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一種表面等離子體共振傳感芯片及其制備方法和應用

文檔序號:10651930閱讀:1038來源:國知局
一種表面等離子體共振傳感芯片及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表面等離子體共振傳感芯片及其制備方法和應用。該制備方法包括:(1)清洗玻璃基片后烘干;(2)制備鉻膜,再在鉻膜上制備金膜,得裸金芯片;(3)滴加含改性牛血清白蛋白的溶液,使鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應0.5~2小時后清洗干燥;(4)滴加NHS和EDC的混合溶液,使鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應15分鐘~1小時后清洗干燥;(5)滴加溴乙酸溶液,使鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應8~24小時后清洗干燥,得空白芯片。本發(fā)明的制備方法只需2天即可完成,且得到的芯片比傳統(tǒng)葡聚糖芯片(需要5天制備)具有更好的均勻性。
【專利說明】
一種表面等離子體共振傳感芯片及其制備方法和應用
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于表面等離子體傳感芯片制備及生物醫(yī)學檢測技術領域,具體地涉及一種可用于小分子檢測的表面等離子體共振傳感芯片及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]皮質醇是早期測定和診斷人是否患有抑郁癥的最重要生化指標。當人承受很重工作和生活壓力時,長時期處在壓力狀況下,或者因生活節(jié)奏緊張的人,或者每晚睡眠少于8小時等等,他們體內的血液、尿、唾液中皮質醇濃度水平將增高或長期偏高。這時皮質醇的負面效應開始顯現(xiàn)為新陳代謝的變動:血糖升高、食欲增加、體重上升、精神抑郁以及極度疲勞等等。
[0003]皮質醇是一種類固醇類激素,可以調節(jié)血壓以及心血管功能并參與很多代謝過程。人體可根據(jù)血流中皮質醇的量,來調節(jié)皮質醇的濃度水平,并控制皮質醇的分泌和產生。正常情況下,身體能很好地控制皮質醇的分泌和調節(jié)血液中皮質醇的含量。正常的皮質醇代謝遵循一定的生理節(jié)奏,24小時循環(huán)一個周期,通常在早晨皮質醇水平最高,在凌晨最低。
[0004]血液中皮質醇的正常含量為30-140ng/mL(100-500nM)。唾液中的皮質醇正常含量為l-8ng/mL(3.5-27nM)。測定皮質醇含量可判斷人的生理狀態(tài)。檢測皮質醇的常規(guī)方法有酶聯(lián)免疫法、放射性免疫法、色譜質譜法等。這些常規(guī)檢測方法,檢測過程比較繁瑣,大多需要標記、需要復雜的設備,不能實現(xiàn)皮質醇的現(xiàn)場、快速檢測。
[0005]表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)是發(fā)生在平面金屬膜界面的一種物理光學現(xiàn)象。SPR對平面金屬膜界面附近的折射率變化非常靈敏。利用SPR原理可以檢測發(fā)生在平面金屬膜界面處100多nm范圍內的生物分子相互作用。SPR檢測方法具有靈敏度高、無需標記、可獲得反應動力學過程等優(yōu)點。
[0006]SPR生化分析系統(tǒng)(可參考中國發(fā)明專利CN98102366.5,CN200610066542.4,CN200810113244.5)主要由光學系統(tǒng)、機械系統(tǒng)、傳感芯片、微流控測量池及其流體控制系統(tǒng)、計算機軟件等部分組成。其中,SPR傳感芯片是最為核心的組件,傳感芯片提供了產生SPR信號的必需的物理條件,并且分子相互作用的研究是在傳感芯片表面進行的,直接影響SPR檢測靈敏度和穩(wěn)定性。SPR傳感芯片種類多,不同SPR傳感芯片檢測不同的目標分析物,同時傳感芯片也是一種實驗耗材,需要經常更換。
[0007]現(xiàn)有的SPR傳感芯片主要是Biacore公司(現(xiàn)屬于GE公司)的CM5芯片,芯片表面制備了一層葡聚糖凝膠層,利用葡聚糖凝膠層固定抗體,進行免疫反應。這種商業(yè)化的CM5芯片具有重復性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點,缺點是商品化CM5芯片十分昂貴,單片芯片售價在千元以上,必須配合Biacore公司的配套儀器才能使用,而且儀器的維護費用也特別高。CM5芯片雖然可以重復使用,但是一旦通道上固定了某一種抗體后,就不能再固定第二種抗體了,缺乏靈活性。葡聚糖凝膠層的制備過程(Masson J.F.,Battaglia T.M.,Davidson M.J.,Yoon-Chang K.,Prakash A.M.C.,Stephen B.,“B1compatible polymers for antibodysupport on gold surfaces”,Talanta,2005,67(5),pp.918_925.)也十分繁瑣,需要時間也很長,通常都需要5天時間。同時,根據(jù)同本發(fā)明芯片的測試結果對比可得,葡聚糖修飾SPR芯片固定的蛋白分子數(shù)量較少,進而影響檢測靈敏度。

【發(fā)明內容】

[0008]有鑒于此,本發(fā)明的目的是提供一種表面等離子體共振傳感芯片及其制備方法和應用。本發(fā)明的制備方法所需時間大為縮短,只需2天即可制備完成,且得到的芯片比傳統(tǒng)葡聚糖芯片(需要5天制備)具有更好的均勻性。
[0009]具體地,本發(fā)明提供一種表面等離子體共振傳感芯片的制備方法,其包括如下步驟:
[0010](I)清洗玻璃基片:依次以濃硫酸和去離子水煮洗玻璃基片,烘干;
[0011](2)采用濺射或沉積的方法,在玻璃基片上制備出厚度為3-10nm的鉻膜,然后在鉻膜上面制備厚度為45-55nm的金膜,該金膜作為表面等離子體共振傳感芯片的固相載體,制得裸金芯片;
[0012](3)在裸金芯片上滴加含改性牛血清白蛋白的溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,采用自組裝的方式對金膜表面進行化學修飾,室溫反應0.5?2小時,然后清洗和干燥芯片;
[0013](4)滴加NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)和EDC (N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亞胺)的混合溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白進行化學交聯(lián)反應,室溫反應15分鐘?I小時,然后清洗和干燥芯片;
[0014](5)滴加溴乙酸溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,使得交聯(lián)的改性牛血清白蛋白羧甲基化,室溫反應8?24小時,然后清洗和干燥芯片,即制得空白芯片。
[0015]根據(jù)小分子檢測的SPR傳感芯片線下固定和線上固定的區(qū)別,所述制備方法還包括下述步驟(6)或(6’)。
[0016]所述步驟(6)包括如下子步驟:
[0017]a)在空白芯片上滴加NHS和EDC的混合溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白進行化學交聯(lián)反應,室溫反應15分鐘?I小時,然后清洗和干燥芯片;
[0018]b)在芯片上滴加以醋酸緩沖液為溶劑的小分子偶聯(lián)物溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,37度反應10分鐘?2小時,然后清洗和干燥芯片;
[0019]c)在芯片上滴加乙醇胺溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,反應10分鐘?I小時,然后清洗和干燥芯片,即制得線下固定的小分子檢測芯片。
[0020]所述步驟(6’)包括如下子步驟:
[0021 ] a’)將空白芯片安裝在表面等離子體共振生化分析儀上,固定配套流通池;
[0022]b,)流動通入NHS和EDC的混合溶液,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白進行化學交聯(lián)反應,室溫反應7分鐘?0.5小時,然后用PBS緩沖液流動清洗;
[0023]c’)流動通入以醋酸緩沖液為溶劑的小分子偶聯(lián)物溶液,室溫反應10分鐘?I小時,然后用PBS緩沖液流動清洗;
[0024]d’)流動通入乙醇胺溶液,然后用PBS緩沖液流動清洗,即制得在線固定的小分子檢測芯片。
[0025]其中,優(yōu)選地,步驟(2)中,在所述制得裸金芯片后,所述裸金芯片以真空封裝或充純氮氣封裝后保存,可置于常溫保存待用。步驟(2)中的金可以銀進行替代,即在鉻膜上面制備銀月吳。
[0026]步驟(3)中,所述的改性牛血清白蛋白為本領域常規(guī),一般采用改性試劑(包括二硫蘇糖醇,Dithi othrei to I,簡稱DTT ;S(2^itZSJ||,Tris(2-carboxyethyl)phosphine,簡稱TCEP ;β-巰基乙醇,β-Mercaptoethanol,簡稱MESP-ME ;)與普通牛血清蛋白進行混合反應制得,所述改性試劑的濃度優(yōu)選為0.01?0.lg/L,所述普通牛血清白蛋白的濃度優(yōu)選為I?20g/L,所述混合反應的溶液中優(yōu)選含有0.5%-2%的NaCl,室溫反應0.5?2小時,即獲得改性牛血清白蛋白。所述的改性牛血清白蛋白,還可以以改性卵清蛋白(V0A)、改性生物蛋白等進行替代。
[0027]優(yōu)選地,步驟(5)中,在所述制得空白芯片后,所述空白芯片以真空封裝或充純氮氣封裝后保存,可置于常溫保存待用。
[0028]步驟(5)中,所述溴乙酸優(yōu)選溶于I?4mol/L的NaOH溶液中,所述溴乙酸的濃度優(yōu)選為 0.5-2mol/L。
[0029]在步驟(3)、(4)、(5)和(6)中,所述清洗和干燥芯片可以是本領域常規(guī)的方法,具體優(yōu)選:先用PBS緩沖液清洗,再用去離子水清洗,洗掉芯片上的未結合物質,最后用純氮氣吹干芯片。
[0030]優(yōu)選地,步驟(4)、( 6)和(6 ’)中,所述NHS和EDC的混合溶液是體積比為1:1的混合溶液,其中,所述NHS的濃度更優(yōu)選0.lmol/L,所述EDC的濃度更優(yōu)選0.4mol/L。
[0031]優(yōu)選地,步驟(6)和(6 ’)中,所述乙醇胺溶液的濃度為Imo I/L,pH值為8.5。
[0032]步驟(6)和(6’)中,所述小分子偶聯(lián)物為本領域常規(guī),一般為蛋白質與小分子的偶聯(lián)物,所述蛋白質可以選自牛血清白蛋白(BSA)、牛血清丙種球蛋白(BGG)、卵清蛋白(VOA)、雞丙種球蛋白(CGG)、鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)和人工合成多聚賴氨酸(PLL),優(yōu)選牛血清白蛋白,所述小分子偶聯(lián)物的濃度優(yōu)選為10-1000mg/L,更優(yōu)選為100mg/L。所述醋酸緩沖液為本領域常規(guī),優(yōu)選0.1M、pH值為4.5的醋酸緩沖液。所述小分子可以是皮質醇,也可以是其他的小分子,比如葉酸、生物素、多巴胺、小分子農藥、小分子獸藥(如磺胺、莠去津)、小分子添加劑等,凡是可以通過偶聯(lián)物產生抗體的小分子都可以在本發(fā)明中使用,優(yōu)選皮質醇。所述小分子偶聯(lián)物是由無免疫原性的小分子化合物(被稱為半抗原)和免疫原性蛋白質(被稱為載體)組成。半抗原小分子化合物本身無免疫原性,單獨免疫動物不能對其產生抗體;當半抗原與載體偶聯(lián)再免疫動物則能對其產生抗體,并能單獨與其抗體結合時,該偶聯(lián)物與抗體對應,類似抗原-抗體。
[0033]優(yōu)選地,在子步驟c)中,在所述制得線下固定的小分子檢測芯片后,所述線下固定的小分子檢測芯片以真空封裝或充純氮氣封裝后保存,可置于常溫保存待用。
[0034]優(yōu)選地,在子步驟b’)、c’)和d’)中,所述流動通入均是以本領域技術人員可以掌握的緩慢的速度連續(xù)流動通入。
[0035]本發(fā)明中,步驟(5)制得的空白芯片可以保存一年,優(yōu)選6個月內使用;步驟(6)制得的線下固定的小分子檢測芯片,可以保存半年,優(yōu)選3個月內使用;步驟(6’)在線固定的小分子檢測芯片可以2周內使用有效,優(yōu)選即時使用。
[0036]本發(fā)明同時提供由上述制備方法制得的表面等離子體共振傳感芯片。
[0037]本發(fā)明還提供上述表面等離子體共振傳感芯片在生物醫(yī)學檢測領域中的應用。
[0038]所述應用包括利用表面等離子體共振傳感芯片通過競爭抑制法檢測小分子的步驟。優(yōu)選地,所述應用包括如下檢測步驟:
[0039]A)角度掃描:
[0040]通入PBSt緩沖液l-5min,流速ΙΟΟμΙ/min-lOOOml/min,靜置,然后掃描光源的入射角度,得到SPR吸收峰曲線,角度掃描范圍為55-70度;
[0041 ] B)定點監(jiān)測:
[0042]在步驟A)中所述的SPR吸收峰曲線中選擇線性區(qū)域中的一個角度,進行角度定位,然后進行定點監(jiān)測;通入PBSt緩沖液l-5min,流速ΙΟΟμΙ/min-lOOOml/min;通入含有待測樣品和已知抗體濃度的混合溶液,進行免疫競爭抑制反應5-15min,流速ΙΟμΙ/min-lOOml/min,連續(xù)流動反應;反應結束,通入PBSt緩沖液,l_5min,流速ΙΟΟμΙ/min-lOOOml/min ;通入再生溶液,連續(xù)流動0.5-lmin,流速100yl/min-500ml/min;再生結束,通入I3BSt緩沖液1-5min,'2nL3^100yl/min-1000ml/min;
[0043]C)建立標準曲線:
[0044]將待測物的標準品用PBSt緩沖液配制成不同濃度的標準溶液,將該不同濃度的標準溶液分別與定量待測物小分子的抗體混合,靜置,得到各個標準溶液與定量待測物小分子的抗體的混合溶液;以PBSt緩沖液為基準,各個標準溶液與定量待測物抗體的混合溶液分別注入表面等離子共振儀的微流控測量池,與表面等離子體共振傳感芯片上的小分子偶聯(lián)物發(fā)生免疫反應,對表面等離子體共振傳感芯片反應區(qū)進行步驟B)的定點監(jiān)測,記錄SPR信號(反射光強RU)的變化,獲得各個標準溶液的表面等離子共振動力學曲線,以標準溶液濃度作為橫坐標,SPR信號變化(Δ RU)作為縱坐標,繪制工作曲線,并進行曲線擬合,獲得標準曲線;
[0045]D)未知樣品的檢測:
[0046]將未知樣品和定量待測物小分子的抗體的混合溶液流動通入微流控測量池進行免疫反應,對表面等離子體共振傳感芯片反應區(qū)進行表面等離子體共振掃描,記錄SPR信號變化(ARU),獲得待測樣品的表面等離子體共振動力學曲線,結合步驟(C)得到的標準曲線,計算出未知樣品中待測物小分子的濃度。
[0047]其中,所述小分子可以是皮質醇,也可以是其他的小分子,比如葉酸、生物素、多巴胺、小分子農藥、小分子獸藥(如磺胺、莠去津)、小分子添加劑等,凡是可以通過偶聯(lián)物產生抗體的小分子都可以在本發(fā)明中使用,優(yōu)選皮質醇。
[0048]步驟A)、B)和C)中所述的P B S t緩沖液為本領域常規(guī),優(yōu)選在P B S緩沖液中加入0.5% (v/v)的Tween-20得到。
[0049]步驟C)中,所述標準溶液的濃度范圍如本領域常規(guī),一般為0.01?5000yg/L,優(yōu)選為0.l-1000yg/L,更優(yōu)選為l-100yg/L。[0050 ]步驟D)中的未知樣品可以是唾液、血清或血漿,優(yōu)選經過簡單的過濾處理。
[0051]步驟C)和D)中,所述的定量待測物小分子的抗體在混合溶液中的終濃度優(yōu)選為1-30mg/L,更優(yōu)選為 10mg/L。
[0052]所述檢測步驟優(yōu)選還包括在檢測完成后的清洗和準備下一樣品檢測的步驟E):
[0053]步驟D)中的免疫反應結束后,微流通池流動通入PBSt緩沖液清洗l-5min,流速100μΙ/min-lOOOml/min ;再通入再生溶液,連續(xù)流動 0.5-lmin,流速 100yl/min-500ml/min ;使抗原-抗體結合物解離;然后通入I3BSt緩沖液清洗l-5min,流速ΙΟΟμΙ/min-lOOOml/min; SPR
信號值降回基線,繼續(xù)檢測下一個樣品。
[0054]在上述各步驟中,所述再生溶液為本領域常規(guī),優(yōu)選pH為1.5-2.5的Tris溶液,或者濃度在5mM-30mM的HCl、H3P04或NaOH溶液。
[0055]本發(fā)明具有下述有益效果:
[0056]本發(fā)明制備的空白芯片具有很好的SPR特性,不僅具有周期短的優(yōu)點,2天即可以制備完成,而且制備得到的芯片比傳統(tǒng)葡聚糖芯片(需要5天制備)具有更好的均勻性,不僅如此,本發(fā)明制備的空白芯片還具有更高的固定容量,可以固定更多的偶聯(lián)物。實驗還表明,相比現(xiàn)有技術,本發(fā)明制得的空白芯片在線修飾小分子偶聯(lián)物后,在與相應抗體結合時,具有更尚的檢測靈敏度。
【附圖說明】
[0057]圖1是本發(fā)明的制備方法的流程示意圖。
[0058]圖2是不同芯片的SPR吸收峰曲線圖。
[0059]圖3是不同芯片線上固定偶聯(lián)物的實時監(jiān)測結果圖。
[0060]圖4(A)和圖4(B)是不同芯片固定皮質醇偶聯(lián)物后,不同抗體濃度與SPR信號變化的關系圖。
[0061 ]圖5是應用實施例1檢測皮質醇的標準曲線。
【具體實施方式】
[0062]為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白,以下結合具體實施例,并參照附圖,對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0063]制備實施例1
[0064]如圖1所示,其為本發(fā)明的制備方法的流程示意圖。具體地,本發(fā)明的表面等離子體共振傳感芯片的制備方法包括如下步驟:
[0065](I)清洗玻璃基片:依次以濃硫酸和去離子水煮洗玻璃基片,烘干;
[0066](2)采用濺射或沉積的方法,在玻璃基片上制備出厚度為3-10nm的鉻膜,然后在鉻膜上面制備厚度為45-55nm的金膜,該金膜作為表面等離子體共振傳感芯片的固相載體,制得裸金芯片;
[0067](3)在裸金芯片上滴加含改性牛血清白蛋白的溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,采用自組裝的方式對金膜表面進行化學修飾,室溫反應0.5?2小時,然后清洗和干燥芯片;
[0068](4)滴加NHS和EDC的混合溶液(I比I混合,NHS的濃度0.Imo 1/L,EDC的濃度0.4moI/L),使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白進行化學交聯(lián)反應,室溫反應15分鐘?I小時,然后清洗和干燥芯片;
[0069](5)滴加溴乙酸溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,使得交聯(lián)的改性牛血清白蛋白羧甲基化,室溫反應8?24小時,然后清洗和干燥芯片,制得空白芯片,制得的芯片可以真空封裝或充純氮氣封裝,常溫保存待用。空白芯片可以保存一年,6個月內使用為佳。
[0070]為了與現(xiàn)有技術的芯片比較均勻性,發(fā)明人進行了原子力顯微鏡測試。結果表明,本發(fā)明制備的空白芯片,不僅具有周期短的優(yōu)點,2天可以制備完成;而且本發(fā)明制得的空白芯片在裸金芯片上固定改性牛血清白蛋白,牛血清白蛋白含有I個自由巰基鍵和17個二硫鍵,采用本發(fā)明的方法將牛血清白蛋白的二硫鍵打開,因此一個蛋白質分子就具有了35個自由巰基鍵,采用本發(fā)明的方法均勻結合到裸金芯片上作為載體層,原子力顯微鏡測試結果顯示本發(fā)明制備得到的芯片比傳統(tǒng)葡聚糖芯片(需要5天制備)具有更好的均勻性。
[0071]制備實施例2
[0072]線下固定的小分子檢測SPR傳感芯片制備方法還包括下述步驟(6),以皮質醇芯片為例。
[0073]所述步驟(6)包括如下子步驟:
[0074]a)在空白芯片上滴加NHS和EDC的混合溶液(I比I混合,NHS的濃度0.lmol/L,EDC的濃度0.4mol/L),使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白進行化學交聯(lián)反應,室溫反應15分鐘?I小時,然后清洗和干燥芯片;
[0075]b)在芯片上滴加以0.1M醋酸緩沖液為溶劑的皮質醇偶聯(lián)物溶液,耦聯(lián)物的濃度為300mg/L,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,37度反應10分鐘?2小時,然后清洗和干燥芯片;
[0076]c)在芯片上滴加乙醇胺溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,反應10分鐘?I小時,然后清洗和干燥芯片,即制得線下固定的皮質醇檢測芯片,制得的芯片可以真空封裝或充純氮氣封裝,常溫保存待用,可以保存半年,3個月內使用為佳。
[0077]制備實施例3
[0078]線上固定的小分子檢測SPR傳感芯片制備方法還包括下述步驟(6),以皮質醇芯片為例。
[0079]所述步驟(6’)包括如下子步驟:
[0080]a’)將空白芯片安裝在表面等離子體共振生化分析儀上,固定配套流通池;
[0081 ] b ’)流動通入NHS和EDC的混合溶液(I比I混合,NHS的濃度0.1mo 1/L,EDC的濃度
0.4mol/L),使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白進行化學交聯(lián)反應,室溫反應7分鐘?0.5小時,然后用PBS緩沖液流動清洗;
[0082]c’)流動通入以0.1M醋酸緩沖液為溶劑的皮質醇偶聯(lián)物溶液,耦聯(lián)物的濃度為100mg/L,室溫反應1分鐘?I小時,然后用PBS緩沖液流動清洗;
[0083]d’)連續(xù)緩慢流動通入乙醇胺溶液,濃度為lmol/L,pH值為8.5,然后用I3BS緩沖液流動清洗,在線固定偶聯(lián)物完成,即制得在線固定皮質醇檢測芯片,該芯片可以即時使用,2周內使用有效。
[0084]應用實施例1
[0085]以制備實施例2制得的皮質醇芯片檢測未知樣品中皮質醇的濃度,包括如下步驟:
[0086]A)角度掃描:
[0087]通入PBSt緩沖液(PBS緩沖液中,含有0.5%的Tween-20),l-5min,流速100μl/min-l000ml/min,靜置,然后掃描光源的入射角度,得到SPR吸收峰曲線,角度掃描范圍:55-70度。
[0088]B)定點監(jiān)測:
[0089]在以上SPR吸收峰曲線中選擇線性區(qū)域中的一個角度,進行角度定位,然后進行定點監(jiān)測。通入I3BSt緩沖液(PBS緩沖液中,含有0.5%的了¥6611-20),1-51^11,流速10(^1/1^11?1000ml/min ;通入含有檢測樣品(標準品或未知樣品)和已知抗體濃度的混合溶液,進行免疫競爭抑制反應,5-15min,流速ΙΟμΙ/min?100ml/min,連續(xù)流動反應;反應結束,通入I3BSt緩沖液,1-5111;[11,流速10(^1/111;[11?10001111/111;[11;通入再生溶液,連續(xù)流動0.5?1111;[11,流速100yl/min?500ml/min;再生結束,通入PBSt緩沖液,l_5min,流速IΟΟμΙ/min?100ml/
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[0090]C)建立標準曲線:
[0091]皮質醇標準品用PBSt緩沖液配制成不同濃度的標準溶液,不同濃度的皮質醇標準溶液分別與定量皮質醇抗體溶液混合,靜置,得到各個標準溶液與定量皮質醇抗體的混合溶液;以PBSt緩沖液為基準,各個標準溶液與定量皮質醇抗體的混合溶液分別注入表面等離子共振儀的微流控測量池,與表面等離子體共振傳感芯片上的皮質醇耦聯(lián)物(小分子偶聯(lián)物)發(fā)生免疫反應,對表面等離子體共振傳感芯片反應區(qū)進行表面步驟B)中的等離子體共振的定點監(jiān)測,記錄SPR信號(反射光強RU)的變化,獲得各個標準溶液的表面等離子共振動力學曲線,以標準溶液濃度作為橫坐標,SPR信號變化(Δ RU)作為縱坐標,繪制工作曲線,并進行曲線擬合,獲得標準曲線;
[0092]D)未知樣品的檢測:
[0093]將未知樣品和定量皮質醇抗體的混合溶液流動通入微流控測量池進行免疫反應,對表面等離子體共振傳感芯片反應區(qū)進行表面等離子體共振掃描,記錄SPR信號變化(△RU),獲得待測樣品的表面等離子體共振動力學曲線,結合步驟C)得到的回歸標準曲線,計算出未知樣品中皮質醇小分子的濃度;
[0094]E)下一樣品的檢測:
[0095]步驟D)中的免疫反應結束后,微流通池流動通入PBSt緩沖液清洗l-5min,流速100μ?/min?1000ml/min;再通入再生溶液(可以是Tris溶液pH為1.5-2.5,也可以是抝1,出?04,NaOH溶液,濃度在5mM-30mM),連續(xù)流動0.5?lmin,流速ΙΟΟμΙ/min?500ml/min;使抗原-抗體結合物解離;然后通入二?83丨緩沖液清洗1-511^11,流速10(^1/1^11?10001111/1^11; SPR信號值降回基線,繼續(xù)檢測下一個樣品。
[0096]以下是結果分析,主要通過圖2?圖5來展示結果。
[0097]圖2是不同芯片的SPR吸收峰曲線圖。
[0098]圖3是不同芯片線上固定偶聯(lián)物的實時監(jiān)測結果圖。
[0099]圖4(A)和圖4(B)是不同芯片固定皮質醇偶聯(lián)物后,不同抗體濃度與SPR信號變化的關系圖。
[0100]圖5是應用實施例1檢測皮質醇的標準曲線。
[0101]圖2顯示不同芯片的SPR吸收峰,可以看出,本發(fā)明制備的空白芯片具有和傳統(tǒng)方法制備的葡聚糖的芯片有類似的SPR吸收峰,吸收峰深度也與裸金片的SPR吸收峰相當,說明具有很好的SPR特性。
[0102]采用本發(fā)明制備的空白芯片和傳統(tǒng)方法制備的葡聚糖芯片同時在線固定皮質醇偶聯(lián)物,SPR系統(tǒng)監(jiān)測固定過程,結果如圖3所示。從圖3可以看出,本發(fā)明制備的空白芯片具有更高的固定容量,可以固定更多的偶聯(lián)物。
[0103]采用本發(fā)明制備的空白芯片和傳統(tǒng)方法制備的葡聚糖芯片在線固定皮質醇偶聯(lián)物后,利用SPR系統(tǒng)監(jiān)測不同濃度皮質醇抗體與芯片反應,記錄SPR信號變化的ARU值,結果如圖4所示。從圖4可以看出,本發(fā)明制備的空白芯片在線修飾皮質醇偶聯(lián)物后,與皮質醇抗體的結合,具有更高的靈敏度,即本發(fā)明的芯片僅需更低濃度的皮質醇抗體就能夠獲得跟傳統(tǒng)葡聚糖芯片相當SPR相對光強信號變化(Δ RU)值。
[0104]采用本發(fā)明的方法制得的皮質醇檢測SPR傳感芯片用于皮質醇檢測的檢測結果如圖5所示,檢測限為lng/ml,檢測范圍是l-100ng/ml。
[0105]以上所述的具體實施例,對本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明,應理解的是,以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已,并不用于限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內,所做的任何修改、等同替換、改進等,均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種表面等離子體共振傳感芯片的制備方法,其特征在于,其包括如下步驟: (1)清洗玻璃基片:依次以濃硫酸和去離子水煮洗玻璃基片,烘干; (2)采用濺射或沉積的方法,在玻璃基片上制備出厚度為3-10nm的鉻膜,然后在鉻膜上面制備厚度為45-55nm的金膜,該金膜作為表面等離子體共振傳感芯片的固相載體,制得裸金芯片; (3)在裸金芯片上滴加含改性牛血清白蛋白的溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,采用自組裝的方式對金膜表面進行化學修飾,室溫反應0.5?2小時,然后清洗和干燥芯片; (4)滴加NHS和EDC的混合溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白進行化學交聯(lián)反應,室溫反應15分鐘?I小時,然后清洗和干燥芯片; (5)滴加溴乙酸溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,使得交聯(lián)的改性牛血清白蛋白羧甲基化,室溫反應8?24小時,然后清洗和干燥芯片,即制得空白芯片。2.根據(jù)權利要求1所述的表面等離子體共振傳感芯片的制備方法,其特征在于,所述制備方法還包括下述步驟(6)或(6’); 所述步驟(6)包括如下子步驟: a)在空白芯片上滴加NHS和EDC的混合溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白進行化學交聯(lián)反應,室溫反應15分鐘?I小時,然后清洗和干燥芯片; b)在芯片上滴加以醋酸緩沖液為溶劑的小分子偶聯(lián)物溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,37度反應10分鐘?2小時,然后清洗和干燥芯片; c)在芯片上滴加乙醇胺溶液,使溶液均勻鋪滿整個芯片,繼續(xù)滴加直至浸泡整個芯片,密封振蕩反應,反應10分鐘?I小時,然后清洗和干燥芯片,即制得線下固定的小分子檢測芯片; 所述步驟(6’)包括如下子步驟: a ’)將空白芯片安裝在表面等離子體共振生化分析儀上,固定配套流通池; b,)流動通入NHS和EDC的混合溶液,使得金膜表面上固定的改性牛血清白蛋白進行化學交聯(lián)反應,室溫反應7分鐘?0.5小時,然后用PBS緩沖液流動清洗; c’)流動通入以醋酸緩沖液為溶劑的小分子偶聯(lián)物溶液,室溫反應10分鐘?I小時,然后用PBS緩沖液流動清洗; d’)流動通入乙醇胺溶液,然后用PBS緩沖液流動清洗,即制得在線固定的小分子檢測芯片。3.根據(jù)權利要求1或2所述的表面等離子體共振傳感芯片的制備方法,其特征在于,步驟(2)中,在所述制得裸金芯片后,所述裸金芯片以真空封裝或充純氮氣封裝后保存,置于常溫保存待用; 步驟(2)中的金可以銀進行替代,即在鉻膜上面制備銀膜。4.根據(jù)權利要求1或2所述的表面等離子體共振傳感芯片的制備方法,其特征在于,步驟(3)中,所述的改性牛血清白蛋白采用改性試劑與普通牛血清蛋白進行混合反應制得,所述改性試劑的濃度為0.0l?0.lg/L,所述普通牛血清白蛋白的濃度為I?20g/L,所述混合反應的溶液中含有0.5%-2%的NaCl,室溫反應0.5?2小時,即獲得所述改性牛血清白蛋白。5.根據(jù)權利要求1或2所述的表面等離子體共振傳感芯片的制備方法,其特征在于,步驟(5)中,在所述制得空白芯片后,所述空白芯片以真空封裝或充純氮氣封裝后保存,置于常溫保存待用; 步驟(5)中,所述溴乙酸溶于I?4mo VL的NaOH溶液中,所述溴乙酸的濃度為0.5-2moI/L; 在步驟(3)、(4)、(5)和(6)中,所述清洗和干燥芯片具體為:先用PBS緩沖液清洗,再用去離子水清洗,洗掉芯片上的未結合物質,最后用純氮氣吹干芯片。6.根據(jù)權利要求1或2所述的表面等離子體共振傳感芯片的制備方法,其特征在于,步驟(4)、( 6)和(6 ’)中,所述NHS和EDC的混合溶液是體積比為1:1的混合溶液,其中,所述NHS的濃度更優(yōu)選0.lmol/L,所述EDC的濃度更優(yōu)選0.4mol/L; 步驟(6)和(6 ’)中,所述乙醇胺溶液的濃度為Imo I/L,pH值為8.5; 步驟(6)和(6’)中,所述小分子偶聯(lián)物為蛋白質與小分子的偶聯(lián)物,所述蛋白質選自牛血清白蛋白BSA、牛血清丙種球蛋白BGG、卵清蛋白V0A、雞丙種球蛋白CGG、鑰孔嘁血藍蛋白KLH和人工合成多聚賴氨酸PLL,優(yōu)選牛血清白蛋白,所述小分子偶聯(lián)物的濃度優(yōu)選為10-1000mg/L,更優(yōu)選為 100mg/L; 所述醋酸緩沖液優(yōu)選0.1Μ、ρΗ值為4.5的醋酸緩沖液; 所述小分子優(yōu)選皮質醇; 在子步驟c)中,在所述制得線下固定的小分子檢測芯片后,所述線下固定的小分子檢測芯片以真空封裝或充純氮氣封裝后保存,置于常溫保存待用。7.權利要求1?6任一項所述的制備方法制得的表面等離子體共振傳感芯片。8.權利要求7所述的表面等離子體共振傳感芯片在生物醫(yī)學檢測領域中的應用。9.根據(jù)權利要求8所述的應用,其特征在于,所述應用為利用表面等離子體共振傳感芯片通過競爭抑制法檢測小分子,其具體包括如下檢測步驟: A)角度掃描: 通入PBSt緩沖液l-5min,流速ΙΟΟμΙ/min-lOOOml/min,靜置,然后掃描光源的入射角度,得到SPR吸收峰曲線,角度掃描范圍為55-70度; B)定點監(jiān)測: 在步驟A)中所述的SPR吸收峰曲線中選擇線性區(qū)域中的一個角度,進行角度定位,然后進行定點監(jiān)測;通入PBSt緩沖液l-5min,流速ΙΟΟμΙ/min-lOOOml/min;通入含有待測樣品和已知抗體濃度的混合溶液,進行免疫競爭抑制反應5_15min,流速ΙΟμΙ/min-lOOml/min,連續(xù)流動反應;反應結束,通入PBSt緩沖液,l-5min,流速ΙΟΟμΙ/min-lOOOml/min;通入再生溶液,連續(xù)流動 0.5-lmin,流速 10(^1/111;[11-5001111/111;[11;再生結束,通入?1331:緩沖液1-5111;[11,流速ΙΟΟμΙ/min-lOOOml/min; C)建立標準曲線: 將待測物的標準品用PBSt緩沖液配制成不同濃度的標準溶液,將該不同濃度的標準溶液分別與定量待測物小分子的抗體混合,靜置,得到各個標準溶液與定量待測物小分子的抗體的混合溶液;以PBSt緩沖液為基準,各個標準溶液與定量待測物抗體的混合溶液分別注入表面等離子共振儀的微流控測量池,與表面等離子體共振傳感芯片上的小分子偶聯(lián)物發(fā)生免疫反應,對表面等離子體共振傳感芯片反應區(qū)進行步驟B)的定點監(jiān)測,記錄SPR信號的變化,獲得各個標準溶液的表面等離子共振動力學曲線,以標準溶液濃度作為橫坐標,SPR信號變化作為縱坐標,繪制工作曲線,并進行曲線擬合,獲得標準曲線; D)未知樣品的檢測: 將未知樣品和定量待測物小分子的抗體的混合溶液流動通入微流控測量池進行免疫反應,對表面等離子體共振傳感芯片反應區(qū)進行表面等離子體共振掃描,記錄SPR信號變化,獲得待測樣品的表面等離子體共振動力學曲線,結合步驟C)得到的標準曲線,計算出未知樣品中待測物小分子的濃度。10.根據(jù)權利要求9所述的應用,其特征在于, 其中,所述小分子為皮質醇; 步驟A)、B)和C)中所述的PBSt緩沖液為在I3BS緩沖液中加入0.5% (v/v)的Tween-20得到; 步驟C)中,所述標準溶液的濃度范圍為0.l-1000yg/L,更優(yōu)選為l-100yg/L; 步驟D)中的未知樣品為唾液、血清或血漿; 步驟C)和D)中,所述的定量待測物小分子的抗體在混合溶液中的終濃度為l-30mg/L,更優(yōu)選為10mg/L; 各步驟中,所述再生溶液是pH為1.5-2.5的Tris溶液,或者濃度在5mM-30mM的HCl ,H3PO4或NaOH溶液。
【文檔編號】G01N21/552GK106018347SQ201610295064
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】崔大付, 陳興, 張璐璐, 徐春方, 李亞亭, 任艷飛
【申請人】中國科學院電子學研究所
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