MHC II類(lèi)分子結(jié)合溝內(nèi)的特定肽而言的最適主鏈。鑒于和結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸可能存在沖突，所以不是所有的主鏈均適合于與所有MHC II類(lèi)分子模型‘對(duì)接’(docking)，故對(duì)每個(gè)等位基因建立亞文庫(kù)以包含適合被該等位基因容納的主鏈。利用所述的主鏈文庫(kù)并結(jié)合MHC II類(lèi)分子模型可以構(gòu)建出由與每一容許主鏈對(duì)接的每一MHC II類(lèi)分子結(jié)合溝的每一位點(diǎn)中的每一氨基酸的容許側(cè)鏈構(gòu)象所組成的詳盡數(shù)據(jù)庫(kù)。可以利用簡(jiǎn)單的立體重疊函數(shù)構(gòu)建這一數(shù)據(jù)組，其中，主鏈與MHC II類(lèi)分子對(duì)接，氨基酸側(cè)鏈在所需位置被嫁接到主鏈上。將側(cè)鏈上可旋轉(zhuǎn)的鍵以設(shè)定的間隔逐步旋轉(zhuǎn)，記錄下依賴(lài)于該鍵的原子的最終定位。將所述原子與結(jié)合溝側(cè)鏈原子間的相互作用記錄下來(lái)，根據(jù)下述的標(biāo)準(zhǔn)確定是否接受這些位置如此定位的所有原子的重疊總量不能超過(guò)預(yù)定值。因此，構(gòu)象搜索的嚴(yán)謹(jǐn)度是在鍵的逐步旋轉(zhuǎn)中所用的間隔及對(duì)總重疊的預(yù)定限度的函數(shù)。如果已知特定的口袋是剛性的，則后一值可較小，但若已知口袋側(cè)鏈的位置相對(duì)靈活則嚴(yán)謹(jǐn)度可放松。這樣便可以模擬結(jié)合溝口袋內(nèi)靈活性的變化。針對(duì)與每一MHC II類(lèi)分子對(duì)接后每一主鏈的所有位點(diǎn)上的所有氨基酸重復(fù)這種構(gòu)象搜索以建立詳盡的側(cè)鏈構(gòu)象數(shù)據(jù)庫(kù)。
用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)表達(dá)式評(píng)價(jià)MHC II類(lèi)分子模型與肽配體構(gòu)象的結(jié)合能量，所述的肽配體構(gòu)象需通過(guò)掃描上述的主鏈/側(cè)鏈構(gòu)象大數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)獲得。這樣，通過(guò)對(duì)每一長(zhǎng)度在9-20個(gè)氨基酸范圍內(nèi)變化(盡管對(duì)于每一次掃描長(zhǎng)度是一定的)的可能肽進(jìn)行下述計(jì)算，可以掃描蛋白以搜索潛在的T-細(xì)胞表位選擇MHC II類(lèi)分子及適合于該分子的肽主鏈，將相應(yīng)于所需肽序列的側(cè)鏈移植到其上。對(duì)于氨基酸的每一容許構(gòu)象(由上述數(shù)據(jù)庫(kù)獲得)，收集與主鏈上特定位點(diǎn)的特定側(cè)鏈相關(guān)的原子身份和原子間距數(shù)據(jù)。沿主鏈對(duì)每一側(cè)鏈重復(fù)此過(guò)程，利用評(píng)分函數(shù)推導(dǎo)肽得分。保留該主鏈的最佳得分，對(duì)所選模型的每一容許主鏈重復(fù)該過(guò)程。比較所有容許主鏈的得分，最高的得分被認(rèn)為是該MHC II類(lèi)模型中所需肽的得分。對(duì)每一模型用從掃描的蛋白得到的所有可能肽重復(fù)上述過(guò)程，列出肽相對(duì)于模型的得分。
在本發(fā)明中，用于結(jié)合親和力計(jì)算的每種配體都是選自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配體為來(lái)自已知序列的肽、多肽或蛋白的長(zhǎng)度為約9到20個(gè)氨基酸的選定氨基酸鏈。此后術(shù)語(yǔ)“氨基酸”和“殘基”視為等同的術(shù)語(yǔ)。將移植到選自上述主鏈文庫(kù)的主鏈上的待檢測(cè)肽中的連續(xù)氨基酸形式的配體，通過(guò)肽主鏈上C″-α原子坐標(biāo)定位到來(lái)自MHC II類(lèi)分子模型庫(kù)的MHC II類(lèi)分子的結(jié)合裂縫中，并從容許構(gòu)象的數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇每一側(cè)鏈的容許構(gòu)象。相關(guān)的原子身份和原子間距也可以從這一數(shù)據(jù)庫(kù)獲得并用于計(jì)算肽結(jié)合分?jǐn)?shù)。將對(duì)MHC II類(lèi)結(jié)合口袋具有高親和力的配體作為侯選者標(biāo)記出來(lái)用于定點(diǎn)誘變。在標(biāo)記的配體中(也由此在目的蛋白中)進(jìn)行氨基酸替代，然后用評(píng)分函數(shù)重新測(cè)定以確定使結(jié)合親和力降低到預(yù)定的閾值以下的變化。這些變化即可引入到目的蛋白中以去除T-細(xì)胞表位。
肽配體與MHC II類(lèi)分子結(jié)合溝的結(jié)合涉及非共價(jià)鍵相互作用，其包括但不限于氫鍵、靜電相互作用、疏水(親脂)相互作用和范德華相互作用。它們被包括在下面將詳細(xì)描述的肽評(píng)分函數(shù)中。應(yīng)當(dāng)理解，氫鍵是非共價(jià)鍵，其可在極性或帶電的基團(tuán)之間形成，由被兩個(gè)其他原子共享的氫原子構(gòu)成。氫供體中的氫帶正電荷，而氫受體帶有部分負(fù)電荷。為肽/蛋白相互作用的目的，氫鍵供體可以是連接氫的氮，或連接在氧或氮上的氫。氫鍵受體原子可以是沒(méi)有連接氫的氧、沒(méi)有連接氫并具有一或兩個(gè)連接的氮或僅有一個(gè)連接的硫。某些原子，如連接了氫的氧或亞胺氮(如C＝NH)，既可以是氫受體也可以是氫供體。氫鍵的能量在3-7Kcal/mol，大大強(qiáng)于范德化鍵，但弱于共價(jià)鍵。氫鍵具有高度的方向性，且當(dāng)供體原子、氫原子和受體原子共線時(shí)最強(qiáng)。靜電鍵是在帶有相反電荷的離子對(duì)間形成的，根據(jù)庫(kù)侖定律這種相互作用的強(qiáng)度與原子間距離的平方成反比。離子對(duì)間的最佳距離是約2.8。在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、組氨酸或賴(lài)氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之間形成靜電鍵。該鍵的強(qiáng)度依賴(lài)于電離基團(tuán)的pKa和介質(zhì)的介電常數(shù)，盡管其與氫鍵的強(qiáng)度類(lèi)似。
親脂相互作用是蛋白和肽配體之間發(fā)生的有利疏水-疏水相互作用。這種相互作用通常出現(xiàn)在埋于結(jié)合溝口袋中的肽的疏水性氨基酸側(cè)鏈間，以使它們不暴露在溶劑中。將疏水殘基暴露于溶劑中是非常不利的，因?yàn)橹車(chē)娜軇┓肿訉⒈黄仍诒舜碎g形成氫鍵而形成籠狀結(jié)構(gòu)。所致的熵值降低是非常不利的。親脂性原子可以是既非極性又不是氫受體的硫和非極性的碳原子。
范德華鍵是相距3-4的原子間的非特異性的力。它比氫鍵和靜電鍵弱、特異性低。原子周?chē)碾姾煞植茧S時(shí)間變化，并且在任何瞬間電荷分布均是不對(duì)稱(chēng)的。這種瞬間的電荷不對(duì)稱(chēng)性誘導(dǎo)臨近原子中的類(lèi)似不對(duì)稱(chēng)性。在范德華接觸距離中所導(dǎo)致的原子之間的吸引力達(dá)到最大，而在約1到2處迅速消失。相反，當(dāng)原子間隔的距離小于此接觸距離時(shí)，由于原子外部的電子云重疊使不斷增強(qiáng)的斥力成為主導(dǎo)。盡管與靜電和氫鍵相比，此吸引力相對(duì)較弱(約0.6Kcal/mol)，但所述斥力對(duì)于決定肽配體是否能與蛋白成功結(jié)合可能非常重要。
在一個(gè)實(shí)施方案中，利用Bhm評(píng)分函數(shù)(SCORE1方法)評(píng)估結(jié)合常數(shù)(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)243-256(1994)，該文獻(xiàn)在此全文引入作為參考)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用評(píng)分函數(shù)(SCORE2方法)評(píng)估結(jié)合親和力作為配體含有T-細(xì)胞表位的指示物(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)309-323(1998)，該文獻(xiàn)在此全文引入作為參考)。但是上述文獻(xiàn)中描述的Bhm評(píng)分函數(shù)是用于評(píng)估下述情況中配體對(duì)蛋白的結(jié)合親和力的，即已知所述的配體可成功地與所述蛋白結(jié)合，且蛋白/配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)已解析，這一結(jié)構(gòu)已列于蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(″PDB″)中。因此，利用已知的陽(yáng)性結(jié)合數(shù)據(jù)對(duì)評(píng)分函數(shù)作了發(fā)展。為了區(qū)分陽(yáng)性和陰性的結(jié)合體，需向方程中加入排斥項(xiàng)。此外，可通過(guò)以成對(duì)的方式計(jì)算親脂相互作用，而非利用上述Bhm函數(shù)中基于面積的能量項(xiàng)來(lái)進(jìn)行更理想的結(jié)合能量評(píng)估。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用經(jīng)修飾的Bhm評(píng)分函數(shù)評(píng)估結(jié)合能。在經(jīng)修飾的Bhm評(píng)分函數(shù)中，在評(píng)估蛋白和配體之間的結(jié)合能(ΔGbind)時(shí)考慮了下述參數(shù)由于配體的平移和轉(zhuǎn)動(dòng)熵的整體損失造成的結(jié)合能減低(ΔG0)；理想氫鍵的貢獻(xiàn)(ΔGhb)，其中至少一個(gè)配對(duì)物是中性的；無(wú)擾離子相互作用的貢獻(xiàn)(ΔGionic)；親脂配體原子和親脂受體原子之間的親脂相互作用(ΔGlipo)；由于配體中內(nèi)在自由度的凍結(jié)，即繞每一C-C鍵的旋轉(zhuǎn)自由度降低而造成的結(jié)合能損失(ΔGrot)；蛋白和配體之間相互作用的能量(EVdW)?？紤]到這些項(xiàng)給出等式1(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)其中N是對(duì)于特定項(xiàng)符合的相互作用的數(shù)目，在一個(gè)實(shí)施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常數(shù)，其值分別為5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb項(xiàng)依照等式2計(jì)算Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcsf(ΔR，Δα)是罰函數(shù)，其解決氫鍵自理想情況的巨大偏離，其依照等式3計(jì)算f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)其中如果ΔR＜＝TOL 則f1(ΔR)＝1，或者如果ΔR＜＝0.4+TOL 則f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者如果ΔR＞0.4+TOL則f1(ΔR)＝0并且
如果Δα＜30° 則f2(Δα)＝1，或者如果Δα＜＝80°則f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者如果Δα＞80° 則f2(Δα)＝0TOL是氫鍵鍵長(zhǎng)中所能允許的偏差＝0.25ΔR是H-O/N氫鍵鍵長(zhǎng)與理想值＝1.9的偏差Δα是氫鍵鍵角∠N/O-H..O/N與180°理想值的偏差f(Nneighb)區(qū)分蛋白表面的凹凸部分，并因此賦予口袋中的極性相互作用比蛋白表面的極性相互作用更高的權(quán)重。這一函數(shù)根據(jù)下述等式4計(jì)算f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5Nneighb為蛋白中與任意給定蛋白原子之間的距離小于5的非氫原子的數(shù)量。
Nneighb，0是常數(shù)＝25fpcs是考慮到每氫鍵的極性接觸表面面積的函數(shù)，由此可以區(qū)分強(qiáng)和弱的氫鍵，其值由下述的標(biāo)準(zhǔn)確定當(dāng)Apolar/NHB＜102時(shí)fpcs＝β或當(dāng)Apolar/NHB＞102時(shí)fpcs＝1Apolar是極性蛋白-配體接觸面的大小NHB是氫鍵的數(shù)目β是常數(shù)＝1.2由于假定了相同的幾何相關(guān)性，在實(shí)施經(jīng)修飾的Bhm評(píng)分函數(shù)時(shí)，離子相互作用的貢獻(xiàn)ΔGionic用與上述有關(guān)氫鍵的類(lèi)似方式計(jì)算。
Nlipo項(xiàng)按下述的等式5計(jì)算Nlipo＝∑lLf(rlL)根據(jù)下述標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于所有親脂配體原子l和所有親脂蛋白原子L，計(jì)算f(rlL)當(dāng)rlL＜＝R1時(shí) f(rlL)＝1
當(dāng)R2＜rlL＞R1時(shí) f(flL)＝(rlL-R1)/(R2-R1)當(dāng)rlL＞＝R2時(shí)f(rlL)＝0其中R1＝rlvdw+rLvdw+0.5R2＝R1+3.0rlvdw是原子l的范德華半徑rLvdw是原子L的范德華半徑Nrot項(xiàng)是氨基酸側(cè)鏈中可旋轉(zhuǎn)的鍵的數(shù)目，其被視為無(wú)環(huán)的sp3-sp3及sp3-sp2鍵的數(shù)目。末端-CH3或-NH3的旋轉(zhuǎn)未考慮進(jìn)去。
最終，項(xiàng)Evdw依照如下等式6計(jì)算Evdw＝ε1ε2((r1vdw+r2vdw)12/r12-(r1vdw+r2vdw)6/r6)，其中ε1和ε2是取決于原子身份的常數(shù)r1vdw+r2vdw是范德華原子半徑r是原子對(duì)間的距離。
關(guān)于式6，在一個(gè)實(shí)施方案中，ε1和ε2常數(shù)被賦予如下原子值，分別為C0.245，N0.283，O0.316，S0.316(即分別對(duì)于碳、氮、氧和硫原子)。對(duì)于式5和6，給予范德華半徑如下原子值，分別為C1.85，N1.75，O1.60，S2.00。
應(yīng)當(dāng)理解上述等式中所有預(yù)定的值和給定的常數(shù)都是在現(xiàn)有的對(duì)蛋白配體相互作用的理解局限內(nèi)具體相對(duì)于此處所用的計(jì)算類(lèi)型確定的。因此，隨著這種評(píng)分函數(shù)的進(jìn)一步精練，這些值和常數(shù)也會(huì)因此而改變，任何能在蛋白和配體結(jié)合能的評(píng)估方面給出所需結(jié)果的適宜數(shù)值均可使用，而且，其也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
如上所述，所述的評(píng)分函數(shù)應(yīng)用于由上述側(cè)鏈構(gòu)象、原子身份和原子間距數(shù)據(jù)庫(kù)中提取的數(shù)據(jù)。為本說(shuō)明書(shū)的目的，該數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的MHC II類(lèi)分子數(shù)是42個(gè)模型加上4個(gè)已解析的結(jié)構(gòu)。從上述描述中可清楚地了解到，本發(fā)明的計(jì)算構(gòu)建方法的模塊性質(zhì)意味著，可簡(jiǎn)單地添加新的模型，并利用肽主鏈文庫(kù)和側(cè)鏈構(gòu)象搜索功能進(jìn)行掃描以創(chuàng)建其它的可通過(guò)上述的肽評(píng)分函數(shù)處理的數(shù)據(jù)集。這使得被掃描的MHC II類(lèi)分子庫(kù)可以很容易地增加，或者如果可以獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，則可以替換結(jié)構(gòu)和相關(guān)數(shù)據(jù)以創(chuàng)建現(xiàn)有等位基因的更精確的模型。
本發(fā)明的預(yù)測(cè)方法可以相對(duì)于包含大量已通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了其對(duì)不同MHC II類(lèi)分子的親和力的肽的數(shù)據(jù)集進(jìn)行校準(zhǔn)。將計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相比較，可確定一截?cái)嘀担阎撝抵纤薪?jīng)實(shí)驗(yàn)確定的T-細(xì)胞表位都得以正確的預(yù)測(cè)。
應(yīng)當(dāng)理解，盡管上述評(píng)分函數(shù)與現(xiàn)有的一些復(fù)雜方法相比相對(duì)簡(jiǎn)單，但計(jì)算進(jìn)行得非常迅速。還應(yīng)當(dāng)理解的是，其目的并不在于計(jì)算出對(duì)接到所選擇的MHC II類(lèi)蛋白結(jié)合溝內(nèi)的每種肽的真正結(jié)合能本身。根本的目的在于獲得相對(duì)的結(jié)合能數(shù)據(jù)以助于根據(jù)所選蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)預(yù)測(cè)T-細(xì)胞表位的定位。相對(duì)高的結(jié)合能或結(jié)合能高于選定的閾值意味著在配體中存在T-細(xì)胞表位。然后可以將所述配體進(jìn)行至少一輪氨基酸替代，并再次計(jì)算結(jié)合能。由于計(jì)算可迅速進(jìn)行，對(duì)肽序列的這些操作可在現(xiàn)有成本劃算的計(jì)算機(jī)硬件上于程序用戶界面中互動(dòng)進(jìn)行。由此不需要對(duì)計(jì)算機(jī)硬件進(jìn)行大量投資。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，也可使用其他軟件達(dá)到相同的目的。特別是可以使用能將配體對(duì)接入蛋白結(jié)合位點(diǎn)的更復(fù)雜的軟件，并與能量最小化相結(jié)合。對(duì)接軟件的例子包括DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.，161269-288(1982))，LUDI(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3300-308(1995))。分子建模和操作軟件的例子包括AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用這些計(jì)算方法將嚴(yán)重限制本發(fā)明方法的信息吞吐量，這是由于進(jìn)行必要的計(jì)算所需的處理時(shí)間導(dǎo)致的。但是可行的方式為，將這些方法作為‘二級(jí)篩選’以獲得關(guān)于通過(guò)本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)為‘陽(yáng)性結(jié)合體’的肽的更精確的肽結(jié)合能計(jì)算值。用于復(fù)雜的分子機(jī)械或分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算的處理時(shí)間的限制性是由進(jìn)行所述計(jì)算的軟件設(shè)計(jì)和目前計(jì)算機(jī)硬件技術(shù)的限制共同確定的。可以預(yù)期在將來(lái)，隨著編寫(xiě)更高效的代碼和計(jì)算機(jī)處理器速度的不斷提高，在更易控制的時(shí)間框架內(nèi)進(jìn)行上述計(jì)算是可行的。有關(guān)用于大分子的能量函數(shù)的其他信息和有關(guān)在折疊蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生的多種相互作用的考慮可參考下述文獻(xiàn)Brooks，B.R.，等.，J.Comput.Chem.，4187-217(1983)，有關(guān)蛋白-配體一般相互作用的信息參見(jiàn)Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)31-47(1988)，這些文獻(xiàn)均全文引入作為參考。其他有用的背景資料也可參見(jiàn)Fasman，G.D.編，Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Plenum Press，New York，ISBN0-306 4313-9。
實(shí)施例2用合成肽測(cè)定幼稚T細(xì)胞的方法MHC、肽和T細(xì)胞受體(TCR)的相互作用提供了T細(xì)胞識(shí)別的抗原特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。T細(xì)胞增殖測(cè)定檢驗(yàn)肽與MHC的結(jié)合和TCR對(duì)MHC/肽復(fù)合體的識(shí)別。本實(shí)施例的體外T細(xì)胞增殖測(cè)定包括刺激含有抗原呈遞細(xì)胞(APC)和T細(xì)胞的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。用合成肽抗原進(jìn)行體外刺激，在某些實(shí)驗(yàn)中使用完整蛋白抗原。用3H-胸苷(3H-Thy)測(cè)量刺激的T細(xì)胞增殖并對(duì)洗滌的固定細(xì)胞進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)估計(jì)摻入的3H-Thy的存在。
從國(guó)家血液部門(mén)(National Blood Service，Addenbrooks Hospital，Cambridge，UK)得到保存時(shí)間小于12小時(shí)的人血血沉棕黃層。從Amersham Pharmacia Biotech(Amersham，UK)得到菲可帕克(Ficoll-paque)。含有L-谷氨酰胺、50μg/ml鏈霉素、10μg/ml慶大霉素和0.1％人血清白蛋白的用于培養(yǎng)初級(jí)人淋巴細(xì)胞的無(wú)血清AIMV培養(yǎng)基得自Gibco-BRL(Paisley，UK)。合成肽得自Pepscan(荷蘭)和BabrahamTechnix(Cambridge，UK)。
對(duì)血沉棕黃層輕微離心從血漿和血小板中分離出紅血球和白血球。除去并扔掉頂層部分(含有血漿和血小板)。在磷酸鹽緩沖液(PBS)中1∶1稀釋紅血球和白血球并鋪在15ml菲可帕克(Amersham Pharmacia，AmershamUK)上。根據(jù)生產(chǎn)商推薦的條件進(jìn)行離心并從血清+PBS/菲可帕克界面收獲PBMC。用PBS(1∶1)混合PBMC并通過(guò)離心收集。除去并扔掉上清液，將PBMC沉淀重新懸浮在50ml PBS中。通過(guò)離心再次沉淀細(xì)胞并拋棄PBS上清液。用50ml AIMV培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞并在此時(shí)計(jì)數(shù)并用錐蟲(chóng)藍(lán)染料排除估計(jì)存活率。再次離心收集細(xì)胞并拋棄上清液。細(xì)胞重新懸浮以低溫保藏，密度為3×107/ml。保藏培養(yǎng)基為90％(v/v)熱失活的AB人血清(Sigma，Poole，UK)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，UK)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受調(diào)節(jié)的冰凍容器(Sigma)并且在轉(zhuǎn)移到液氮以長(zhǎng)期保存前將其置于-70℃過(guò)夜。當(dāng)需要使用時(shí)，在37℃水浴中快速解凍然后轉(zhuǎn)移到10ml預(yù)熱的AIMV培養(yǎng)基。
在96孔平底板(PBMC密度為2×105PBMC每孔)中用蛋白和肽抗原刺激PBMC。在37℃下將PBMC孵育7天后用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham，UK)脈沖。對(duì)于本研究，可以產(chǎn)生并使用以3個(gè)氨基酸遞增而覆蓋FIX全序列的合成肽(15聚體)或者得自表1的所有或者任何肽或者含有在表2或表3中詳述的替代的肽。每種肽都單獨(dú)地一式三份地針對(duì)從20個(gè)未接觸抗原供體中分離的PBMC進(jìn)行篩選。在每個(gè)供體測(cè)定中使用先前已經(jīng)顯示具有免疫原性的兩種對(duì)照肽和一種強(qiáng)的非記憶抗原KLH。
對(duì)照抗原如下
將肽溶解于DMSO中使其終濃度為10mM，然后將這些貯存液在AIMV培養(yǎng)基中稀釋到原來(lái)的1/500(終濃度20μM)。向平底96孔板中加入肽使其終濃度為2和20μM(體積為100μl)。通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)染料排除估計(jì)解凍的PBMC的存活率。然后將細(xì)胞重新懸浮(密度為2×106個(gè)細(xì)胞/ml)，向每個(gè)含有肽的孔中移入100μl(2×105個(gè)PBMC/孔)。在每個(gè)肽濃度下測(cè)定一式三份的孔培養(yǎng)物。在5％CO2、37℃的潮濕空氣中孵育平板7天。用1μCi3H-Thy/孔的脈沖細(xì)胞18-21小時(shí)后收獲到過(guò)濾墊上。用Wallac微量培養(yǎng)板β頂層平板計(jì)數(shù)器(Perkin Elmer)或類(lèi)似儀器測(cè)定CPM值。結(jié)果表達(dá)為刺激指數(shù)，用下面的式子確定受試肽的增殖CPM未處理孔的增殖CPM對(duì)于這種幼稚T細(xì)胞測(cè)定，認(rèn)為大于2.0的刺激指數(shù)是陽(yáng)性分值。當(dāng)同一受試肽在多于一個(gè)供體樣品中得到的刺激指數(shù)大于2.0時(shí)，認(rèn)為其為可能的免疫優(yōu)勢(shì)表位的證據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)修飾的分子，其具有人因子IX的生物學(xué)活性，且當(dāng)其在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)基本上無(wú)免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物學(xué)活性但未經(jīng)修飾的分子。
2.如權(quán)利要求1所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過(guò)從原始的未經(jīng)修飾的分子中去除一個(gè)或多個(gè)T-細(xì)胞表位而實(shí)現(xiàn)的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過(guò)減少能與源自所述分子的肽相結(jié)合的MHC同種異型的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
4.如權(quán)利要求2或3所述的分子，其中，去除了一個(gè)T-細(xì)胞表位。
5.如權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的分子，其中，所述原本存在的T-細(xì)胞表位是MHC II類(lèi)配體或經(jīng)呈遞在II類(lèi)分子上后顯示出刺激或結(jié)合T-細(xì)胞的能力的肽序列。
6.如權(quán)利要求5所述的分子，其中，所述的肽序列選自如表1所示的肽序列。
7.如權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的分子，其中，任何原本存在的T-細(xì)胞表位中的1-9個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了改變。
8.如權(quán)利要求7所述的分子，其中，有一個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了改變。9.如權(quán)利要求7或8所述的分子，其中，所述氨基酸殘基的改變是用其他的氨基酸殘基在特定的位置處替代、添加或缺失原本存在的氨基酸殘基。
10.如權(quán)利要求9所述的分子，其中，按表2所示進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替代。
11.如權(quán)利要求10所述的分子，其中，排除已知形成與功能蛋白不匹配的人因子IX遺傳突變的這類(lèi)替代。
12.如權(quán)利要求10所述的分子，其中，另外還按表3所示進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替代以減少能與源自所述分子的肽相結(jié)合的MHC同種異型的數(shù)量。
13.如權(quán)利要求9所述的分子，其中，按表3所示進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代。
14.如權(quán)利要求13所述的分子，其中，排除已知形成與功能蛋白不匹配的人因子IX遺傳突變的這類(lèi)替代。
15.如權(quán)利要求7-14中任意一項(xiàng)所述的分子，其中，通過(guò)其它進(jìn)一步的改變恢復(fù)所述分子的生物學(xué)活性。
16.如權(quán)利要求15所述的分子，其中，其它進(jìn)一步的改變是替代、添加或缺失特定的氨基酸。
17.如權(quán)利要求7-16中任意一項(xiàng)所述的修飾分子，其中，所述氨基酸的改變是參照同源蛋白序列進(jìn)行的。
18.如權(quán)利要求7-16中任意一項(xiàng)所述的修飾分子，其中，所述氨基酸的改變是參照硅片上(in silico)建模技術(shù)進(jìn)行的。
19.如權(quán)利要求1-18中任意一項(xiàng)所述的修飾分子，其與相應(yīng)的野生型蛋白序列的氨基酸同一性小于100％并且當(dāng)在T細(xì)胞測(cè)定中檢測(cè)時(shí)引起小于2.0的刺激指數(shù)。
20.如權(quán)利要求1-18中任意一項(xiàng)所述的修飾分子，當(dāng)在T細(xì)胞測(cè)定中檢測(cè)時(shí)與未修飾蛋白分子相比其引起降低的刺激指數(shù)。
21.編碼權(quán)利要求1-20中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾人因子IX分子的DNA序列。
22.一種藥物組合物，其包含上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求中所定義的具有人因子IX生物學(xué)活性的經(jīng)修飾分子，并可任選地包含可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
23.制備上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求中所定義的具有人因子IX生物學(xué)活性的經(jīng)修飾分子的方法，該方法包括下述步驟(i)確定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通過(guò)任意方法，包括利用體外或硅片上(in silico)的技術(shù)或生物學(xué)試驗(yàn)確定所述肽與MHC分子的結(jié)合，由此鑒定所述蛋白的氨基酸序列中潛在的一個(gè)或多個(gè)T-細(xì)胞表位；(iii)設(shè)計(jì)在已鑒定的潛在T-細(xì)胞表位內(nèi)有一個(gè)或多個(gè)氨基酸被修飾的新序列變體，其中所述修飾為替代、添加或缺失任意原本存在的T-細(xì)胞表位中的1-9個(gè)氨基酸殘基，這一效果可由體外或硅片上(in silico)的技術(shù)或生物學(xué)試驗(yàn)通過(guò)所述肽與MHC分子的結(jié)合來(lái)確定，或通過(guò)肽-MHC復(fù)合物與T-細(xì)胞的結(jié)合來(lái)確定；(iv)通過(guò)重組DNA技術(shù)構(gòu)建所述序列變體，并檢測(cè)所述的變體以便鑒定一個(gè)或多個(gè)具有所需特性的變體；和(v)任選地重復(fù)步驟(ii)-(iv)。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，步驟(ii)是通過(guò)下述步驟進(jìn)行的(a)選擇具有已知氨基酸序列的所述肽的一個(gè)區(qū)域；(b)由所選擇的區(qū)域中順序抽取預(yù)定統(tǒng)一大小且至少由3個(gè)氨基酸殘基組成的重疊氨基酸殘基片段；(c)通過(guò)對(duì)存在于抽樣氨基酸殘基片段中的每個(gè)疏水氨基酸殘基側(cè)鏈賦值求和，計(jì)算每一抽樣片段的MHC II類(lèi)分子結(jié)合分值；和(d)根據(jù)計(jì)算出的該片段的MHC II類(lèi)分子結(jié)合分值鑒定至少一個(gè)適于修飾的片段，以在基本上不減弱所述肽的治療功效的前提下改變肽的整體MHC II類(lèi)結(jié)合分值。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，步驟(c)通過(guò)下述步驟利用經(jīng)改進(jìn)而包含了12-6范德華配體-蛋白能量排斥項(xiàng)和配體構(gòu)象能量項(xiàng)的Bhm評(píng)分函數(shù)進(jìn)行，所述步驟為(1)提供MHC II類(lèi)分子模型的第一數(shù)據(jù)庫(kù)；(2)提供所述MHC II類(lèi)分子模型的容許肽主鏈的第二數(shù)據(jù)庫(kù)；(3)從所述的第一數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選模型；(4)從所述的第二數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選容許肽主鏈；(5)鑒定在每個(gè)抽樣片段中存在的氨基酸殘基側(cè)鏈；(6)確定存在于每個(gè)抽樣片段中的所有側(cè)鏈的結(jié)合親和性值；以及對(duì)每一所述的模型和每一所述的主鏈重復(fù)步驟(1)到(5)。
26.一種選自表1所示序列的13mer T-細(xì)胞表位肽，其具有潛在的MHC II類(lèi)結(jié)合活性且產(chǎn)生自未經(jīng)修飾的人因子IX。
27.一種肽序列，其由如權(quán)利要求26所述的13mer T-細(xì)胞表位肽中的至少9個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成。
28.與野生型人因子IX有100％氨基酸同一性的9-15mer肽序列，當(dāng)在T細(xì)胞測(cè)定中檢測(cè)時(shí)，其引起大于2.0的刺激指數(shù)。
29.如權(quán)利要求26-28中任意一項(xiàng)所述的肽序列的用途，用于生產(chǎn)在體內(nèi)使用時(shí)基本上沒(méi)有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物學(xué)活性的任何未經(jīng)修飾分子的人因子IX。
30.如權(quán)利要求26-28中任意一項(xiàng)所述的肽序列的用途，用于生產(chǎn)與相應(yīng)野生型蛋白序列相比較氨基酸同一性小于100％并且當(dāng)在T細(xì)胞測(cè)定中檢測(cè)時(shí)引起比未修飾的人因子IX分子要低的刺激指數(shù)或者至少小于2.0的刺激指數(shù)的人因子IX。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及人因子IX的修飾而導(dǎo)致因子IX蛋白在體內(nèi)使用時(shí)其基本無(wú)免疫原性或者比任一未經(jīng)修飾的相應(yīng)蛋白的免疫原性要低。本發(fā)明還涉及源自具有免疫原性的人因子IX的T細(xì)胞表位序列。
文檔編號(hào)C12N15/57GK1547608SQ02816759
公開(kāi)日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月4日
發(fā)明者F·J·卡爾, F J 卡爾, G·卡特 申請(qǐng)人:默克專(zhuān)利有限公司