本發(fā)明涉及微電極生物傳感技術(shù)，具體地說，涉及一種原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物果糖含量的微電極生物傳感器及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物通過葉片進(jìn)行光合作用形成碳水化合物供給植株的生長發(fā)育需要，糖類是光合作用的主要終產(chǎn)物，研究表明，蔗糖、葡萄糖、果糖是植物體內(nèi)的主要糖類，這些糖類的合成、運(yùn)輸、積累與作物的產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)，并參與植物細(xì)胞滲透壓的調(diào)節(jié)及逆境時(shí)的信號(hào)傳導(dǎo)等。如溫暖季節(jié)設(shè)施栽培的番茄常出現(xiàn)30～35℃亞高溫現(xiàn)象，如長期處于這種溫度下，植株葉片的光合作用下降，光合產(chǎn)物形成減少，糖類物質(zhì)的代謝改變，最終導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低。因此檢測(cè)植物中的糖類物質(zhì)的含量具有重要意義。

目前植物中糖類物質(zhì)的含量多通過氣相色譜法、液相色譜法、比色法、近紅外光譜法等。這些方法多為離體、靜態(tài)的方式，需要離體取樣，對(duì)植物體造成較大的破壞；并且這種方式只能反映某一時(shí)間點(diǎn)的靜態(tài)濃度或累積效應(yīng)，不能反映植物體內(nèi)各代謝物質(zhì)在環(huán)境變化時(shí)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化。

隨著研究的深入，人們希望獲得植物中這些重要糖類物質(zhì)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化，以便更加全面、清晰的了解植物的生理活動(dòng)規(guī)律，從而更好的指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，因而有必要發(fā)展新型的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物中糖類物質(zhì)的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物中果糖含量的微電極生物傳感器及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供一種原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物中果糖含量的微電極生物傳感器，具有三電極體系，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對(duì)電極，金工作電極，所述金工作電極上吸附有果糖脫氫酶。

進(jìn)一步地，所述金工作電極上依次吸附有巰基乙酸，離子液體[Bmim]PF₆，果糖脫氫酶與鐵氰化鉀媒介體小分子的混合物，離子液體[Bmim]PF₆，果糖脫氫酶與鐵氰化鉀的混合物。

本發(fā)明所述金工作電極通過以下方法制備得到：

(1)在金工作電極上滴涂巰基乙酸TGA，得到TGA/Au電極；

(2)將離子液體[Bmim]PF₆滴涂到TGA/Au電極上,

(3)逐步滴涂果糖脫氫酶FDH和鐵氰化鉀的混合PBS溶液，室溫放置，固定果糖脫氫酶，制得單層酶電極FDH/[Bmim]PF₆/TGA/Au；

(4)再在FDH/[Bmim]PF₆/TGA/Au電極上滴涂[Bmim]PF₆，再逐步滴涂FDH和鐵氰化鉀的混合PBS溶液，制得雙層酶電極(FDH/[Bmim]PF₆)₂/TGA/Au。

在步驟(1)之前，將微電極置于0.5M稀硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(-0.2～1.6V)得到典型的循環(huán)伏安譜圖，確保電極表面清潔。

進(jìn)而，步驟(1)的巰基乙酸TGA濃度為1-5mM。

步驟(3)的果糖脫氫酶FDH濃度為10-50mg/mL，鐵氰化鉀濃度為1-10mM，所述混合PBS溶液pH7.4,室溫放置1-4h固定果糖脫氫酶。

本發(fā)明的微電極生物傳感器其微電極是通過微機(jī)電技術(shù)(MEMS)在硅片基底上制備而成，長約4-5cm，其中裸露導(dǎo)電部分長約10-20mm。本發(fā)明的微電極生物傳感器的外觀具有穿透植物組織的能力，見圖1，裸露導(dǎo)電部分長度為10-20mm。

本發(fā)明提供了上述微電極生物傳感器在原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物果糖含量中的應(yīng)用。

所述植物為作物、花卉、蔬菜或林木。

優(yōu)選地，檢測(cè)部位為植物的莖、葉、果實(shí)或嫩芽。

本發(fā)明提供了一種原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物果糖含量的方法，包括：

(1)將上述的微電極生物傳感器連接至電化學(xué)工作站，與不同濃度的果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，在工作電壓下通過計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，由濃度與電流關(guān)系獲得穩(wěn)定的監(jiān)測(cè)果糖的工作曲線；

(2)將上述的微電極生物傳感器插入待測(cè)植物組織，連接電化學(xué)工作站，獲取電流變化，導(dǎo)入工作曲線，計(jì)算被測(cè)樣本內(nèi)果糖的濃度。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，上述方法的步驟(1)，具體為分別配制濃度為0.1、0.5、1、5、10、50、100mM果糖的PBS(pH＝7.4)溶液，選擇0.25V作為工作電位，使用制備的酶電極進(jìn)行計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)，得到一組濃度與電流的關(guān)系曲線，制作果糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.24x+0.04958(r＝0.9826)。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種基于微型生物傳感技術(shù)的植物體內(nèi)果糖含量的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法，從而更全面、深入地了解植物體內(nèi)果糖的調(diào)節(jié)規(guī)律及作用機(jī)制。本發(fā)明在工作電極通過滴涂方法組裝巰基乙酸，然后吸附離子液體[Bmim]PF6，進(jìn)一步修飾果糖脫氫酶與鐵氰化鉀媒介體小分子的混合物，之后重復(fù)這一過程，實(shí)現(xiàn)離子液體與果糖脫氫酶的多層修飾工作電極，果糖脫氫酶可以催化D-果糖生成5-keto-D-果糖，通過計(jì)時(shí)電流法記錄酶對(duì)果糖變化的實(shí)時(shí)響應(yīng)。應(yīng)用本發(fā)明的微電極生物傳感器可實(shí)現(xiàn)原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)植物中果糖含量，對(duì)被測(cè)樣本不造成本質(zhì)傷害；得到的數(shù)據(jù)結(jié)果可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的反映植物體內(nèi)果糖的含量變化，實(shí)際應(yīng)用操作簡(jiǎn)便，易于掌握。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述微電極生物傳感器三電極體系外觀結(jié)構(gòu)圖以及金工作電極的制備與檢測(cè)果糖的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1工作電極的制備

(1)微電極陣列通過微機(jī)電加工技術(shù)(MEMS)制備，在硅片基底上制備而成，長約4-5cm，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對(duì)電極及金工作電極，其中裸露導(dǎo)電部分長約10-20mm；將微電極置于0.5M稀硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(-0.2～1.6V)得到典型的循環(huán)伏安譜圖，確保電極表面清潔。

(2)在金工作電極上滴涂1mM巰基乙酸(TGA)，得到TGA/Au電極。

(3)然后將離子液體[Bmim]PF₆滴涂到TGA/Au電極上,再逐步滴涂40mg/mL果糖脫氫酶(FDH)和1mM鐵氰化鉀媒介體的PBS溶液(pH7.4),室溫放置2h，固定果糖脫氫酶，制得單層酶電極FDH/[Bmim]PF₆/TGA/Au。

(4)再次在FDH/[Bmim]PF₆/TGA/Au電極上滴涂[Bmim]PF₆,再逐步滴涂FDH和鐵氰化鉀的混合溶液(PBS,pH7.4),制得雙層酶電極(FDH/[Bmim]PF₆)₂/TGA/Au。

實(shí)施例2微電極生物傳感器的應(yīng)用

(1)分別配制濃度為0.1、0.5、1、5、10、50、100mM果糖的PBS(pH＝7.4)溶液，選擇0.25V作為工作電位，使用含有實(shí)施例1制備的酶電極的生物傳感器進(jìn)行計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)，得到一組濃度與電流的關(guān)系曲線，制作果糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.24x+0.04958(r＝0.9826)，線性范圍為0.1-100mM。

(2)實(shí)驗(yàn)材料選擇盆栽甜玉米，以乳熟期甜玉米果實(shí)為檢測(cè)對(duì)象，將微電極隨機(jī)插入甜玉米的玉米粒中，連接電化學(xué)工作站，通過計(jì)時(shí)電流法，在0.25V的工作電壓下記錄3天內(nèi)乳熟期甜玉米中果糖濃度的實(shí)時(shí)變化。

(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比選擇乳熟期兩個(gè)不同品種普甜E22和T26的甜玉米籽粒，用高壓液相色譜法在某一時(shí)間點(diǎn)對(duì)其果糖含量進(jìn)行檢測(cè)，與本發(fā)明的電化學(xué)方法同一時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)即時(shí)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，如下表1所示。結(jié)果表明該微電極傳感方法檢測(cè)結(jié)果可靠。

表1測(cè)試結(jié)果對(duì)比

由上表看出，利用微電極在線檢測(cè)玉米粒中果糖含量與傳統(tǒng)HPLC方法測(cè)量結(jié)果數(shù)據(jù)基本吻合。該方法數(shù)據(jù)可靠、選擇性高，可實(shí)現(xiàn)對(duì)果糖高度靈敏、專一的識(shí)別，適用于植物的莖、葉、果實(shí)等不同組織部位，可實(shí)現(xiàn)植物體內(nèi)果糖的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，有助于了解果糖參與植物生命活動(dòng)的調(diào)控規(guī)律及作用機(jī)制。

實(shí)施例3

1)用實(shí)施例1制得的雙層酶電極(FDH/[Bmim]PF₆)₂/TGA/Au，在0.25V的工作電位下，連續(xù)檢測(cè)不同濃度果糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1、0.5、1、5、10、50、100mM)，得到果糖濃度與電流的關(guān)系曲線，同實(shí)施例2。

2)將微電極隨機(jī)插入乳熟期兩個(gè)不同品種甜玉米普甜E22和T26的玉米粒中，連接電化學(xué)工作站，通過計(jì)時(shí)電流法，在0.25V的工作電壓下記錄一定時(shí)間內(nèi)乳熟期甜玉米中果糖濃度的實(shí)時(shí)變化。本發(fā)明制備的在線監(jiān)測(cè)傳感器采樣間隔為0.1秒，可實(shí)時(shí)反應(yīng)出玉米粒在一定時(shí)間段內(nèi)的果糖的動(dòng)態(tài)變化。而HPLC方法則只能對(duì)某幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣，經(jīng)過復(fù)雜的處理過程再進(jìn)行檢測(cè)，需要的采樣量多，而得到的信息量少，不能實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化信息的采集，某些情況下可能丟失重要信息。

對(duì)比例1

(1)在清潔后的金工作電極上滴涂1mM巰基乙酸(TGA)，得到TGA/Au電極。

(2)然后將離子液體[Bmim]PF₆滴涂到TGA/Au電極上,再逐步滴涂40mg/mL果糖脫氫酶(FDH)和1mM鐵氰化鉀媒介體的PBS溶液(pH7.4),室溫放置2h，固定果糖脫氫酶，制得單層酶電極FDH/[Bmim]PF₆/TGA/Au。

(3)分別配制濃度為0.1、0.5、1、5、10、50、100mM果糖的PBS(pH＝7.4)溶液，選擇0.25V作為工作電位，使用制備的酶電極進(jìn)行計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)，得到果糖濃度與電流的關(guān)系曲線為y＝0.16x+0.7366(r＝0.9796)，與修飾了雙層FDH/[Bmim]PF₆的酶電極相比，靈敏度降為0.16，檢測(cè)范圍變?yōu)?-50mM。

(4)以乳熟期甜玉米果實(shí)為檢測(cè)對(duì)象，將微電極隨機(jī)插入甜玉米的玉米粒中，連接電化學(xué)工作站，通過計(jì)時(shí)電流法，在0.25V的工作電壓下，記錄3天內(nèi)乳熟期甜玉米中果糖濃度的實(shí)時(shí)變化，取某一時(shí)間點(diǎn)的即時(shí)濃度與同一時(shí)間點(diǎn)的HPLC的檢測(cè)結(jié)果相比，偏差變大。

表2測(cè)試結(jié)果對(duì)比

對(duì)比例2

(1)在清潔后的金工作電極上滴涂1mM巰基乙酸(TGA)，得到TGA/Au電極。

(2)然后逐步滴涂40mg/mL果糖脫氫酶(FDH)和1mM鐵氰化鉀媒介體的PBS溶液(pH7.4),室溫放置2h，固定果糖脫氫酶，制得單層酶電極FDH/TGA/Au。

(3)分別配制濃度為0.1、0.5、1、5、10、50、100mM果糖的PBS(pH＝7.4)溶液，選擇0.25V作為工作電位，使用制備的酶電極進(jìn)行計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)，得到果糖濃度與電流的關(guān)系曲線為y＝0.096x-0.7938(r＝0.9855)，與修飾了雙層FDH/[Bmim]PF₆的酶電極相比，靈敏度降為0.096，檢測(cè)范圍變?yōu)?-40mM。

(4)以乳熟期甜玉米果實(shí)為檢測(cè)對(duì)象，將微電極隨機(jī)插入甜玉米的玉米粒中，連接電化學(xué)工作站，通過計(jì)時(shí)電流法，在0.25V的工作電壓下，記錄3天內(nèi)乳熟期甜玉米中果糖濃度的實(shí)時(shí)變化，有些時(shí)間段的結(jié)果檢測(cè)不到。取某一時(shí)間點(diǎn)的即時(shí)濃度與同一時(shí)間點(diǎn)的HPLC的檢測(cè)結(jié)果相比，偏差變大。

表3測(cè)試結(jié)果對(duì)比

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。