本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種樹莓中酚類化合物的分離方法。
背景技術(shù)：
：樹莓(學(xué)名：RubuscorchorifoliusL.f.)，又名山莓、山拋?zhàn)?、牛奶泡、撒秧泡，三月泡、四月泡、龍船泡，大麥泡、泡兒刺，刺葫蘆、饅頭菠、高腳波，直立灌木，高1-3米；枝具皮刺，幼時(shí)為柔毛。單葉，卵形至卵狀披針形，多生在向陽山坡、山谷、荒地、溪邊和疏密灌叢中潮濕處，目前尚未由人工引種栽培?；ㄆ?-3月，果期4-6月。具有澀精益腎助陽明目、醒酒止渴、化痰解毒之功效，主治腎虛、遺精、醉酒、丹毒等癥。葉性微苦，解毒、消腫、斂瘡等、咽喉腫痛、多發(fā)性膿腫、乳腺炎等癥。除東北、甘肅、青海、新疆、西藏外，中國其余省份、朝鮮、日本、緬甸、越南均有分布。樹莓中含有八種酚類物質(zhì)，分別為，即花青素(cyanidin3-sophoroside,cyaniding3-glucoside和pelargonidin3-glucoside)，原花青素(表兒茶素和兒茶素)，黃酮醇(quercetin3-glucoside)，鞣花酸和白藜蘆醇。以上酚類物質(zhì)具有生物活性，有著抗腫瘤等多方面的作用，然而測定其含量以及對其進(jìn)行分離的難度較高，未見有相關(guān)報(bào)道。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種樹莓中酚類化合物的分離方法，所述方法通過合理的預(yù)處理以及配套的后續(xù)處理，最終使用HPLC將樹莓中的八種酚類物質(zhì)分離出來。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種樹莓中分類化合物的分離方法，所述方法包括以下步驟：1)使用酮類溶劑溶解樹莓樣品并混勻；2)過濾后取濾液，濃縮濾液后使用有機(jī)酸稀釋濾液；3)使用固相萃取柱純化稀釋后的濾液，加入醇-酸溶劑；4)采用HPLC檢測并分離樣品混合物。本發(fā)明通過預(yù)處理樹莓樣品，使得樣品中的酚類物質(zhì)較好地溶出并穩(wěn)定地保藏在溶劑中，使用酸化醇類溶劑保持樹莓中酚類物質(zhì)的穩(wěn)定。最終通過HPLC的手段實(shí)現(xiàn)樣品中各酚類物質(zhì)的分離。優(yōu)選地，所述步驟1)中的有機(jī)溶劑為酮類有機(jī)溶劑，優(yōu)選地，所述酮類溶劑是丙酮。優(yōu)選地，所述混勻具體為，在勻漿機(jī)攪拌，其中攪拌的轉(zhuǎn)速為15000-20000rpm，攪拌時(shí)間為40-80秒。轉(zhuǎn)速過快很會(huì)使一些酚類物質(zhì)降解損失，預(yù)處理時(shí)間過短不能充分提取酚類物質(zhì)，過長使一些酚類物質(zhì)容易氧化。優(yōu)選地，所述步驟2)中在真空條件下過濾，濾渣使用步驟1)中的有機(jī)溶劑清洗，收集清洗液，優(yōu)選地，清洗進(jìn)行3-5次。優(yōu)選地，所述步驟2)中的濃縮在溫度30-40℃，壓力小于1MPa的條件下進(jìn)行，優(yōu)選地，濃縮至出線黃色小顆粒時(shí)停止。優(yōu)選地，所述步驟2)中的有機(jī)酸被水稀釋至體積百分含量為2-5％，優(yōu)選地，所述有機(jī)酸為為含有1-3個(gè)碳原子的有機(jī)酸，更優(yōu)選地，所述有機(jī)酸是甲酸。優(yōu)選地，所述步驟3)中的醇-酸溶劑中，醇為含有1-3個(gè)碳原子的醇類，酸為含有1-3個(gè)碳原子的有機(jī)酸，優(yōu)選地，所述醇-酸溶劑中，酸的體積百分含量為2-5％。優(yōu)選地，所述步驟3)中使用固相萃取柱純化前，對固相萃取柱進(jìn)行激活，優(yōu)選地，激活的具體過程為，依次使用相當(dāng)于柱容量1-2倍的甲醇、相當(dāng)于柱容量1-2倍的去離子水和相當(dāng)于柱容量1-2倍的3％甲酸水溶液處理所述固相萃取柱。優(yōu)選地，所述步驟4)中的HPLC采用梯度洗脫的方式進(jìn)行，所述梯度洗脫的流動(dòng)相由甲醇和重水組成，洗脫過程中，甲醇在所述流動(dòng)相中的體積百分比在45-55分鐘內(nèi)由15％逐步遞增至100％，優(yōu)選地，所述流動(dòng)相中還含有體積百分比計(jì)2-3％的甲酸。優(yōu)選地，所述步驟4)中HPLC的柱溫為38-42℃，流動(dòng)相的流速為0.8-1.2ml/min。本發(fā)明的另一方面涉及所述方法在其他空心莓中酚類化合物的分離中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明的分離方法中，預(yù)處理樹莓樣品的方法簡便有效；(2)本發(fā)明的分離方法通過高效液相色譜進(jìn)行，過程易于控制，方法穩(wěn)定可靠；(3)本發(fā)明的方法可以得到樹莓中的八種酚類物質(zhì)，為酚類化合物的檢測提供有力指導(dǎo)。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1按照以下步驟進(jìn)行樹莓中各種酚類化合物的分離前預(yù)處理1)3g樹莓樣品與15mL丙酮放在50mL的離心管中使用勻漿機(jī)攪拌，在15000rpm下攪拌80秒，獲得樣品和丙酮的混合物；2)并將步驟1)中獲得的混合物在真空下過濾，并用5mL丙酮洗滌殘留物3次，并將3次過濾液合并，其中過濾操作采用漏斗濾紙進(jìn)行，并且，漏斗濾紙上覆蓋一層玻璃棉；3)使用旋轉(zhuǎn)冷凝蒸發(fā)儀在35℃蒸發(fā)過濾液，直至出現(xiàn)黃色的小顆粒停止蒸發(fā)；4)蒸發(fā)后將濃縮的樣品溶解在5mL的2％乙酸中，并通過C18Sep-Pak柱，其中，C18Sep-Pak柱使用前，依次采用5ml的甲醇、6ml的去離子水、3％的甲酸激活。；5)用2mL含有2％乙酸的酸化甲醇復(fù)活花色素苷及其他酚類化合物并回收，所有的回收樣品均通過0.45μm針頭式過濾器過濾，每個(gè)樣品10μL的提取液用于高效液相色譜測定分析；6)使用高效液相色譜儀分別在波長280nm、365nm和520nm下同時(shí)檢測不同酚類化合物，獲得8個(gè)不同樹莓酚類物質(zhì)，并將其歸為5組，即花青素(cyanidin-3sophoroside,cyanidin-3glucoside和pelargonidin-3glucoside)，原花青素(表兒茶素和兒茶素)，黃酮醇(quercetin-3glucoside)，鞣花酸和白藜蘆醇。實(shí)施例2按照以下步驟進(jìn)行樹莓中各種酚類化合物的分離前預(yù)處理1)3g樹莓樣品與15mL丙酮放在50mL的離心管中使用勻漿機(jī)攪拌，在17500rpm下攪拌1分鐘，獲得樣品和丙酮的混合物；2)并將步驟1)中獲得的混合物在真空下過濾，并用5mL丙酮洗滌殘留物5次，并將5次過濾液合并，其中過濾操作采用漏斗濾紙進(jìn)行，并且，漏斗濾紙上覆蓋一層玻璃棉；3)使用旋轉(zhuǎn)冷凝蒸發(fā)儀在30℃蒸發(fā)過濾液，直至出現(xiàn)黃色的小顆粒停止蒸發(fā)；4)蒸發(fā)后將濃縮的樣品溶解在5mL的3％甲酸中，并通過C18Sep-Pak柱，其中C18Sep-Pak柱使用前，依次采用5ml的甲醇、6ml的去離子水、3％的甲酸激活；5)用2mL含有3％甲酸的酸化甲醇復(fù)活花色素苷及其他酚類化合物并回收，所有的回收樣品均通過0.45μm針頭式過濾器過濾，每個(gè)樣品10μL的提取液用于高效液相色譜測定分析；6)使用高效液相色譜儀分別在波長280nm、365nm和520nm下同時(shí)檢測不同酚類化合物，獲得8個(gè)不同樹莓酚類物質(zhì)，并將其歸為5組，即花青素(cyanidin3-sophoroside,cyaniding3-glucoside和pelargonidin3-glucoside)，原花青素(表兒茶素和兒茶素)，黃酮醇(quercetin3-glucoside)，鞣花酸和白藜蘆醇。實(shí)施例3按照以下步驟進(jìn)行樹莓中各種酚類化合物的分離前預(yù)處理1)3g樹莓樣品與15mL丙酮放在50mL的離心管中使用勻漿機(jī)攪拌，在20000rpm下攪拌40秒，獲得樣品和丙酮的混合物；2)并將步驟(1)中獲得的混合物在真空下過濾，并用5mL丙酮洗滌殘留物3次，并將3次過濾液合并；3)使用旋轉(zhuǎn)冷凝蒸發(fā)儀在40℃蒸發(fā)過濾液，直至出現(xiàn)黃色的小顆粒停止蒸發(fā)；4)蒸發(fā)后將濃縮的樣品溶解在5mL的5％甲酸中，并通過C18Sep-Pak柱；5)用2mL含有5％甲酸的酸化甲醇復(fù)活花色素苷及其他酚類化合物并回收，所有的回收樣品均通過0.45μm針頭式過濾器過濾，每個(gè)樣品10μL的提取液用于高效液相色譜測定分析；6)使用高效液相色譜儀分別在波長280nm、365nm和520nm下同時(shí)檢測不同酚類化合物，獲得8個(gè)不同樹莓酚類物質(zhì)，并將其歸為5組，即花青素(cyanidin-3sophoroside,cyanidin-3glucoside和pelargonidin-3glucoside)，原花青素(表兒茶素和兒茶素)，黃酮醇(quercetin-3glucoside)，鞣花酸和白藜蘆醇。對比例1按照以下步驟進(jìn)行樹莓中各種酚類化合物的分離前預(yù)處理1)3g樹莓樣品與15mL丙酮放在50mL的離心管中使用勻漿機(jī)攪拌，在17500rpm下攪拌1分鐘，獲得樣品和丙酮的混合物；2)并將步驟1)中獲得的混合物在真空下過濾，并用5mL丙酮洗滌殘留物5次，并將5次過濾液合并，其中過濾操作采用漏斗濾紙進(jìn)行，并且，漏斗濾紙上覆蓋一層玻璃棉；3)使用旋轉(zhuǎn)冷凝蒸發(fā)儀在30℃蒸發(fā)過濾液，直至出現(xiàn)黃色的小顆粒停止蒸發(fā)；4)蒸發(fā)后將濃縮的樣品溶解在5mL的3％甲酸中，并通過C18Sep-Pak柱；5)用2mL含有3％甲酸的酸化甲醇復(fù)活花色素苷及其他酚類化合物并回收，所有的回收樣品均通過0.45μm針頭式過濾器過濾，每個(gè)樣品10μL的提取液用于高效液相色譜測定分析；6)使用高效液相色譜儀分別在波長280nm、365nm和520nm下同時(shí)檢測不同酚類化合物，獲得8個(gè)不同樹莓酚類物質(zhì)，并將其歸為5組，即花青素(cyanidin-3sophoroside,cyanidin-3glucoside和pelargonidin-3glucoside)，原花青素(表兒茶素和兒茶素)，黃酮醇(quercetin-3glucoside)，鞣花酸和白藜蘆醇。對比例2按照以下步驟進(jìn)行樹莓中各種酚類化合物的分離前預(yù)處理1)3g樹莓樣品與15mL丙酮放在50mL的離心管中使用勻漿機(jī)攪拌，在17500rpm下攪拌1分鐘，獲得樣品和丙酮的混合物；2)使用旋轉(zhuǎn)冷凝蒸發(fā)儀在30℃蒸發(fā)過濾液，直至出現(xiàn)黃色的小顆粒停止蒸發(fā)；3)蒸發(fā)后將濃縮的樣品溶解在5mL的3％甲酸中，并通過C18Sep-Pak柱，其中C18Sep-Pak柱使用前，依次采用5ml的甲醇、6ml的去離子水、3％的甲酸激活；4)樣品通過0.45μm針頭式過濾器過濾，每個(gè)樣品10μL的提取液用于高效液相色譜測定分析；5)使用高效液相色譜儀分別在波長280nm、365nm和520nm下同時(shí)檢測不同酚類化合物，獲得8個(gè)不同樹莓酚類物質(zhì)，并將其歸為5組，即花青素(cyanidin-3sophoroside,cyanidin-3glucoside和pelargonidin-3glucoside)，原花青素(表兒茶素和兒茶素)，黃酮醇(quercetin-3glucoside)，鞣花酸和白藜蘆醇。實(shí)驗(yàn)例對實(shí)施例1-3和對比例1、2中預(yù)處理后的樣品進(jìn)行HPLC分離，使用的實(shí)驗(yàn)儀器如下：柱子：PolarisC-18A,5u,300X4,6mm，保護(hù)柱：MetaGuard4,6mmPolarisC18-A,5u，檢測器器：PDA(光電二極官陣列檢測器)檢測波長：200-750nm(254,320,365,503和519nm)HPLC的條件如下：實(shí)施例1：流動(dòng)相流速：1.2ml/min運(yùn)行時(shí)間：45min平衡時(shí)間：15min洗脫型：梯度溶劑：A：2％的水-2D-甲酸，B:2％甲醇-甲酸洗脫條件：高效液相分離效果好，各組分保留時(shí)間區(qū)別較大，各組分的峰之間交叉少。實(shí)施例2：流動(dòng)相流速：1ml/min運(yùn)行時(shí)間：52min平衡時(shí)間：15min洗脫型：梯度溶劑：A：2.45％的水-2D-甲酸，B:2.45％甲醇-甲酸洗脫條件：高效液相分離效果好，各組分保留時(shí)間區(qū)別較大，各組分的峰之間交叉少。實(shí)施例3：流動(dòng)相流速：1.2ml/min運(yùn)行時(shí)間：55min平衡時(shí)間：15min洗脫型：梯度溶劑：A：水-2D，B:甲醇洗脫條件：高效液相分離效果好，各組分保留時(shí)間區(qū)別較大，各組分的峰之間交叉少。對比例1、2：流動(dòng)相流速：1ml/min運(yùn)行時(shí)間：52min平衡時(shí)間：15min洗脫型：梯度溶劑：A：2.45％的水-2D-甲酸，B:2.45％甲醇-甲酸洗脫條件：高效液相分離效果一般，各組分保留時(shí)間區(qū)別小，各組分的峰之間有交叉。其中，實(shí)施例3中的HPLC結(jié)果如下表1所示，對比例1中的HPLC結(jié)果如下表2所示，對比例2中的HPLC結(jié)果如下表3所示。表1產(chǎn)物\結(jié)果Λmax(nm)保留時(shí)間(min)花青素3-槐糖苷52017.2花青素3-葡萄糖苷52018.6花葵素-3葡萄糖苷52020.7表兒茶素36521.6兒茶素36522.8槲皮素3-葡萄糖苷36528.1鞣花酸36529.5白藜蘆醇28031.1表2表3產(chǎn)物\結(jié)果Λmax(nm)保留時(shí)間(min)花青素3-槐糖苷52020.1花青素3-葡萄糖苷52020.6花葵素-3葡萄糖苷52020.7表兒茶素36522.6兒茶素36522.6槲皮素3-葡萄糖苷36528.5鞣花酸36528.8白藜蘆醇28028.8由以上表格中的數(shù)據(jù)可以看出，采用對比例中的方法處理樣品后，在HPLC中無法將樣品中的酚類完全分離，可以看出，許多酚類的保留時(shí)間重疊或是非常接近，無法有效分離。盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。當(dāng)前第1頁1 2 3