本發(fā)明屬于分子識別和核酸適配篩選領(lǐng)域，主要借助局域表面等離子體共振(Localized Surface Plasmon Resonance technology，LSPR)個人型分子相互作用分析儀篩選出可特異結(jié)合靶標物的核酸適配體。

背景技術(shù)：

局域表面等離子體共振(LSPR)是一種全新的、高靈敏度的蛋白及分子互作分析方法。由于生物分子易在納米顆粒表面沉積，通常將1～100nm的超細粒子—納米金顆粒(AuNPs)作為LSPR傳感層固定在金屬薄膜表面。LSPR的納米金傳感器(1.5mm²)比傳統(tǒng)SPR使用的持續(xù)金膜小，其在可見光范圍內(nèi)可產(chǎn)生很強的共振吸收峰，使得顆粒周圍的局域折射率高度敏感，因此LSPR具有更短的響應(yīng)時間和更高的檢測靈敏度。LSPR不僅能用于無標記實時監(jiān)測許多種類生物分子之間的反應(yīng)，還可以準確、靈敏、快速地檢測出各種生化指標。鑒于LSPR技術(shù)的一系列卓越性能，它可以廣泛地應(yīng)用到食品、環(huán)境和分子生物學(xué)等領(lǐng)域，將直接成為實時觀測生物分子間相互作用的主導(dǎo)技術(shù)。

核酸適配體(Aptamer)是一類長度小于100nt的單鏈DNA或RNA序列，其是應(yīng)用新型組合化學(xué)技術(shù)—指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)體外從隨機寡核苷酸文庫中篩選得到能夠與靶標物高靈敏和特異性地結(jié)合的適配體。當目標分子存在時，適配體通過自身特殊而穩(wěn)定的三維折疊形成特異性的靶物質(zhì)結(jié)合位點，這使得適配體可以區(qū)分出在結(jié)構(gòu)上僅有細微差異的結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)。核酸適配體又稱為“人工抗體”，其親和力強、穩(wěn)定性好、無免疫原性，而且易于修飾和標記，已被廣泛用于檢測、分離純化和醫(yī)療三大領(lǐng)域。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明借助LSPR傳感技術(shù)，利用設(shè)計構(gòu)建的寡核苷酸文庫進行兩輪篩選，最終得到不同序列的克隆子。進一步對核酸適配體進行親和力和特異性的研究，挑選親和力最高，特異性最強的序列作為理想適配體進行研究。借助本發(fā)明LSPR-SELEX技術(shù)，可用于對不同芯片的靶標物進行核酸適配體篩選。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

基于局域表面等離子體共振技術(shù)的核酸適配體篩選方法，以納米金芯片為介質(zhì)，將靶標物固定在介質(zhì)上，再以核酸適配體為識別元素，進行核酸適配體的可視化篩選。

所述的靶標物包括但不限于小分子、蛋白或病毒。

具體的，首先，用PBS緩沖液稀釋寡核苷酸文庫，作為樣品，進樣；其次，用PBS緩沖液沖洗系統(tǒng)，以清洗除去結(jié)合力弱或未結(jié)合的寡核苷酸分子，然后，用水沖洗進樣系統(tǒng)，并用空氣排空，防止樣品在樣品管內(nèi)壁吸附；最后通入NaOH再生緩沖液，洗脫回收與靶標物特異性結(jié)合的核苷酸分子，進行PCR擴增，制備單鏈，獲得單鏈次級庫，以此進行下一輪篩選，重復(fù)篩選和PCR擴增，直至篩選出目的核酸適配體。

進樣之前，運行PBS緩沖液，至儀器達到穩(wěn)定的信號基線。

所述的進樣流速為20μL/min，時間為5min。

所述的PBS緩沖液沖洗時的流速為150μL/min，時間為5min。

所述的NaOH再生緩沖液洗脫的流速為20μL/min。

所述的NaOH再生緩沖液的濃度為10mM。

所述的PBS緩沖液濃度為10mM。

篩選出的核酸適配體可用于靶標物的定量和定性檢測。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明借助LSPR-SELEX技術(shù)，利用固體芯片在檢測過程中無需標記物，最大限度地保持了核酸適配體的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。本發(fā)明以SA為例，利用LSPR-SELEX技術(shù)篩選SA特異性結(jié)合的核苷酸序列，得到了總長度為114bp的核酸適配體SBA；結(jié)合CE實驗進行親和力表征，結(jié)果證明，此序列可與SA靶標物有很好的結(jié)合。

(2)與傳統(tǒng)的核酸適配體篩選方法相比，本發(fā)明創(chuàng)建的LSPR-SELEX傳感技術(shù)操作簡單、靈敏度高、耗時短(15min)、響應(yīng)速度快，最大的優(yōu)勢在于相互作用數(shù)據(jù)實時在線的呈現(xiàn)，能快速準確地獲悉每一輪分子間的親和力。

(3)本發(fā)明借助LSPR傳感器芯片的再生性能好，可重復(fù)利用80～100次，能夠?qū)崿F(xiàn)對多個不同濃度樣品檢測，極大降低篩選成本。

附圖說明

圖1：LSPR-SELEX篩選的適配體和靶標物的親和力鑒定結(jié)果。其中，縱坐標代表傳感器所檢測到的信號值；橫坐標代表樣品在傳感器中相互作用的時間。

A圖為第一輪篩選的核酸適配體和靶標物的親和力鑒定結(jié)果；圖中，從上到下各曲線對應(yīng)的核酸適配體濃度逐漸降低(6μM、3μM、1.5μM、0.75μM、0.375μM)。

B圖為第二輪篩選的核酸適配體和靶標物的親和力鑒定結(jié)果。圖中，從上到下各曲線對應(yīng)的核酸適配體濃度逐漸降低(10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM)。

圖2：CE-SELEX表征SBA適配體。

A：SA(250μg/mL)的電泳遷移；B：SBA(150μg/mL)的電泳遷移；C：SBA(75μg/mL)+SA(125μg/mL)的電泳遷移；D：BSA(250μg/mL)的電泳遷移；E：BSA(125μg/mL)+SBA(75μg/mL)的電泳遷移。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1 LSPR-SELEX的篩選方法

(1)將寡核苷酸文庫(兩側(cè)各含有20bp的上下游引物的固定序列，中間為80nt的隨機序列)高速離心1min。再用ddH₂O將其稀釋成100μM的原液。寡核苷酸文庫進行熱變性(95℃10min)以破壞核酸分子間形成的聚合物，冰浴5min，避免核酸發(fā)生聚合。試驗中所用溶液使用前用0.22μm的微孔濾膜過濾。

(2)實驗儀器：Open-SPR(Nicoya，Ca)，采用鏈霉親和素(SA)包被的納米金芯片，開始以150μL/min的流速運行10mM的PBS緩沖液(NaCl 4g、Na₂HPO₄·12H₂O 1.45g、KCl 0.1g、KH₂PO₄ 0.1g、ddH₂O定容至0.5L，pH7.4)，至到達穩(wěn)定的信號基線。

(3)將100μM的寡核苷酸文庫原液，用PBS緩沖液稀釋至終濃度為10μM，作為樣品。首先，注入250μL的寡核苷酸樣品，以20μL/min的流速進樣，與傳感器相互作用5min，一旦相互作用時間結(jié)束，立即通入PBS緩沖液，以150μL/min的流速，高速沖洗系統(tǒng)5min，以清洗除去結(jié)合力弱或未結(jié)合的寡核苷酸分子；然后，用水沖洗進樣系統(tǒng)，并用空氣排空，防止樣品在樣品管內(nèi)壁吸附；最后注入250μL的NaOH再生緩沖液(稱取NaOH 0.4g，ddH₂O定容至1L)，在20μL/min低流速下與傳感器芯片相互作用5min，洗脫回收與靶標物特異性結(jié)合的核苷酸分子。

實施例2 PCR擴增及單鏈的制備

(1)將洗脫回收的核苷酸分子作為次級文庫，進行PCR富集。引物序列為：P1：5’-TTGACTTGCCACTGACTACC-3’(SEQ ID NO.1)，P2：5’-GATGACGACCGACTGACTTC-3’(SEQ ID NO.2)。優(yōu)化PCR的反應(yīng)體系和程序如下：50μL的反應(yīng)體系為：20μM P1 2μL、20μM P2 2μL、2×Taq Master Mix 25μL、次級文庫21μL；PCR程序為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，61.7℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；最后72℃延伸2min，4℃保存。擴增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確后進行純化，其產(chǎn)物作為制備單鏈次級庫的模板。

(2)優(yōu)化制備單鏈次級庫的不對稱PCR，50μL的反應(yīng)體系為：20μM P2 4μL、2×Taq Master Mix 25μL、ddH₂O 19μL、模板2μL；PCR程序為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，61.7℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；最后72℃延伸2min，4℃保存。擴增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳，110V 30min，鑒定正確后對PCR產(chǎn)物進行純化，以此進行下一輪篩選。同時以同樣條件將PCR產(chǎn)物進行純化、復(fù)性。每一輪篩選后，采用TraceDrawer數(shù)據(jù)處理分析軟件進行KD的計算。

結(jié)果表明，第一輪LSPR-SELEX篩選的核酸適配體與靶標物的KD值為107μM(見圖1A)。第二輪LSPR-SELEX篩選的核酸適配體與靶標物的KD值為98nM(見圖1B)。這說明，LSPR-SELEX技術(shù)僅需兩輪篩選就能獲得親和力為98nM的核酸適配體。

實施例3克隆與測序

將第二輪LSPR-SELEX篩選得到的寡核苷酸序列連接到T載體上，進行克隆、測序，從而得到不同序列的適配體克隆株。最終以親和力最高、特異性最強的序列作為理想的適配體進行研究，命名為SBA(測序結(jié)果如SEQ ID NO.3所示)。

實施例4毛細管電泳法表征(CE)

(1)利用毛細管電泳法對LSPR-SELEX過程進行表征。實驗儀器：G7100A(Agilent Technologies，USA)；熔融石英毛細管內(nèi)徑50μM，長度56cm；運行緩沖液及樣品稀釋液均為PBS緩沖液(NaCl 8.5g、Na₂HPO₄ 2.2g、NaH₂PO₄ 0.1g、ddH₂O定容至1L，pH 7.6)

(2)使用前用1M NaOH(稱取NaOH 4g，ddH₂O定容至0.1L)、ddH₂O依次沖洗5min、20min兩遍，然后PBS緩沖液運行一次查看基線，待基線平穩(wěn)后，進行樣品分離。

(3)每個樣品不少于200μL，分別上樣SA、SBA、SA與SBA的結(jié)合物(室溫孵育30min)、BSA、BSA與SBA的結(jié)合物(室溫孵育30min)，進樣壓力為50mbar×10s，分離電壓為20KV；樣品分離20min。

通過毛細管電泳法表征，結(jié)果表明，SA+SBA混合孵育后有復(fù)合物峰的出現(xiàn)，證實了SA和SBA存在相互作用(見圖2A-C)。對照組BSA+SBA混合孵育后無復(fù)合物峰的出現(xiàn)，說明BSA和SBA不反應(yīng)(見圖2B、D-E)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 基于局域表面等離子體共振技術(shù)的核酸適配體篩選方法

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<170> PatentIn version 3.5

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ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcagatgac gaccgactga cttc 114