本發(fā)明涉及表面等離子體基元及表面增強(qiáng)拉曼領(lǐng)域，大面積周期性納米縫隙陣列結(jié)構(gòu)激發(fā)等離子體共振和表面增強(qiáng)拉曼，以及一種復(fù)合表面等離子體共振及表面增強(qiáng)拉曼的顯微成像技術(shù)。

背景技術(shù)：

表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）是光子入射到貴金屬表面從而導(dǎo)致金屬中的電子隨著電場(chǎng)發(fā)生振蕩的一種量子光電現(xiàn)象。SPR技術(shù)通過測(cè)量金屬界面上發(fā)生生物物質(zhì)相互作用后，表面有效折射率的變化所導(dǎo)致的激發(fā)耦合條件的變化來檢測(cè)生物分子，是一種間接測(cè)量；而拉曼信號(hào)檢測(cè)則是一種完全的直接測(cè)量。拉曼散射是待測(cè)樣品對(duì)入射光的非彈性散射，其實(shí)質(zhì)是當(dāng)光子與分子發(fā)生非彈性碰撞時(shí)，光子將能量傳遞給待測(cè)分子后，分子能態(tài)發(fā)生躍遷及輻射，揭示分子的振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的光譜技術(shù)。拉曼光譜提供了待測(cè)材料中分子固有的振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)模式，直接反應(yīng)待測(cè)樣品的分子結(jié)構(gòu)。然而拉曼散射是一種弱散射過程，其探測(cè)受限于背景噪聲和熒光背景。拉曼散射截面約為10^-30cm2，而熒光過程的散射截面約為10^-15cm2；相對(duì)于拉曼散射，熒光信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于拉曼散射，這也是目前熒光技術(shù)更為普遍應(yīng)用的原因。拉曼信號(hào)電磁場(chǎng)增強(qiáng)是一種通過局域電場(chǎng)（如粗糙的金屬表面能夠產(chǎn)生增強(qiáng)的局域電場(chǎng)）所引發(fā)的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)；這種所謂的表面增強(qiáng)拉曼散射（Surface-enhanced Raman Scattering, SERS）所產(chǎn)生的信號(hào)與分子所處光電場(chǎng)強(qiáng)度的四次方成正比。顯然，拉曼信號(hào)的增強(qiáng)依賴于局域電場(chǎng)的增強(qiáng)，而局域電場(chǎng)集中在納米共振結(jié)構(gòu)附近，因此SERS適用于表面附著分子或者細(xì)胞表面的蛋白分子的直接分辨及檢測(cè)。

鑒于SPR技術(shù)對(duì)生物分子的間接檢測(cè)與拉曼光譜對(duì)分子的直接分辨，近年來不斷有科研工作者探討SPR拉曼增強(qiáng)，或?qū)⒔Y(jié)合兩種模式的雙模式結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)已有研究將銀納米粒嵌入光柵結(jié)構(gòu)用以激發(fā)表面等離子體，增強(qiáng)納米顆粒間的局域場(chǎng)從而進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)。然而，該方法所使用的銀顆粒層是隨機(jī)形成的，無法精確控制納米粒子位置及間隙形成方式，因此檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性低，以致無法進(jìn)行實(shí)用化應(yīng)用。另外，有研究制作了周期性金納米蝴蝶結(jié)結(jié)構(gòu)來形成SPR與SERS基底；周期性結(jié)構(gòu)激發(fā)表面等離子體，而蝴蝶結(jié)結(jié)構(gòu)激發(fā)偶極共振，形成強(qiáng)局域電場(chǎng)增強(qiáng)拉曼信號(hào)。然而納米結(jié)構(gòu)蝴蝶結(jié)制作工藝繁瑣，需要用電子束光刻或離子束刻蝕的方法制作，昂貴的制作成本根本無法實(shí)用化推廣。雖然采用納米壓印方法可以降低其制作成本，但其納米結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)移過程中，精度無法保證。有研究采用111晶向在硅基底上進(jìn)行濕法刻蝕得到周期性的三角結(jié)構(gòu)，利用金屬周期性結(jié)構(gòu)激發(fā)表面等離子體局域電場(chǎng)增強(qiáng)拉曼。此方法能達(dá)到80%拉曼信號(hào)檢測(cè)重復(fù)率，基本達(dá)到實(shí)用化要求。但其增強(qiáng)方式僅通過表面等離子共振增強(qiáng)拉曼信號(hào)，缺少納米結(jié)構(gòu)增強(qiáng)局域場(chǎng)強(qiáng)，導(dǎo)致增強(qiáng)率不高，無法進(jìn)行高精度的生物檢測(cè)。

以上這些方法都能一定程度上實(shí)現(xiàn)表面等離子體增強(qiáng)拉曼檢測(cè)或表面等離子體與表面拉曼增強(qiáng)的同時(shí)檢測(cè)，但目前存在制作成本高、精度低、可實(shí)用性差等缺點(diǎn)；另外，SPR-SERS系統(tǒng)協(xié)同進(jìn)行顯微成像還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對(duì)上述存在的問題，提供一種高精度、可實(shí)用化的復(fù)合表面等離子體共振及表面增強(qiáng)拉曼的顯微成像技術(shù)，于同一芯片實(shí)現(xiàn)表面等離子體共振的高效激發(fā)和表面局域場(chǎng)的超增強(qiáng)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：組裝SPR-SERS 綜合顯微成像系統(tǒng)，利用納米狹縫陣列光柵雙模結(jié)構(gòu)同時(shí)激發(fā)與檢測(cè)SPR和SERS。

SPR-SERS綜合顯微成像系統(tǒng)如圖1所示。在普通顯微鏡白光照明光路之外引入激光，以在SPR-SERS復(fù)合功能芯片上激發(fā)表面等離體共振，用于感應(yīng)其上的生物樣品；此激光能同時(shí)激發(fā)局域電場(chǎng)增強(qiáng)，激勵(lì)生物樣品產(chǎn)生表面增強(qiáng)拉曼散射；這兩類信號(hào)經(jīng)過顯微物鏡信號(hào)收集系統(tǒng)，光路分離進(jìn)而各自進(jìn)行成像顯示及數(shù)據(jù)分析。

采用大面積納米狹縫陣列光柵結(jié)構(gòu)作為SPR-SERS復(fù)合芯片，如圖2所示，其一個(gè)周期內(nèi)存在兩個(gè)10納米量級(jí)的納米間隙以產(chǎn)生強(qiáng)局域場(chǎng)。激發(fā)光波經(jīng)光柵結(jié)構(gòu)高效激發(fā)SPR：對(duì)于顯微照明系統(tǒng)，如圖3，平行激光經(jīng)顯微物鏡聚焦，匯聚于芯片上，到達(dá)芯片的入射光包括由零度到物鏡所確定的孔徑角，方位角為零度到360度的錐形內(nèi)的所有光束；激光入射方向在孔徑角與方位角的變化，提供了SPR檢測(cè)所需要的變量掃描，即孔徑角與方位角角度分布中出現(xiàn)代表SPR激發(fā)的暗帶（見圖3（b））。SPR在金屬表面?zhèn)鞑ミ^程中與納米間隙產(chǎn)生偶極振蕩，SPR產(chǎn)生的表面電場(chǎng)與納米狹縫偶極共同作用增強(qiáng)表面局域電場(chǎng)獲得增強(qiáng)的拉曼信號(hào)。

具體檢測(cè)包括：照明白光（未畫出）經(jīng)分光棱鏡3分光后由透鏡4聚焦成像在接收屏5上，進(jìn)行一般成像檢查，包括樣品對(duì)焦、區(qū)域選擇及樣品輪廓觀察等。人眼1可通過透鏡2聚焦在焦面上的像直接觀察成像。在普通顯微鏡白光照明光路之外引入兩種波長(zhǎng)的激光15（例如從兩個(gè)端口應(yīng)用同樣的光路系統(tǒng)，分別引入633納米及785納米激光），經(jīng)一組透鏡14與12成平行光，其中采用位相擴(kuò)散器13去除光的空間相干性以消除激光成像像斑（SPR成像用），位相片11、偏振片10用以調(diào)制偏振狀態(tài)。平行激光光束經(jīng)分光棱鏡7導(dǎo)入顯微物鏡8，聚焦在樣品臺(tái)9上的納米狹縫陣列光柵SPR-SERS芯片區(qū)域。聚焦在SPR-SERS芯片區(qū)域上的光線經(jīng)顯微物鏡8收集反射光束后再經(jīng)過分光棱鏡7導(dǎo)入下一分光棱鏡6。平行光束經(jīng)過濾波片16分別進(jìn)入SPR成像系統(tǒng)和SERS檢測(cè)系統(tǒng)：激發(fā)SPR的一路平行光束全部通過濾波片16由透鏡17聚焦導(dǎo)入CCD相機(jī)（Charge Coupled Device, 電荷耦合器件）相機(jī)18，由CCD相機(jī)接收SPR信號(hào)（傅里葉變換平面）電腦顯示SPR像，通過測(cè)量代表SPR激發(fā)的兩條暗帶（如圖3（b））表征激發(fā)角度的移動(dòng)；拉曼散射光線由濾波片16全部反射而經(jīng)過反射鏡19改變光路的方向，再經(jīng)過濾波片20后由透鏡21聚焦在拉曼檢測(cè)區(qū)域（包括光柵23、24和CCD相機(jī)25）26上的狹縫22，由拉曼檢測(cè)區(qū)域26接收拉曼光譜的信號(hào)，分析分子的本征峰以直接分辨分子。

綜上所述，本發(fā)明的關(guān)鍵為：將表面等離子共振激發(fā)以及表面增強(qiáng)拉曼激發(fā)在同一芯片上實(shí)現(xiàn)，利用顯微鏡成像，實(shí)現(xiàn)表面等離子體與表面增強(qiáng)拉曼的同時(shí)檢測(cè)。通過測(cè)量SPR峰位的移動(dòng)判定激發(fā)角度的變化，以確定芯片表面生物分子反應(yīng)所引起的表面有效折射率的改變。同時(shí)，金屬表面SPR與納米縫隙的耦合所導(dǎo)致的強(qiáng)局域場(chǎng)，可以用來測(cè)量拉曼光譜以直接分辨生物分子本身。SPR間接測(cè)量與拉曼信號(hào)的直接判定，為精確判定感應(yīng)表面上的生物反應(yīng)增加了確定性。綜上，本發(fā)明提出的復(fù)合顯微成像技術(shù)具有成本低、精度高、可實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于生物檢測(cè)等領(lǐng)域。

附圖說明

本發(fā)明將通過例子并參照附圖的方式說明，其中：

圖1為SPR-SERS雙模芯片復(fù)合顯微成像示意圖。1為人眼，2、4、12、14、17、21為透鏡，3、6、7為分光棱鏡，5為接收屏，8為顯微物鏡，9為樣品臺(tái)，10為偏振片，11為位相片，13為位相擴(kuò)散器，15為激光，16、20為濾波片，18、25為CCD相機(jī)，19為反射鏡，22為狹縫，23、24為光柵，26為拉曼檢測(cè)區(qū)域。

圖2（a）為原子力顯微鏡測(cè)量的復(fù)合芯片面型示意圖。顯示納米縫隙陣列結(jié)構(gòu)及納米縫隙，圖中斜線區(qū)域的高度信息如圖2（b）。

圖2（b）為復(fù)合芯片的狹縫掃描圖。狹縫掃描圖對(duì)應(yīng)于圖2（a）中面型示意圖中的斜線區(qū)域代表的高度信息。

圖3（a）為顯微鏡示意圖。為物鏡光軸與實(shí)際光線之間的夾角，為錐形光束內(nèi)某一光線投影到圓平面上與x軸方向所成方位角，方位角從0度到360度變化；坐標(biāo)描述在圖3（b）中。

圖3（b）為入射角為時(shí)的SPR像。圖中白色圓圈線表示SPR的傅里葉變換平面，兩條黑色暗帶代表SPR激發(fā)。圖中x軸方向沿逆時(shí)針繞一圈，對(duì)應(yīng)方位角從0度到360度變化；在x軸方向從圓心沿徑向往外分別對(duì)應(yīng)孔徑角從0度到正負(fù)最大孔徑角處。

圖4為SPR激發(fā)檢測(cè)平臺(tái)示意圖。15為激光，27為40倍、數(shù)值孔徑0.65的顯微物鏡，28為透鏡，7為分光棱鏡，8為40倍、數(shù)值孔徑為0.65或100倍、數(shù)值孔徑為0.85的顯微物鏡，9為樣品臺(tái)，17為透鏡，18為CCD相機(jī)，29為計(jì)算機(jī)。

圖5為不同電介質(zhì)下的SPR像。金屬光柵上的周圍媒介，由空氣（air）、純水（H2O）、1%、10%、25%、50%、75%容積比乙二醇到純乙二醇（Ey_Gl）變化，對(duì)應(yīng)代表SPR激發(fā)的暗帶由外側(cè)向中心處移動(dòng)。

圖6為不同電介質(zhì)下SPR激發(fā)角度隨復(fù)合折射變化的關(guān)系曲線。SPR表面電介質(zhì)從純水、1%乙二醇到100%乙二醇變化時(shí)，激發(fā)角度隨復(fù)合折射率的變化關(guān)系；給出7個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)及線性擬合曲線。

圖7為不同濃度苯硫酚溶液下SPR激發(fā)角度變化曲線。電介質(zhì)溶液中苯硫酚溶液濃度（單位為摩爾M）從0M、10^-2M、10^-1M、1M、10M變化時(shí)，SPR激發(fā)角度隨苯硫酚溶液濃度的變化關(guān)系；給出5個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)及線性擬合曲線。

圖8為不同濃度苯硫酚溶液下的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜圖。從下到上依次對(duì)應(yīng)苯硫酚濃度為10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M的四條拉曼光譜。

圖9為特征峰位1023cm^-1的絕對(duì)強(qiáng)度平均值隨苯硫酚溶液濃度的變化關(guān)系。電介質(zhì)溶液中苯硫酚溶液濃度10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M變化，1023cm^-1峰位絕對(duì)強(qiáng)度平均值隨苯硫酚濃度的變化；給出4個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)及線性擬合曲線。

圖中標(biāo)記為：1人眼；2透鏡；3分光棱鏡；4透鏡；5接收屏；6分光棱鏡；7分光棱鏡；8顯微物鏡；9樣品臺(tái)；10偏振片；11位相片；12透鏡；13位相擴(kuò)散器激光；14透鏡；15激光；16濾波片；17透鏡；18 CCD相機(jī)；19反射鏡；20濾波片；21透鏡；22狹縫；23光柵；24光柵；25 CCD相機(jī)；26拉曼檢測(cè)區(qū)域；27 40x/0.65顯微物鏡；28透鏡；29計(jì)算機(jī)；air指煤質(zhì)為空氣；H2O指煤質(zhì)為純水；1%指煤質(zhì)為乙二醇比純水容積比為百分之一；10%指煤質(zhì)為乙二醇比純水容積比為百分之十；25%指煤質(zhì)為乙二醇比純水容積比為百分之二十五；50%指煤質(zhì)為乙二醇比純水容積比為百分之五十；75%指煤質(zhì)為乙二醇比純水容積比為百分之七十五；100%指煤質(zhì)為乙二醇比純水容積比為百分之一百。

具體實(shí)施方式

本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。

本說明書中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即除非特別敘述，每個(gè)特征只是一系列等效或類似特征中的一個(gè)例子而已。

采用圖2所示復(fù)合生物芯片：普通光柵結(jié)構(gòu)經(jīng)參數(shù)耦合后形成新的光柵，新舊光柵之間形成納米間隙，一個(gè)周期內(nèi)存在兩個(gè)10納米量級(jí)的納米間隙；復(fù)合芯片為光柵周期大約400或600納米的縫隙陣列結(jié)構(gòu)，對(duì)應(yīng)SPR激發(fā)波長(zhǎng)分別為633或785納米。對(duì)于顯微照明系統(tǒng)，平行光經(jīng)顯微物鏡聚焦，匯聚于芯片上，到達(dá)芯片的入射光包括由零度到物鏡所確定的孔徑角，方位角為0度到360度的錐形內(nèi)的所有光束。顯微鏡將入射平面波聚焦成錐形分布，入射角范圍為，為入射光波的最大孔徑角（由物鏡的數(shù)值孔徑NA決定）， ，其中n為入射媒介折射率。如圖3（a）所示，入射平行光轉(zhuǎn)換為入射角為，入射面（對(duì)應(yīng)方位角）為0-360?的無數(shù)組光波。入射方向在孔徑角與方位角的變化，提供了SPR檢測(cè)所需要的變量掃描，即孔徑角與方位角角度分布中出現(xiàn)代表SPR激發(fā)的如圖3（b）所示的暗帶。由顯微鏡示意圖可知，入射角分布是對(duì)稱的，若以一側(cè)入射角激發(fā)SPR波，必存在一相反入射角激發(fā)另一反向傳播的SPR波。

復(fù)合雙模芯片的SPR激發(fā)檢測(cè)平臺(tái)如圖4所示。633nm或785nm波長(zhǎng)激光15經(jīng)顯微物鏡27（40x/0.65）及透鏡28濾波、準(zhǔn)直后成為平行光，經(jīng)分光棱鏡7導(dǎo)入顯微物鏡8（40x/0.65或100x/0.85）聚焦于樣片上（其置于樣品臺(tái)9）。芯片上的光線反射回來經(jīng)過物鏡8，分光棱鏡7后改變方向，由透鏡17聚焦，在其傅里葉變換平面上用CCD相機(jī)18接收SPR信號(hào)，計(jì)算機(jī)29記錄CCD相機(jī)18的成像信息。在此檢測(cè)平臺(tái)上進(jìn)行SPR體折射率標(biāo)定和面折射率靈敏度測(cè)試。

進(jìn)行SPR體折射率靈敏度標(biāo)定：不同濃度百分比乙二醇溶液分別按照乙二醇與去離子水的容積比例為0%、1%、10%、25%、50%、75%、100%配置樣品；在進(jìn)行每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)試時(shí)，將溶液用移液管取出，滴在芯片上，周圍放置墊片，蓋上一片蓋玻片以保證液樣厚度為100微米。選用785納米激光作為激發(fā)光源，通過40x/0.65顯微物鏡收集反射光，改變金屬光柵上的媒介，由空氣、純水、1%乙二醇到100%乙二醇變化，得到不同濃度下的顯微SPR像（傅里葉面，成像透鏡的焦面），如圖5；通過容積比的關(guān)系，根據(jù)n復(fù)合折射率=水容積百分比n水+乙二醇容積百分比n乙二醇可計(jì)算出785納米波長(zhǎng)下混合溶液的折射率；線性擬合SPR表面電介質(zhì)從純水、1%乙二醇到100%乙二醇變化時(shí)，激發(fā)角度隨復(fù)合折射率的變化關(guān)系如圖6，計(jì)算可得每變化單位折射率（Refractive Index Unit, RIU）時(shí)激發(fā)角度改變69.8°，復(fù)合芯片的SPR體折射率靈敏度S=69.8°/RIU。

選用具有文獻(xiàn)中普遍采用的拉曼標(biāo)識(shí)材料苯硫酚來進(jìn)行復(fù)合芯片的測(cè)試證明。SPR生物檢測(cè)是測(cè)量金屬表面反應(yīng)所引起的表面有效折射率的變化，因此，反映SPR檢測(cè)性能的物理量是其表面折射率靈敏度，即表面分子層吸附靈敏度。苯硫酚中的硫原子與金屬結(jié)合形成單分子層；金屬上結(jié)合單分子層的面密度與苯硫酚溶液的濃度成正比關(guān)系。用移液器取苯硫酚溶液于分析純乙醇中得到溶度分別為10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M、10^-2M、10^-1M、1M的苯硫酚稀釋液，置于超聲清洗機(jī)中用60%功率常溫超聲2分鐘，讓苯硫酚分子均勻分布在溶液中。

在進(jìn)行每個(gè)SPR濃度點(diǎn)測(cè)試前，將芯片分別依次放入上述所配10^-2M、10^-1M、1M、10M苯硫酚溶液中，浸泡2小時(shí)讓其表面吸附苯硫酚分子。浸泡后從苯硫酚溶液中取出樣片，放入乙醇溶液中漂洗2-3秒后取出。將漂洗后的樣片放入氮?dú)飧稍锕裰?，在氮?dú)饬髦懈稍锖鬁y(cè)試備用。取復(fù)合測(cè)試樣片于樣品臺(tái)9上，用100x/0.85顯微物鏡進(jìn)行聚焦激發(fā)SPR。 按照上述測(cè)試過程測(cè)定復(fù)合芯片在未沉積苯硫酚溶液時(shí)的SPR信號(hào)，作為濃度為0 M的參考點(diǎn)。

在進(jìn)行每個(gè)拉曼濃度點(diǎn)測(cè)試前，將芯片放入10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M苯硫酚溶液中浸泡4小時(shí)后取出，在乙醇溶液中漂洗2-3秒后取出。將漂洗后的樣片放入氮?dú)飧稍锕裰?，在氮?dú)饬髦懈稍锖鬁y(cè)試備用。用鑷子將測(cè)試樣片放到拉曼-原子力聯(lián)用系統(tǒng)拉曼檢測(cè)平臺(tái)的樣品臺(tái)上，以633納米或785納米波長(zhǎng)激光作為激發(fā)光源，到達(dá)樣品的激光功率為0.1毫瓦、2.5毫瓦。用50x/0.5物鏡進(jìn)行聚焦，激發(fā)光斑大小為2，掃描3次，積分3秒。

取測(cè)試樣片于圖4所示樣品臺(tái)9上，用100x/0.85顯微物鏡進(jìn)行聚焦激發(fā)SPR，選用633納米激光作為激發(fā)光源。據(jù)前述樣品準(zhǔn)備方法，將待測(cè)樣片進(jìn)行0M苯硫酚濃度的SPR復(fù)合芯片測(cè)試；再依次進(jìn)行10^-2M、10^-1M、1M、10M苯硫酚濃度溶液浸泡處理的SPR復(fù)合芯片進(jìn)行測(cè)試。

當(dāng)電介質(zhì)溶液中苯硫酚溶液濃度從0M、10^-2M、10^-1M、1M、10M變化時(shí)，SPR激發(fā)角度隨苯硫酚溶液濃度的變化關(guān)系如圖7所示，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表測(cè)試樣品區(qū)域上4個(gè)不同位置的平均值，測(cè)量中的標(biāo)準(zhǔn)偏差值以誤差棒給出；斜線為以各濃度下的SPR激發(fā)角度的平均值擬合的線性曲線。當(dāng)苯硫酚濃度較低時(shí)，如10^-2M、10^-1M；當(dāng)苯硫酚濃度為10M時(shí)，SPR激發(fā)角度偏差較大。根據(jù)線性擬合方程，每改變單位濃度激發(fā)角度改變1.5°，復(fù)合芯片的表面感應(yīng)靈敏度S _surface=1.5°/M。

應(yīng)用復(fù)合芯片，可同時(shí)獲得SPR及拉曼散射檢測(cè)，只需將反射信號(hào)通入拉曼光譜儀，而SPR信號(hào)導(dǎo)入SPR成像儀中。采用的拉曼-原子力聯(lián)用系統(tǒng)拉曼檢測(cè)平臺(tái)同圖1拉曼檢測(cè)部分原理相同。考慮到復(fù)合芯片對(duì)高濃度苯硫酚分子非常敏感，激發(fā)強(qiáng)度達(dá)到飽和，采用低濃度苯硫酚溶液進(jìn)行拉曼檢測(cè)。用50x/0.5 物鏡進(jìn)行聚焦，聚焦光斑大小為2微米，掃描3次，積分3秒. 如圖8所示為10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M濃度苯硫酚溶液下的拉曼光譜圖。從下到上依次對(duì)應(yīng)10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M四條拉曼光譜，苯硫酚各特征峰明顯；隨著苯硫酚濃度的降低，拉曼光強(qiáng)隨之降低。當(dāng)濃度降低到10^-15M時(shí)，仍可以檢測(cè)到較強(qiáng)的拉曼信號(hào)。拉曼譜中特征峰及高的信噪比，顯示高出的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)，SERS的增強(qiáng)因子為10⁶。

取特征峰位的絕對(duì)強(qiáng)度平均值隨苯硫酚溶液濃度的變化關(guān)系做圖9。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表測(cè)試樣品區(qū)域拉曼光譜1023cm^-1峰位的絕對(duì)強(qiáng)度平均值，其中對(duì)每個(gè)濃度點(diǎn)掃描三次并取平均值；斜線為各濃度下1023cm^-1峰位絕對(duì)強(qiáng)度值的線性擬合曲線，；標(biāo)準(zhǔn)偏差以圖中的誤差線標(biāo)出。當(dāng)苯硫酚濃度較高時(shí)，如10^-4M、10^-3M；絕對(duì)強(qiáng)度由于濃度飽和而偏差較大。

結(jié)合圖4所示的SPR顯微成像裝置及商用拉曼顯微系統(tǒng)，應(yīng)用納米狹縫陣列光柵結(jié)構(gòu)，在同一芯片實(shí)現(xiàn)了表面等離子SPR檢測(cè)與表面增強(qiáng)拉曼散射SERS檢測(cè)。應(yīng)用本發(fā)明圖1的顯微系統(tǒng)，結(jié)合大面積納米狹縫陣列光柵結(jié)構(gòu)作為SPR-SERS復(fù)合芯片，即可在同一SPR-SERS芯片上，同時(shí)實(shí)現(xiàn)SPR與拉曼的高效、高靈敏度檢測(cè)。

本發(fā)明并不局限于前述的具體實(shí)施方式。本發(fā)明擴(kuò)展到任何在本說明書中披露的新特征或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過程的步驟或任何新的組合。