本發(fā)明涉及體外診斷免疫檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)胃泌素釋放肽前體試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。 NSCLC 約占肺癌的80%，包括大細(xì)胞癌、腺癌和鱗癌。相比NSCLC，由于SCLC 僅占肺癌的15 － 20%，因此不管是診斷還是治療領(lǐng)域，SCLC 獲得的關(guān)注度都較低。但SCLS 卻是一種惡性化程度更高、病因更復(fù)雜的腫瘤，具有快速和侵襲性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，易發(fā)生廣泛性壞死和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
胃泌素釋放肽前體（ProGRP）作為小細(xì)胞肺癌（SCLC）新的標(biāo)記物，具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，并可準(zhǔn)確反映小細(xì)胞肺癌（SCLC）病情及對(duì)化療的反應(yīng)。因此，將對(duì)小細(xì)胞肺癌（SCLC）的診斷具有較高敏感度，特異度和準(zhǔn)確率的胃泌素釋放肽前體（ProGRP）作為提示小細(xì)胞肺癌（SCLC）的血清腫瘤標(biāo)志物，可為臨床鑒定小細(xì)胞肺癌（SCLC）提供參考依據(jù)。胃泌素釋放肽前體作為血清腫瘤標(biāo)志物，不僅可用于小細(xì)胞肺癌（SCLC）的早期診斷，還有助于用于預(yù)后評(píng)估。
目前臨床檢測(cè)胃泌素釋放肽前體的常見方法有酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫分析法、酶促化學(xué)發(fā)光法，但這些方法都存在著一些不足之處。
一、酶聯(lián)免疫吸附法
酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 被廣泛應(yīng)用，但該方法也存在著下述的不足之處：
(1) 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96 孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應(yīng)容器，在使用時(shí)只能分成12 批次、6 批次、8 批次或整板一次使用，無法進(jìn)行獨(dú)立的、單人份的檢測(cè)；
(2) 定量測(cè)定所用的試劑種類較多，每一種檢測(cè)試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時(shí)都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；
(3) 缺少對(duì)檢測(cè)信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識(shí)才能了解或知悉檢測(cè)試劑的生產(chǎn)批號(hào)及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測(cè)過程中不受控，具有很大的隨意性；
(4) 檢測(cè)試劑在檢測(cè)過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；
(5) 檢測(cè)過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯(cuò)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；
(6) 在檢測(cè)項(xiàng)目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項(xiàng)目數(shù)×48/96人份，如果需要檢測(cè)10 個(gè)項(xiàng)目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測(cè)10 個(gè)不同的項(xiàng)目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點(diǎn)。
二、放射免疫分析法
放射免疫分析方法放射性污染大、加樣步驟繁瑣、操作復(fù)雜、操作時(shí)間長(zhǎng)、測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定、試劑保存時(shí)間短、試劑盒操作自動(dòng)化程度低、配套儀器價(jià)格昂貴等不足之處。
三、化學(xué)發(fā)光法
化學(xué)發(fā)光法按發(fā)光原理可分為直接化學(xué)發(fā)光和酶促化學(xué)發(fā)光。
酶促化學(xué)發(fā)光主要有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶兩種，但都有一定的局限性，辣根過氧化物酶主要缺點(diǎn)為：魯米諾在沒有辣根過氧化物酶存在情況下，也會(huì)被H2O2氧化自身發(fā)光，本底相對(duì)較高，影響信噪比，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)復(fù)雜，影響因素多，結(jié)果不夠穩(wěn)定，要得到靈敏度高且平臺(tái)期長(zhǎng)的底物不容易。堿性磷酸酶主要缺點(diǎn)為：底物達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間長(zhǎng)，底物成本高，導(dǎo)致檢測(cè)成本高，患者負(fù)擔(dān)重。
吖啶酯作為標(biāo)記物的直接化學(xué)發(fā)光相比酶促化學(xué)發(fā)光具有明細(xì)優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在：反應(yīng)不需要催化劑，只要堿性環(huán)境即可進(jìn)行，反應(yīng)迅速，背景發(fā)光低，信噪比高，干擾因素少，試劑穩(wěn)定性好，可以兩點(diǎn)定標(biāo)，體系簡(jiǎn)單，激發(fā)液成本低，吖啶酯易與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)，且聯(lián)結(jié)后光子產(chǎn)率不減少。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
目前胃泌素釋放肽前體檢測(cè)技術(shù)存在以下缺點(diǎn)：檢測(cè)成本高、檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)線性范圍窄、重現(xiàn)性低、不能定量、操作復(fù)雜等。
本發(fā)明正是為了克服以上所述缺點(diǎn)，公開了一種檢測(cè)成本低、靈敏度高、檢測(cè)線性范圍廣、重現(xiàn)性高、可以定量、操作簡(jiǎn)單的胃泌素釋放肽前體試劑盒及其制備方法。本發(fā)明首先制備化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，主要包括：胃泌素釋放肽前體單克隆抗體包被的磁顆粒、胃泌素釋放肽前體單克隆抗體包被的吖啶酯以及胃泌素釋放肽前體定標(biāo)品；然后利用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)定標(biāo)品進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置于電腦軟件，測(cè)試實(shí)際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計(jì)算樣本濃度；最后對(duì)胃泌素釋放肽前體全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行性能（靈敏度、線性、精密度、干擾性）的評(píng)價(jià)。
本發(fā)明與目前技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明選擇吖啶酯作為標(biāo)記材料，并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學(xué)發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學(xué)發(fā)光相比，該反應(yīng)不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；
2、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)靈敏度高，能夠達(dá)到1ng/mL，相比其它的胃泌素釋放肽前體檢測(cè)方法靈敏度至少提高了10倍；
3、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達(dá)到1-1000 ng/mL，其它的胃泌素釋放肽前體化學(xué)發(fā)檢測(cè)方法的檢線性范圍為5-500 ng/mL；
4、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復(fù)性高，批內(nèi)及批間差均在5%以內(nèi)，這是其它化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達(dá)到的；
5、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線到測(cè)試軟件，只需測(cè)試樣本就可直接得到樣本的濃度值；
6、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡(jiǎn)便，減少了人為的誤差。
附圖說明
圖1為實(shí)施例3得到的胃泌素釋放肽前體標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：胃泌素釋放肽前體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒制備方法
（1）胃泌素釋放肽前體單克隆抗體包被的納米磁珠制備：
取50mg羧基化的磁微粒（粒徑為0.05-1um）懸浮液，磁分離去上清，用0.02 M，pH為5.5 MES緩沖液重懸，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5 mg 胃泌素釋放肽前體單克隆抗體，室溫下混懸2-10 h，磁分離，去除上清，用含2% BSA 的0.1M pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到胃泌素釋放肽前體單克隆抗體包被的磁顆粒，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（2）胃泌素釋放肽前體衍生物標(biāo)記的吖啶酯的制備：
取50 uL 25mg/mL的胃泌素釋放肽前體衍生物，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混勻，室溫下避光反應(yīng)，1-2 h后取出，用2 mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進(jìn)行處理，最后加入得到的胃泌素釋放肽前體衍生物標(biāo)記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到胃泌素釋放肽前體衍生物標(biāo)記的吖啶酯，每瓶5 mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（3）胃泌素釋放肽前體定標(biāo)品的制備：
用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）將胃泌素釋放肽前體配置成濃度為0 ng/mL、5 ng/mL、40ng/mL、200 ng/mL、1000 ng/mL、5000ng/mL，每瓶0.5 mL分裝凍干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(4)化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入80uL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的雙氧水(H2O2)、1.0克疊氮化鈉、1.5克吐溫20，搖勻后避光存放。
(5)化學(xué)發(fā)光激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入0.6克氫氧化鈉、0.5克PC300、0.5g疊氮化鈉、1.5克Triton 405，搖勻后避光存放。
實(shí)施例2：胃泌素釋放肽前體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法：
本發(fā)明以全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測(cè)工具，本發(fā)明的方法學(xué)模式為競(jìng)爭(zhēng)法，即儀器依次加入20 uL的樣品、50 uL的胃泌素釋放肽前體單克隆抗體包被的磁顆粒以及50 uL的胃泌素釋放肽前體包被的吖啶酯，反應(yīng)10 min后，進(jìn)行磁分離，儀器將反應(yīng)混合物送入暗室，依次加入50uL化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液、50uL化學(xué)發(fā)光激發(fā)液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，最后記錄發(fā)光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測(cè)樣品的 胃泌素釋放肽前體含量。
實(shí)施例3：胃泌素釋放肽前體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒性能評(píng)價(jià)
檢測(cè)曲線見附圖1。
靈敏度的檢測(cè)：
參照CLSI EP17-A 文件推薦實(shí)驗(yàn)方案，計(jì)算胃泌素釋放肽前體化學(xué)發(fā)光免疫層析試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為1ng/ mL。
線性的檢測(cè)：
對(duì)濃度為1 ng/mL、5 ng/mL、40ng/mL、200 ng/mL、1000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品做線性分析，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，r=0.9996，另外，該試劑盒對(duì)胃泌素釋放肽前體樣品檢測(cè)的線性范圍為1-1000ng/mL。
精密度測(cè)定：
取濃度為20ng/mL及100ng/mL兩個(gè)胃泌素釋放肽前體樣品，每個(gè)樣本每個(gè)濃度各做3個(gè)平行，用三批試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5%。
干擾性實(shí)驗(yàn)：
取混合血清分別添加干擾物包括： 結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照 1: 20 進(jìn)行，分別測(cè)定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測(cè)值，計(jì)算二者之間的偏差，以 ±10%為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達(dá)到 NCCLS 的文件標(biāo)準(zhǔn)，可用于臨床實(shí)驗(yàn)室胃泌素釋放肽前體狀況的準(zhǔn)確評(píng)估。
實(shí)施例4:胃泌素釋放肽前體化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的靈敏度對(duì)比實(shí)驗(yàn)
分別用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)濃度為0ng/mL的校準(zhǔn)品或樣本稀釋液為樣本進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定20次，得出20次測(cè)量結(jié)果的RLU值（相對(duì)發(fā)光值），計(jì)算其平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），得出M+2SD，將該發(fā)光值代入校準(zhǔn)曲線計(jì)算得到相應(yīng)的濃度值。采用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法得到的濃度值為1.0ng/ml，相對(duì)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法最低檢測(cè)限8 ng/ml，提高了約8倍。