本發(fā)明涉及表面等離子共振譜儀抗污染芯片制備領(lǐng)域，特別是涉及一種基于潤(rùn)滑素蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片及其制備方法。

背景技術(shù)：

表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance，簡(jiǎn)稱(chēng)SPR)儀是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種生物傳感器技術(shù)，當(dāng)入射光從高折射率介質(zhì)入射到低折射率介質(zhì)時(shí)，會(huì)發(fā)生全反射，此時(shí)若在介質(zhì)交界面處鍍一層金屬薄膜(金或銀)，入射光產(chǎn)生的漸逝波會(huì)引起金屬表面自由電子發(fā)生集體振蕩，進(jìn)而形成等離子體，當(dāng)漸逝波與表面等離子體振蕩的頻率和波數(shù)相等時(shí)，即產(chǎn)生共振現(xiàn)象(SPR)，導(dǎo)致能量從漸逝波轉(zhuǎn)移到表面等離子波中，使反射光的強(qiáng)度大大減弱，呈現(xiàn)衰減全反射現(xiàn)象，當(dāng)反射光的強(qiáng)度為零時(shí)的入射角稱(chēng)為共振角。共振角與金屬薄膜界面介質(zhì)折射率有關(guān)，而折射率又隨結(jié)合在金屬薄膜表面的分子質(zhì)量而變化，故可通過(guò)分析共振角來(lái)獲得分子間相互作用的信息，由于其具有檢測(cè)快速且無(wú)需標(biāo)記等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物研發(fā)、臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，并且顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

SPR芯片是表面等離子共振儀最為核心的組件，提供產(chǎn)生SPR信號(hào)的必須物理?xiàng)l件，主要包括耦合器件、金屬膜和表面基質(zhì)。然而，應(yīng)用表面等離子共振儀進(jìn)行分析測(cè)試時(shí)，傳感芯片的表面污染是一個(gè)普遍存在的問(wèn)題，來(lái)自樣品中的生物分子或微生物的非特異性吸附將降低定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。因此，開(kāi)發(fā)有效抵抗非特異性吸附的表面是提高表面等離子共振傳感器靈敏度和精確度的首要問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種基于潤(rùn)滑素蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的：

一種基于潤(rùn)滑素蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法，包括以下步驟：

a)裸金芯片制備

采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在基底上涂覆一層2-3nm厚的鉻層，在該鉻層上涂覆一層45-50nm厚的金膜，得到裸金芯片；

b)裸金芯片預(yù)處理

將步驟a)獲得的裸金芯片浸入水、30wt.％濃氨水與30wt.％雙氧水的混合溶液中，上述混合溶液中水、30wt.％濃氨水與30wt.％雙氧水的體積比為3:1:1，于70-90℃下浸泡10-60min，取出用去離子水清洗3次后用氮?dú)獯蹈桑?/p>

c)潤(rùn)滑素蛋白修飾

將b)步驟得到的芯片清洗后用柏油貼合到表面等離子共振儀系統(tǒng)的棱鏡上，以pH為7-8的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為50-100μL/min持續(xù)流過(guò)芯片表面，待基線(xiàn)穩(wěn)定時(shí)，注入100μL100-300μg/mL的潤(rùn)滑素蛋白，并以20-50μL/min的速度流過(guò)流通池，出現(xiàn)表面等離子共振響應(yīng)信號(hào)時(shí)，停止流速，孵育10-20min，再以50-100μL/min的流速走緩沖液10-30min，清洗掉未結(jié)合牢固的潤(rùn)滑素蛋白。

而且，上述的基底為玻璃片基底或光纖基底，玻璃片基底優(yōu)選BK7玻璃基底。

而且，上述的金膜還可為銀膜或硅烷膜或銀/金復(fù)合膜。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是：

(1)本發(fā)明制備的基于潤(rùn)滑素蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片具有很好的抗污染性能，且抗污染效果不受溶液pH值的影響；

(2)本發(fā)明制備的基于潤(rùn)滑素蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片具有良好的潤(rùn)滑性和生物兼容性；

(3)本發(fā)明制備的基于潤(rùn)滑素蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片具有高穩(wěn)定性，干燥狀態(tài)下儲(chǔ)存2個(gè)月或室溫條件下儲(chǔ)存3個(gè)月后，抗污染性能無(wú)變化；

(4)本發(fā)明基于潤(rùn)滑素蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法簡(jiǎn)便快速，減少了以往多步繁瑣的制備過(guò)程，極大地提高了芯片表面修飾的效率；

(5)本發(fā)明制備的基于潤(rùn)滑素蛋白作為SPR芯片表面的抗污染材料具有生物可降解性。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明基于潤(rùn)滑素蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明基于潤(rùn)滑素蛋白修飾的表面等離子共振儀芯片對(duì)0.5mg/mL的羊免疫球蛋白(IgG)、2mg/mL牛血清蛋白(BSA)以及2mg/mL溶菌酶(lysozyme)溶液中蛋白的非特異性吸附量；

其中，1、玻璃片基底；2、鉻層；3、金膜層；4、潤(rùn)滑素蛋白自組裝單分子層。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步詳述。需要說(shuō)明的是：下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在BK7玻璃基底上涂覆一層2nm厚的鉻層，在該鉻層上涂覆一層48nm厚的金膜，得到裸金芯片；將上述裸金芯片浸入水、30％濃氨水與30％雙氧水的混合溶液中，水、30％濃氨水與30％雙氧水的體積比為3:1:1，于70℃下浸泡40min。然后取出用去離子水清洗3次，用氮?dú)獯蹈?。將清洗吹干后的芯片用柏油貼合到表面等離子共振系統(tǒng)的棱鏡上，以pH為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，選擇流速為50μL/min持續(xù)流過(guò)芯片表面，待基線(xiàn)穩(wěn)定時(shí)，注入100μL 100μg/mL的潤(rùn)滑素蛋白，并以20μL/min的速度流過(guò)流通池，出現(xiàn)表面等離子共振響應(yīng)信號(hào)時(shí)，停止流速，孵育20min，再以50μL/min的流速走緩沖液10min，清洗掉未結(jié)合牢固的潤(rùn)滑素蛋白。

將上述獲得的芯片用柏油貼合到表面等離子共振系統(tǒng)的棱鏡上，以pH為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，選擇流速為10μL/min。待基線(xiàn)平穩(wěn)后，往定量環(huán)中分別注入100μL的蛋白溶液：0.5mg/mL的羊免疫球蛋白、2mg/mL的牛血清白蛋白、2mg/mL的溶菌酶、10％人血漿和50％人血漿，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)上述各蛋白溶液到達(dá)芯片表面，由表面等離子共振系統(tǒng)測(cè)定共振角實(shí)時(shí)變化曲線(xiàn)，20min后讀取表面等離子共振角變化值，并計(jì)算非特異性吸附量分別為12.21ng/cm²、16.68ng/cm²、5.82ng/cm²、29ng/cm²和64ng/cm²，其中單一蛋白(羊免疫球蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶)在表面的非特異性吸附量如圖2所示，相較于裸金表面蛋白的非特異性吸附量降低了至少85％。

實(shí)施例2

采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在BK7玻璃基底上涂覆一層3nm厚的鉻層，在該鉻層上涂覆一層47nm厚的金膜，得到裸金芯片；將上述裸金芯片浸入水、30％濃氨水與30％雙氧水的混合溶液中，水、30％濃氨水與30％雙氧水的體積比為3:1:1，于85℃下浸泡15min。然后取出用去離子水清洗3次，用氮?dú)獯蹈?。將清洗吹干后的芯片用柏油貼合到表面等離子共振系統(tǒng)的棱鏡上，以pH為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，選擇流速為100μL/min持續(xù)流過(guò)芯片表面，待基線(xiàn)穩(wěn)定時(shí)，注入100μL 300μg/mL的潤(rùn)滑素蛋白，并以50μL/min的速度流過(guò)流通池，出現(xiàn)表面等離子共振響應(yīng)信號(hào)時(shí)，停止流速，孵育10min，再以100μL/min的流速走緩沖液20min，清洗掉未結(jié)合牢固的潤(rùn)滑素蛋白。

將上述獲得的芯片用柏油貼合到表面等離子共振系統(tǒng)的棱鏡上，以pH為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，選擇流速為10μL/min。待基線(xiàn)平穩(wěn)后，往定量環(huán)中分別注入100μL的蛋白溶液：0.5mg/mL的羊免疫球蛋白、2mg/mL的牛血清白蛋白、2mg/mL的溶菌酶、10％人血漿和50％人血漿，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)上述各蛋白溶液到達(dá)芯片表面，由表面等離子共振系統(tǒng)測(cè)定共振角實(shí)時(shí)變化曲線(xiàn)，20min后讀取表面等離子共振角變化值，并計(jì)算非特異性吸附量分別為11.3ng/cm²、17.50ng/cm²、4.65ng/cm²、26.5ng/cm²和59ng/cm²，相較于裸金表面蛋白的非特異性吸附量降低了至少85％。

本發(fā)明制備的基于潤(rùn)滑素蛋白SPR芯片具有很好的抗污染性能，相比裸金對(duì)羊免疫球蛋白、牛血清蛋白、溶菌酶及10％和50％人血漿中蛋白的非特異性吸附量降低了85％以上，且抗污染效果不受溶液pH值的影響；具有良好的潤(rùn)滑性和生物兼容性；具有高穩(wěn)定性，干燥狀態(tài)下儲(chǔ)存2個(gè)月或室溫條件下儲(chǔ)存3個(gè)月后，抗污染性能無(wú)變化；芯片表面的抗污染材料具有生物可降解性；并且本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)便快速，減少了以往多步繁瑣的制備過(guò)程，極大地提高了芯片表面修飾的效率。

以上對(duì)本發(fā)明做了示例性的描述，應(yīng)該說(shuō)明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡(jiǎn)單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)的等同替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。