專利名稱：：聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體的說，涉及聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子及其制備方法。
背景技術(shù)：
：睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)最初在雞胚眼球脈絡(luò)膜、睫狀體和虹膜中被發(fā)現(xiàn)，因能促進(jìn)體外培養(yǎng)的雞胚副交感睫狀節(jié)神經(jīng)元存活而命名。CNTF是約200個(gè)氨基酸組成的多肽激素，由成熟個(gè)體外周神經(jīng)中的施旺細(xì)胞、星形細(xì)胞中的一些亞細(xì)胞群體和中樞神經(jīng)系統(tǒng)分泌的胞液分子而非由靶組織分泌。CNTF最初被認(rèn)為是睫狀神經(jīng)節(jié)副交感神經(jīng)元培養(yǎng)時(shí)的營養(yǎng)因子，并由此命名。它可以促進(jìn)多種祌經(jīng)細(xì)胞和祌經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長與分化，包括運(yùn)動(dòng)祌經(jīng)元、感覺祌經(jīng)元、交感神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元和少突細(xì)胞。90年代初期，人們將CNTF用于治療肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)的實(shí)驗(yàn)研究。Regeneron的研究者們對一組ALS患者進(jìn)行臨床研究，研究開始不久便發(fā)現(xiàn)病人們的體重大大降低。ALS病人反饋資料表明，使用藥物組體重比安慰劑組明顯降低，且這一結(jié)果持續(xù)整個(gè)研究過程。Regeneron公司根據(jù)這一結(jié)果決定在肥胖癥領(lǐng)域?qū)ζ溥M(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，CNTF在體內(nèi)可與下丘腦的特異性受體結(jié)合，激活抑制食欲的關(guān)鍵信號(hào)通道，抑制進(jìn)食欲望且使機(jī)體不會(huì)產(chǎn)生饑餓感，從而降低體重。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CNTF不僅能使肥胖基因有缺陷的肥胖小鼠迅速減肥，而且對因高脂肪飲食造成的肥胖小鼠也有減肥作用(參見BluherS，MoschosS,BulenJJr等人，Ciliaryneurotrophicfac2torAx15altersenergyhomeostasis,decreasesbodyweight,andimprovesmetaboliccontrolindiet2inducedobeseandUCP12DTAmice，丄D勵(lì)由，2004，53(1l):第2787-2796頁)。已完成的臨床研究表明，CNTF不僅具有與化學(xué)藥物同水平的療效，而且解決了化學(xué)藥物毒副作用大的問題。但是，CNTF也存在著半衰期短，具有一定的免疫原性等特點(diǎn)。因此存在著進(jìn)一步改善CNTF臨床治療效果的要求。為了使CNTF的使用更加方便、作用更加持久，更適于長期使用。本發(fā)明人考慮用可溶性高分子聚合物對其進(jìn)行化學(xué)修飾，可以有效改變其體內(nèi)分布和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)。用高分子化學(xué)修飾劑對蛋白質(zhì)和肽類分子進(jìn)行化學(xué)修飾已經(jīng)成為生物技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在眾多的高分子化學(xué)修飾劑中，以線性的、無毒的、無免疫原性的和具有雙歧聚合物性質(zhì)的聚乙二醇對蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾最引人注目。用作修飾蛋白的PEG實(shí)際上是單甲氧基聚乙二醇，該化合物在水和有機(jī)溶劑中具有高溶解性，不揮發(fā)，無味，體內(nèi)應(yīng)用無免疫原性和抗原性，長期肌肉或皮下注射無不良反應(yīng)。體內(nèi)代謝穩(wěn)定，低的腎臟排除率，具有很高的柔韌性；生物相容性己經(jīng)得到FDA的認(rèn)證。蛋白質(zhì)被PEG修飾后，偶聯(lián)的PEG鏈在蛋白分子表面產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，減弱了血液中各種水解酶對蛋白的水解作用，從而有效地延長了蛋白在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的保留時(shí)間。由于PEG空間位阻的存在，可阻止藥物與蛋白表面的抗原決定簇接觸，從而減少被免疫系統(tǒng)清除的幾率，降低蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性。親水性PEG與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合后，可使蛋白質(zhì)顆粒表面形成較厚的水化層，阻止其凝集、沉淀，增加蛋白的穩(wěn)定性。國內(nèi)外對PEG修飾蛋白質(zhì)類藥物的研究主要集中于腺苷脫氨酶、天冬酰胺酶、白介素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、超氧化物歧化酶、水蛭素、尿激酶、血紅蛋白、干擾素、重組人生長激素、促紅細(xì)胞生成素等。目前，國內(nèi)外未見高分子化學(xué)修飾劑修飾CNTF的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。本發(fā)明的目的還在于提供該聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，其中每一分子睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子與至少一分子聚乙二醇類聚合物通過化學(xué)鍵相連接；所述聚乙二醇類聚合物為聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酸酯(mPEGSuccinimidylsuccinate,mPEG-SS)、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEGSuccinimidylcarbonate,mPEG-SC)、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯(mPEGtresylate)、甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-propionaldehyde)、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯(mPEG-SPA)、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺a甲基丁酸酯(mPEG-SMB)、甲氧基聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺(mPEG2-NHS)、甲氧基聚乙二醇-馬來酰亞胺(mPEG2-MAL)或甲氧基聚乙二醇-乙醛(mPEG2-ALD);所述聚乙二醇類聚合物的分子量為lkD100kD。優(yōu)選的是，每一分子所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子與12個(gè)分子的所述聚乙二醇類聚合物通過化學(xué)鍵相連接；所述聚乙二醇類聚合物為甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯或甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺a甲基丁酸酯；所述聚乙二醇類聚合物的分子量為5kD50kD。更優(yōu)選的是，每一分子所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子與一分子甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯通過化學(xué)鍵相連接；甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯的分子量為20kD。這些聚乙二醇類聚合物都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且是市售的。例如，可購自北京凱正生物工程發(fā)展有限公司、NEKTAR公司等。所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子是天然的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。優(yōu)選的是，所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子是天然的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的突變體或變異體。更優(yōu)選的是，所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的突變體為睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子第17位的半胱氨酸突變?yōu)楸彼峄蚪z氨酸而形成的突變體；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子第63位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼岫纬傻耐蛔凅w；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子中去除C末端的15個(gè)氨基酸而形成的變異體；或同時(shí)將睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子第17位的半胱氨酸突變?yōu)楸彼?、?3位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼帷⑷コ鼵末端的15個(gè)氨基酸后而形成的變異體。CNTF是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，重組人睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhCNTF)是市售的，例如可購自武漢中美科技有限公司(中國湖北省武漢市)。CNTF突變體或變異體的制備方法在現(xiàn)有技術(shù)中也是已知的，例如CN1687413A、CN1760205A、CN1844392A、CN1760205A中就公開了睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的各種突變體及其突變方法。本發(fā)明還提供了一種修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的制備方法，包括將聚乙二醇類聚合物與濃度為0.5mg/mL5.5mg/mL的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子溶液混合，聚乙二醇類聚合物與睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的摩爾比為1:120:1，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH為79.5，在437。C反應(yīng)0.54小時(shí)。其中，所述聚乙二醇類聚合物與所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子優(yōu)選按照摩爾比5:1混合，反應(yīng)溫度優(yōu)選為室溫，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為2小時(shí)，所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子溶液的濃度優(yōu)選為2.0mg/mL，所述反應(yīng)體系的pH優(yōu)選為8。本發(fā)明的所述的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠保持修飾前睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的生物學(xué)活性，同時(shí)又比修飾前睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子具有更好的穩(wěn)定性、血漿清除率更低、體內(nèi)循環(huán)半衰期更長、毒副作用顯著降低。因此，作為治療藥物，它比修飾前睫狀祌經(jīng)營養(yǎng)因子更合適。同時(shí)，免疫原性實(shí)驗(yàn)表明，修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠顯著降低睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的免疫原性。圖1為示出構(gòu)建用于表達(dá)rhCNTF的表達(dá)載體的圖。圖2為示出rhCNTF的SDS-PAGE圖，其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為rhCNTF。圖3為示出反應(yīng)時(shí)間對修飾反應(yīng)的影響的圖，其中1為SPA-mPEG修飾的rhCNTF;2為SMB-mPEG修飾的rhCNTF;3為SC-mPEG修飾的rhCNTF。圖4為示出反應(yīng)溫度對修飾反應(yīng)的影響的圖，其中1為SPA-mPEG修飾的rhCNTF;2為SC-mPEG修飾的rhCNIT;3為SMB-mPEG修飾的rhCNTF。圖5為示出反應(yīng)體系pH值對修飾反應(yīng)的影響的圖，其中1為SC-mPEG修飾的rhCNTF;2為SPA-mPEG修飾的rhCNTF;3為SMB-mPEG修飾的rhCNTF。圖6為示出rhCNTF溶液濃度對修飾反應(yīng)的影響的圖，其中1為SPA-mPEG修飾的rhCNTF;2為SC-mPEG修飾的rhCNTF;3為SMB-mPEG修飾的rhCNTF。圖7為示出聚乙二醇類聚合物與rhCNTF的摩爾比對修飾反應(yīng)的影響的圖，其中l(wèi)為SPA-mPEG修飾的rhCNTF;2為SMB-mPEG修飾的rhCNTF;3為SC-mPEG修飾的rhCNTF。圖8為QS-HighPerformance離子交換層析圖。圖9為QS-HighPerformance離子交換層析后的SDS-PAGE電泳圖，其中h純化前樣品；2-3:峰l;4-7:峰2;M:分子量標(biāo)準(zhǔn)；8-11:峰3;12-13:峰4。圖IO為示出飛行質(zhì)譜法測精確分子量的圖。圖11為等電聚焦電泳圖，其中1為ACNTF，M為IEF標(biāo)準(zhǔn)，2、3、4為rhCNTF-SPA-mPEGl。圖12為rhCNTF在200-700nm的紫外-可見光譜掃描圖。圖13為rhCNTF-SPA-mPEGl在200-700nm的紫外-可見光譜掃描圖。圖14為示出使用rhCNTF期間小鼠體重變化的圖，其中，l為Na2HPCXt組，2為陰性對照組，3為rhCNTF組(0.3mg/kg)。圖15為示出使用rhCNTF期間小鼠體重變化的圖，其中，l為Na2HP04組，2為陰性對照組，3為rhCNTF組(l.Omg/kg)。圖16為示出使用rhCNTF-SPA-mPEG1期間小鼠體重變化的圖，其中，l為Na2HP04組，2為陰性對照組，3為rhCNTF-SPA-mPEGl組(0.3mg/kg)。圖17為示出使用rhCNTF-SPA-mPEG1期間小鼠體重變化的圖，其中，l為Na2HP04組，2為陰性對照組，3為rhCNTF-SPA-mPEGl組(1.0mg/kg)。圖18為示出使用rhCNTF對小鼠攝食的影響的圖，其中1為陰性對照組，2為rhCNTF組(0.3mg/kg)。圖19為示出使用rhCNTF對小鼠攝食的影響的圖，其中1為陰性對照組，2為rhCNTF組(1.0mg/kg)。圖20為示出使用rhCNTF-SPA-mPEGl對小鼠攝食的影響的圖，其中1為陰性對照組，2為rhCNTF-SPA-mPEGl組(0.3mg/kg)。圖21為示出使用rhCNTF-SPA-mPEGl對小鼠攝食的影響的圖，其中l(wèi)為陰性對照組，2為rhCNTF-SPA-mPEGl組(1.0mg/kg)。圖22為rhCNTF及rhCNTF-SPA-mPEGl在4T條件下第0天的SDS-PAGE電泳圖，其中1、2、4、7為rhCNTF，3、5、6為rhCNTF-SPA-mPEGl，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖23為rhCNTF及rhCNTF-SPA-mPEGl在4"C條件下第12天的SDS-PAGE電泳圖，其中1、2、4、7為rhCNTF,3、5、6為rhCNTF-SPA-mPEGl。圖24為示出rhCNTF促進(jìn)TF-1CN5al細(xì)胞增殖曲線的圖。圖25為示出rhCNTF-SPA-mPEGl促進(jìn)TF-1CN5al細(xì)胞增殖曲線的圖。圖26為rhCNTF禾BrhCNTF-SPA-mPEGl的免疫印跡分析圖，其中l(wèi)為蛋白標(biāo)準(zhǔn)，2為rhCNTF-SPA-mPEGl,3為rhCNTF。圖27為示出不同時(shí)間點(diǎn)rhCNTF的血清濃度的圖。圖28為示出不同時(shí)間點(diǎn)rhCNTF-SPA-mPEGl的血清濃度的圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖通過具體實(shí)施方式的描述對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1rhCNTF的制備根據(jù)天然的人CNTF基因序列(來自GENEBANK)，設(shè)計(jì)兩條引物PI:GACCATATGGCTTTCACAGAGCATTCACCG;P2:GGTCAGCTCGGATCCTTAATCAGTGCTTGCCAC。以人cDNA為模板(方法參見金冬雁等譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南提取》U996版)，第463-469頁)，力口入P1禾口P2引物，在50(^1的反應(yīng)體系(10x緩沖液，含Mg2+5.0ji1，dNTP(2.5mmol/L)l.O(il'PI(30(imol/L)1.0|li1，P2(30pmol/L)1.0|il，PfuDNA聚合酶1U，加超純水至總體積至50.0|il}中，95'C變性30秒后，于93匸變性30秒、55'C退火60秒、68'C延伸2分鐘，重復(fù)上述循環(huán)30次，最后68。C延伸8分鐘；反應(yīng)結(jié)束后，快速降溫至4。C。將上述PCR產(chǎn)物用Ndel和BamHI(均購自北京中原公司)雙酶切后，與經(jīng)同樣酶切(Ndel和BamHI)的表達(dá)載體pET32a十(購自Novagen公司)相連接，構(gòu)建出了原核表達(dá)載體pET32a+/CNTF。參見圖1。用表達(dá)載體pET32a+ZCNTF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(購自Novagen公司，貨號(hào)69387-3)后，制備出CNTF工程菌(命名為pCNTF/BL21)。將CNTF工程菌(pCNTF/BL21)劃線接種于LB瓊脂平板(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC15g，瓊脂10g，加水定容至1L，高壓滅菌，當(dāng)溫度降到5(TC左右時(shí)加入Amp至終濃度為200|ig/ml，取20ml倒培養(yǎng)皿，凝固后即成LB瓊脂平板)，37t:培養(yǎng)過夜。從培養(yǎng)過夜的LB平板上挑選單菌落接種于含LB的試管中，37"C培養(yǎng)10h，然后轉(zhuǎn)種至含200mlLB培養(yǎng)液(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，加水定容至1L，高壓滅菌，分裝三角瓶，每瓶200ml)的三角瓶中，37'C培養(yǎng)過夜制得種子液。次日，將種子液按1%比例接種于含30升2YT培養(yǎng)液的50L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基為2YT[胰蛋白胨(bacto-tryptone，購自O(shè)XOID公司)480g，酵母提取物(bacto-yeastextract,購自O(shè)XOID公司)300g，NaCl150g，加入蒸餾水溶解，5NNaOH體調(diào)節(jié)pH至7.0，定容到30升，高壓滅菌(0.12Mpa，121°C，30min余下同)]，培養(yǎng)體積30L?？刂瓢l(fā)酵溫度37'C、轉(zhuǎn)速250450r/min、通氣量3050L/min、pH7.3，培養(yǎng)至A600-1.2左右后，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.4mM進(jìn)行誘導(dǎo)。繼續(xù)培養(yǎng)5h，終止發(fā)酵，收集菌體，儲(chǔ)存于-3(TC冰箱中待用。從-30'C冰箱中取出發(fā)酵菌體，按1%比例用0.02mol、pH7.2的磷酸鹽溶液重新懸浮菌體，通過高壓勻漿破碎細(xì)菌，5000r/min離心15min，收集包涵體沉淀，再經(jīng)變性[每克包涵體使用400ml變性液(8M鹽酸胍、50MmTris-Hcl、pH8.3)處理4小時(shí)]、復(fù)性(通過透析法復(fù)性，透析液為50mMTris-Hcl、pH8.3，透析時(shí)間為24小時(shí))、Q-SepharoseHP層析步驟進(jìn)行純化而獲得rhCNTF。做SDS-PAGE并用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進(jìn)行分析，對rhCNTF進(jìn)行純度鑒定，由圖2可見，rhCNTF純度可達(dá)100%。實(shí)施例2修飾物的制備以及修飾條件的選擇所使用的聚乙二醇類聚合物如下所示SPA-mPEG，購自北京凱正生物工程發(fā)展有限責(zé)任公司，批號(hào)20060101，分子量20KD;SC-mPEG，購自北京凱正生物工程發(fā)展有限責(zé)任公司，批號(hào)20051019，分子量20KD;SMB-mPEG，購自NEKTAR公司，批號(hào)PT-02E-13，分子量20KD。在以下實(shí)施例中，除非另有說明，所使用的rhCNTF溶液與PEG溶液均是使用0.02M磷酸鹽緩沖液(pH為7.2)作為溶劑配制而成的。在本實(shí)施例中，結(jié)合單個(gè)分子聚乙二醇類聚合物的rhCNTF用rhCNTF-PEGl表示。1、反應(yīng)時(shí)間對修飾反應(yīng)的影響取rhCNTF(1.016mg/ml)lml，按摩爾比20:1的比例加入SPA-mPEG，室溫反應(yīng)。分別于0.5、1、2、3、4h取出0.2ml。做分離膠12%，濃縮膠4%的非還原SDS-PAGE電泳。以rhCNTF-PEGl在修飾產(chǎn)物中所占比例的高低作為指標(biāo)，采用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進(jìn)行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間從0.5、1、2、3、4h，rhCNTF-PEGl所占的比例分別為24.7%、30%、39.6%、28.5%、27.4%(圖3)。反應(yīng)時(shí)間為2h時(shí)，rhCNTF-PEGl所占的比例最高。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于2h時(shí)，rhCNTF-PEGl在整個(gè)修飾物中所占的比例下降。因此，綜合考慮，選擇2h作為修飾反應(yīng)的時(shí)間。同等條件下，SPA-mPEG修飾后CNTF-PEG1所占的比例高于其他兩種修飾劑修飾后所占的比例。因此SPA-mPEG更適合用來修飾rhCNTF。2、反應(yīng)溫度對修飾反應(yīng)的影響取rhCNTF(1.016mg/ml)0.6ml，按摩爾比10:1的比例加入SPA-mPEG，混勻，分裝于3支試管中，每管0.2ml，分別于4'C、25°C、37。C反應(yīng)2h，做分離膠12%，濃縮膠4%的非還原SDS-PAGE電泳。以rhCNTF-PEGl在修飾產(chǎn)物中所占比例的高低作為指標(biāo)，采用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進(jìn)行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在溫和的實(shí)驗(yàn)條件下(4T:或25'C)修飾反應(yīng)即可發(fā)生(圖4)。隨著溫度的升高，rhCNTF-PEGl所占的比例有所增加，分別為50.6%、51.8%、54.2%，但增加的幅度不明顯。為了盡可能的保證rhCNTF的活性，選擇25"C作為反應(yīng)溫度。同等條件下，SPA-mPEG修飾后CNTF-PEG1所占的比例高于其他兩種修飾劑修飾后所占的比例。因此SPA-mPEG更適合用來修飾rhCNTF。3、溶液pH值對修飾反應(yīng)的影響取rhCNTF(1.016mg/ml)0.6ml，分別取1ml置于6支試管中，調(diào)節(jié)pH值分別為7.0、7.4、8.0、8.4、9.0、9.2。每支試管中以摩爾比10:1的比例分別加入SPA-mPEG，常溫反應(yīng)2h。做分離膠12%,濃縮膠4%的非還原SDS-PAGE電泳。以rhCNTF-PEGl在修飾產(chǎn)物中所占比例的高低作為指標(biāo)，采用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進(jìn)行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH值在7.0、7.36、8.03、8.42、9.0、9.23的條件下，rhCNTF-PEGl所占的比例分別為20%、29.8%、35.9%、32%、30.3%、27.1%(圖5)。其中以pH值在8.03時(shí)rhCNTF-PEGl所占的比例最高。為了方便，選擇pH值8作為反應(yīng)體系的pH值。同等條件下，SPA-mPEG修飾后CNTF-PEG1所占的比例高于其他兩種修飾劑修飾后所占的比例。因此SPA-mPEG更適合用來修飾rhCNTF。4、CNTF濃度對修飾反應(yīng)的影響取rhCNTF(5.33mg/ml)0.4ml，取出0.15ml加入0.05ml透析液將其濃度稀釋到4.0mg/ml，立刻稀釋3次，使5支試管中的蛋白濃度分別為5.33mg/ml、4.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml，體積為0.2ml。按摩爾比10:1的比例分別加入SPA-mPEG，混勻，常溫反應(yīng)2h。做分離膠12%，濃縮膠4%的非還原SDS-PAGE電泳。以rhCNTF-PEGl在修飾產(chǎn)物中所占比例的高低作為指標(biāo)，采用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進(jìn)行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白濃度在5.43mg/ml、4.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml時(shí)，rhCNTF-PEGl所占的比例分別為24.6%、29.4%、39.9%、36.5%、32.9%(圖6)。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.0mg/ml時(shí)，rhCNTF-PEG1所占的比例最高。因此選擇蛋白濃度為2.0mg/ml作為修飾反應(yīng)中rhCNTF的最適濃度。同等條件下，SPA-mPEG修飾后CNTF-PEG1所占的比例高于其他兩種修飾劑修飾后所占的比例。因此SPA-mPEG更適合用來修飾rhCNTF。5、反應(yīng)物摩爾比對修飾反應(yīng)的影響取rhCNTF(1.016mg/ml)5ml，置于5支試管中，每管1ml。分別按摩爾比1:1、1:2、1:5、1:10、1:20的比例加入SPA-mPEG,混勻，常溫反應(yīng)2h。做分離膠12%，濃縮膠4%的非還原SDS-PAGE電泳。以rhCNTF-PEGl在修飾產(chǎn)物中所占比例的高低作為指標(biāo)，采用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀進(jìn)行分析。SC-mPEG、SMB-mPEG以相同的方法進(jìn)行測定。聚乙二醇類聚合物與rhCNTF的摩爾比對修飾反應(yīng)影響較為顯著。在SPA-mPEG與rhCNTF的摩爾比為1:1、2:1、5:1、10:1、20:1時(shí)，rhCNTF-PEGl所占的比例分別為27.3%、37%、37.3%、38.4%、28.4%(圖7)。由圖6可知，摩爾比為5:1為修飾反應(yīng)的最佳摩爾比。同等條件下，SPA-mPEG修飾后CNTF-PEG1所占的比例高于其他兩種修飾劑修飾后所占的比例。因此SPA-mPEG更適合用來修飾rhCNTF。綜上所述，選擇SPA-mPEG作為修飾劑，修飾條件為反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)，反應(yīng)溫度25。C，反應(yīng)體系的pH為8，rhCNTF溶液的濃度為2.0mg/mL，SPA-mPEG與rhCNTF的摩爾比為5:1。實(shí)施例3SPA-mPEG修飾的rhCNTF的制備及純化取實(shí)施例1制備的rhCNTF進(jìn)行透析，透析液為0.1mol/L的四硼酸鈉水溶液，pH值為9.2。在4。C下透析48h,中間換液4次，透析后取樣，Lowry法測定rhCNTF蛋白濃度。然后取透析后的rhCNTF(2mg/ml)200ml，按摩爾比1:5的比例加入SPA-mPEG，在25°C條件下，反應(yīng)體系的pH值控制在8,反應(yīng)時(shí)間為2h，加入6NHC1終止反應(yīng)。為了更好的將未修飾的rhCNTF、結(jié)合單分子SPA-mPEG的rhCNTF和結(jié)合多分子SPA-mPEG的rhCNTF分開，采用QS-HighPerformance離子交換層析進(jìn)行研究。取上述終止反應(yīng)后的溶液40ml，上柱分離。色譜條件如下層析介質(zhì)為QS-HighPerformance,柱長為2.6x40cm，柱體積159ml，流動(dòng)相為分別含有50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM的NaCl的O.OIM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)，流速1.0ml/min、檢測波長280nm。收集各洗脫峰。從色譜圖(圖8)中可以看出有四個(gè)洗脫峰(其中第四個(gè)峰為鹽峰)。經(jīng)SDS-PAGE鑒定(圖9)，峰1主要為結(jié)合多分子SPA-mPEG的rhCNTF，峰2為結(jié)合單分子SPA-mPEG的rhCNTF蛋白(下文中稱為rhCNTF-SPA-mPEGl)，峰3為未反應(yīng)的rhCNTF。選擇性的收集目的蛋白，合并，濃縮后透析于5mMNa2HP04溶液中，-20°。保存，用于下一步修飾物的評(píng)價(jià)。實(shí)施例4rhCNTF-SPA-mPEGl的理化特性鑒定1、純度以及分子量測定用飛行質(zhì)譜法測定精確分子量，結(jié)果見圖10。由飛行質(zhì)譜檢測結(jié)果可知(圖10)，在分子量為21084.65處出現(xiàn)一個(gè)峰，該峰為rhCNTF;在41441.38處出現(xiàn)另一個(gè)峰，該峰為rhCNTF-SPA-mPEGl，與理論分子量一致。2、修飾率的測定如HabeebA.F.S.A，《AnalyticalBiochemistry〉〉(1966)14，第328-336頁禾口JohnB,etal.《AnalyticalBiochemistry》(1997)，254，第254-262頁中所述，經(jīng)TNBS法測定rhCNTF-SPA-mPEGl的修飾率為14.76%。rhCNTF分子中含有7個(gè)賴氨酸(Lys)，由于SPA-mPEG是針對賴氨酸(Lys)殘基進(jìn)行非定點(diǎn)修飾，因此從其修飾率可以推斷出SPA-mPEG修飾的rhCNTF為結(jié)合單個(gè)SPA-mPEG分子的rhCNTF。3、等電點(diǎn)的測量由等電聚焦電泳結(jié)果可知，rhCNTF的等電點(diǎn)為5.8，與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致。采用AlphaDigiDoc凝膠成像分析儀計(jì)算rhCNTF-SPA-mPEGl的等電點(diǎn)為5.98。電泳圖見圖11。4、紫外-可見光譜掃描結(jié)果對rhCNTF以及rhCNTF-SPA-mPEGl在200-700nm之間進(jìn)行紫外一可見光譜掃描，結(jié)果顯示，rhCNTF(圖12)與rhCNTF-SPA-mPEGl(圖13)的最大吸收光譜均為279.5nm。說明單個(gè)SPA-mPEG分子對rhCNTF的修飾沒有改變r(jià)hCNTF的空間構(gòu)象。圖12和圖13的檢測結(jié)果分別見表1、2。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>此外，從小鼠的攝食變化圖可知(圖1821)，給藥期間小鼠的攝食量明顯減少，停藥后攝食量稍有增加。因此可見，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEG1均能抑制小鼠的食欲而使小鼠體重降低。實(shí)施例6穩(wěn)定性的研究分別取蛋白濃度為0.8mg/ml的rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl放置于4"C，每隔6天做一次SDS-PAGE電泳(分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，上樣量為15^1，恒壓110V,電泳1.5小時(shí))，通過電泳圖譜比較rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl的穩(wěn)定性。從SDS-PAGE電泳圖譜(圖22、23)中發(fā)現(xiàn)，在不加任何保護(hù)劑的情況下，rhCNTF在4。C條件下僅12天即可完全降解，而rhCNTF-SPA-mPEGl在4°C下12天也不見任何的降解帶。說明SPA-mPEG修飾rhCNTF后能夠增加rhCNTF的穩(wěn)定性。實(shí)施例7rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl體外活性的研究將TF-1CN5al細(xì)胞(購自美國ATCC，貨號(hào)為CRL-2512)常規(guī)培養(yǎng)于GM-CSF條件(100mlRPMI1640中含500ng的GM-CSF)的培養(yǎng)液中，實(shí)驗(yàn)時(shí)收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，用無血清的RPMI1640(購自invitrogen公司，貨號(hào)為11875-101)洗液洗滌1遍，然后用10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.0xlO、每孔加50^1細(xì)胞懸液，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl按2倍系列稀釋后，每孔加入50|ul，以無血清RPMI1640培養(yǎng)基作對照，培養(yǎng)板在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)48h后，每孔加入5mg/ml的四甲基偶氮唑鹽(MTT，購自北京中原公司)溶液20pl，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后，加入酸性異丙醇(異丙醇-HCl，pH4.0)溶液，混勻后在酶標(biāo)儀上比色，測定波長為570nm，參比波長為630nm。每個(gè)實(shí)驗(yàn)取3次實(shí)驗(yàn)的平均結(jié)果。TF-1CN5al是一個(gè)依賴于GM-CSF的細(xì)胞系，其細(xì)胞表面具有rhCNTF高親和力受體，所以CNTF能促進(jìn)TF-1CN5al細(xì)胞的增殖。將不同濃度的rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl加入TF-1CN5al細(xì)胞培養(yǎng)物中，觀察細(xì)胞的生長情況，發(fā)現(xiàn)1.967xl0'7ng/ml-1.22xl(r5ng/ml的rhCNTF即明顯促進(jìn)其增殖；9.766xl(T5ng/ml-0.00625ng/ml的rhCNTF-SPA-mPEGl能促進(jìn)其增殖，見圖24、25。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，rhCNTF-SPA-mPEG1的體外活性基本沒有受到影響。實(shí)施例8修飾物的免疫反應(yīng)性以rhCNTF的單克隆抗體作為特異性抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，研究免疫反應(yīng)性。用rhCNTF的單克隆抗體(購自SIGMA公司)作為結(jié)合抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為酶標(biāo)二抗，以二氨基聯(lián)苯胺作為反應(yīng)體系(實(shí)驗(yàn)方法參見金冬雁等譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南提取》(1996版)，第888-897頁)。首先將rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl做SDS-PAGE電泳，分離膠濃度12%,濃縮膠濃度4%，上樣量為15^1，恒壓110V，電泳1.5小時(shí)，終止電泳，將凝膠轉(zhuǎn)入NC膜上，加二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)，用水終止反應(yīng)。結(jié)果表明(圖26)，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl均能夠與rhCNTF的單克隆抗體特異性結(jié)合，說明它們具有相似的免疫反應(yīng)性。修飾后沒有改變r(jià)hCNTF與抗體結(jié)合的特性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以看出，rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl均僅出現(xiàn)單一條帶，也說明了rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl均為單一組分，也間接說明了rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl具有高的純度。實(shí)施例9rhCNTF禾PrhCNTF-SPA-mPEGl的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究使用pH7.2的0.02M磷酸鹽緩沖液將rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl的蛋白濃度分別稀釋到0.2-0.3mg/ml，過濾除菌。家兔(2.02.5kg/只)隨機(jī)分為兩組，每組三只，每只每天皮下給藥一針，兩種樣品的給藥劑量均為200ug/kg。注射rhCNTF組分別于給藥后的0.5、1、3、5、6、7、24小時(shí)于耳緣靜脈采血0.5ml。分別收集于小管中，4匸過夜，第二天離心收集血清，置-2(TC冰箱中保存。采用雙抗體夾心法(方法為取CNTF單克隆抗體(購自SIGMA公司)(l|ig/ml)包被酶標(biāo)板，4。C過夜，洗滌l次；5%卵清白蛋白封閉，37t:孵育60分鐘，洗滌3次。加入2倍系列稀釋的兔血清，每孔10(^1，37'C孵育60分鐘，洗滌3次；加入酶標(biāo)記的CNTF多克隆抗體(1:100)每孔lO(Hil，37t:孵育60分鐘，洗滌6次。加入底物液ioow，室溫放置15分鐘，終止液每孔50pl，492nm波長下檢測OD值)，測定收集到的血清中rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl的濃度。結(jié)果見圖27、.28，血清中rhCNTF的濃度在lh達(dá)到最高值，隨后開始下降，7小時(shí)血清中濃度己經(jīng)很低。24h的血清濃度已經(jīng)基本降至基線。說明rhCNTF在體內(nèi)很快被降解。rhCNTF-SPA-mPEGl在4h達(dá)到最高值，隨后開始下降；從血清濃度趨勢圖上看，rhCNTF-SPA-mPEGl在48h血清中仍有分布。說明聚乙二醇類聚合物修飾后延長了rhCNTF在血循環(huán)中存在的時(shí)間。藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明(表4),rhCNTF-SPA-mPEGl的半衰期有一定的提高，為原來的16倍；清除率下降，為原來的36.26%;血槳峰濃度提高到原來的2.57倍；時(shí)量曲線下面積提高到原來的2.76倍。rhCNTF的達(dá)峰時(shí)間為lh，rhCNTF-SPA-mPEGl的達(dá)峰時(shí)間為4h。結(jié)果說明，應(yīng)用聚乙二醇類聚合物對rhCNTF進(jìn)行修飾，能夠明顯改善rhCNTF的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實(shí)施例10rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl免疫家兔后抗體水平(ELISA法測定)rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl免疫家兔后，均產(chǎn)生了不同程度的結(jié)合抗體。二種免疫原均在免后第二周誘導(dǎo)產(chǎn)生結(jié)合抗體，抗體滴度在免后四周達(dá)到最高水平，隨后開始逐漸下降。對rhCNTF和rhCNTF-SPA-mPEGl免后四周的結(jié)合抗體滴度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，rhCNTF-SPA-mPEGl誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)合抗體的能力明顯低于rhCNTF，差異具有顯著性(P<0.05)，見表5。本實(shí)驗(yàn)證明，用聚乙二醇類聚合物對rhCNTF進(jìn)行修飾可以顯著降低rhCNTF的免疫原性。表5_抗體滴度rhCNTFrhCNTF-SPA-mPEGl免后1周--免后2周5079.68±2.23251.98±4.96免后3周40637.46±1.49634.96±2.23免后4周51200±2.00a765.17±3.08b免后5周25600±2.00660.38±5.63免后6周20318.73±2.88634.96±4.231.avs.bP<0.05;2."-"檢測不到。權(quán)利要求1.一種修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，其特征在于每一分子睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子與至少一分子聚乙二醇類聚合物通過化學(xué)鍵相連接；所述聚乙二醇類聚合物為聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、甲氧基聚乙二醇-丙醛、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺α甲基丁酸酯、甲氧基聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺、甲氧基聚乙二醇-馬來酰亞胺或甲氧基聚乙二醇-乙醛；所述聚乙二醇類聚合物的分子量為1kD～100kD。2.如權(quán)利要求1所述的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，其特征在于每一分子所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子與12個(gè)分子的所述聚乙二醇類聚合物通過化學(xué)鍵相連接；所述聚乙二醇類聚合物為甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯或甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺a甲基丁酸酯；所述聚乙二醇類聚合物的分子量為5kD50kD。3.如權(quán)利要求2所述的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，其特征在于每一分子所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子與一分子甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯通過化學(xué)鍵相連接；甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺丙酸酯的分子量為20kD。4.如權(quán)利要求13任意一項(xiàng)所述的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，其特征在于，所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子是天然的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。5.如權(quán)利要求13任意一項(xiàng)所述的修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，其特征在于，所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子是天然的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的突變體或變異體。6.如權(quán)利要求5所述的修飾的睫狀祌經(jīng)營養(yǎng)因子，其特征在于，所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子為睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子第17位的半胱氨酸突變?yōu)楸彼峄蚪z氨酸而形成的突變體；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子第63位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼岫纬傻耐蛔凅w；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子中去除C末端的15個(gè)氨基酸而形成的變異體；或同時(shí)將睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子第17位的半胱氨酸突變?yōu)楸彼帷?3位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼?、去除C末端的15個(gè)氨基酸后而形成的變異體。7.—種修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的制備方法，包括將聚乙二醇類聚合物與濃度為0.5mg/mL5.5mg/mL的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子溶液混合，其中所述聚乙二醇類聚合物與所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的摩爾比為1:120:1，反應(yīng)體系的pH為79.5，在437"C下反應(yīng)0.54小時(shí)。8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述聚乙二醇類聚合物與所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子按照摩爾比為5:1混合，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)。9.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子溶液的濃度為2.0mg/mL。10.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系的pH為8。全文摘要本發(fā)明涉及一種聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子及其制備方法。該方法包括將聚乙二醇類聚合物與睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子混合反應(yīng)即可。本發(fā)明所述的聚乙二醇類聚合物修飾的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子保持了睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子在體內(nèi)的活性，并且毒副作用顯著降低，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，修飾后的睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠明顯改善睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，并且顯著降低睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子的免疫原性。文檔編號(hào)A61K47/48GK101185762SQ20071019854公開日2008年5月28日申請日期2007年12月11日優(yōu)先權(quán)日2007年12月11日發(fā)明者倪道明,江姜,張振龍申請人:北京生物制品研究所