本發(fā)明涉及一種快速檢測白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)的方法，屬于酒類分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肽(丙氨酰-酪氨酸)是構(gòu)成人體一切細胞的基本材料，在調(diào)節(jié)生理激素、運輸氧、抗拒病菌等方面具有重要的功能。功能如下：(1)丙氨酰-酪氨酸因其結(jié)構(gòu)簡單、分子量小、不飽和，所以能夠通過細胞膜的滲透以原形直接進入細胞內(nèi)，而不需要再次消化，也不需要耗費能量。(2)丙氨酰-酪氨酸以原形直接進入細胞內(nèi)，是其生物活性的重要體現(xiàn)。眾所周知，很多營養(yǎng)物質(zhì)和藥物尚且不能直接進入細胞內(nèi)，對于大多數(shù)細胞病變醫(yī)學還無能為力。小分子肽卻可以輕而易舉地直接進入細胞內(nèi)，并且透過皮膚屏障、透過血腦屏障、透過胎盤屏障、透過腸胃粘膜屏障。(3)丙氨酰-酪氨酸參與酶的合成，激發(fā)酶的活性，強化酶的功能，維持酶的穩(wěn)定。(4)丙氨酰-酪氨酸改善中間代謝膜(腸胃粘膜、毛細血管壁、肺泡、腦脊膜、紅細胞壁、腎小球基底膜)的通透性，能夠有效的吸收營養(yǎng)、排泄毒素，并能防御病原體的入侵。(5)丙氨酰-酪氨酸通過控制DNA的轉(zhuǎn)錄，保持細胞優(yōu)勢信息的遺傳。(6)丙氨酰-酪氨酸通過合成特異蛋白質(zhì)，產(chǎn)生特殊的生理效應(yīng)。(7)丙氨酰-酪氨酸對于細胞的作用是雙重的，即可以補充營養(yǎng)需求修復缺損，又可以改善功能狀態(tài)；同時具備承載工具和材料的雙重職責。鑒于丙氨酰-酪氨酸(AY)的種種功能，研究丙氨酰-酪氨酸(AY)的檢測方法迫在眉睫，尤其在白酒行業(yè)，對其所含丙氨酰-酪氨酸進行檢測可作為其品質(zhì)的判斷依據(jù)。
目前行業(yè)內(nèi)對丙氨酰-酪氨酸(AY)的檢測普遍采用比色法和色譜法檢測。其中，比色法只能半定量，液相色譜法不穩(wěn)定，操作費時、檢測時間較長，檢測效率較低。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，本發(fā)明提供了一種快速檢測白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)的方法，旨在利用超高效液相色譜儀串接三重四級桿質(zhì)譜儀對白酒中的丙氨酰-酪氨酸(AY)進行快速、準確的檢測。
本發(fā)明解決技術(shù)問題，采用如下技術(shù)方案：
本發(fā)明快速檢測白酒中丙氨酰-酪氨酸的方法,其特點在于：利用超高效液相色譜串接三重四級桿質(zhì)譜儀對白酒中的丙氨酰-酪氨酸進行檢測；
所用儀器為配有三重四級桿質(zhì)譜儀的超高效液相色譜儀；
所述方法包括如下步驟：
(1)對待測白酒酒樣進行前處理：
準確量取50mL待測白酒酒樣于100mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至3-5mL，去除待測白酒酒樣中的醇類物質(zhì)，然后用超純水定容至10mL，最后經(jīng)0.22μm濾膜針頭過濾器過濾，獲得待測樣品；
(2)設(shè)定超高效液相色譜儀的條件為：
色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column液相色譜柱；
柱溫為30～45℃；
樣品室溫度為10～25℃
流動相：A相由乙腈、水和三氟乙酸按體積比為80：20：0.1構(gòu)成；B相為體積濃度為0.01％～0.1％的三氟乙酸水溶液；
流速為0.2～0.5mL/min；
洗脫方式為梯度洗脫；
進樣量為1-5μL；
檢測所用時間為4min；
三重四級桿質(zhì)譜儀的條件設(shè)定為：
離子化方式：ESI-；
監(jiān)測方式：SIR；
錐孔電壓：25-40V
毛細管電壓：3.00-5.00kV
脫溶劑氣溫度：400-600℃
脫溶劑氣流量：500-1000L/h
錐孔氣流量：50-100L/h
離子源溫度：100-400℃
質(zhì)譜方法參數(shù)表如表1：
表1：質(zhì)譜方法參數(shù)表
(3)丙氨酰-酪氨酸的標準曲線的繪制
取丙氨酰-酪氨酸配制質(zhì)量濃度范圍在50～500ng/mL的一系列標準工作溶液，然后按照步驟(2)所設(shè)定的條件取1.5mL各標準工作溶液進樣、用超高效液相色譜分離、質(zhì)譜檢測，以待測物在質(zhì)譜中的響應(yīng)值對其所相應(yīng)的質(zhì)量濃度進行線性回歸，獲得丙氨酰-酪氨酸的線性回歸方程，所述線性回歸方程所對應(yīng)的曲線即為相應(yīng)的丙氨酰-酪氨酸的標準曲線；丙氨酰-酪氨酸的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)r2見表2，其中X為丙氨酰-酪氨酸的質(zhì)量濃度，Y為對應(yīng)的待測物在質(zhì)譜中的響應(yīng)值。
表2：丙氨酰-酪氨酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限
(4)待測白酒酒樣的檢測
將待測白酒酒樣按步驟(1)的方式進行前處理后，取1.5mL按步驟(2)的條件進行檢測，通過使用質(zhì)譜儀檢測，獲得待測樣品的色譜圖，對待測樣品根據(jù)母離子進行定性分析，然后根據(jù)丙氨酰-酪氨酸的標準曲線對待測白酒進行定量分析。
對本發(fā)明方法作如下靈敏度測試：靈敏度測試包括儀器的靈敏度與方法的靈敏度，儀器的靈敏度用儀器的檢出限表示，取信噪比≥3的丙氨酰-酪氨酸的標準溶液的最小濃度為儀器檢出限；方法的靈敏度用方法的定量限表示，取信噪比≥9的丙氨酰-酪氨酸標準溶液的最小濃度為方法定量限。所得的相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。
對本發(fā)明方法作如下準確性及重現(xiàn)性實驗：選用同一個白酒樣品經(jīng)前處理后作為空白樣品，分為3份，分別加入高、中、低三個濃度的標準工作溶液進行加標回收實驗，計算回收率；選取1個白酒樣品按照上述前處理方法處理6個，分別進行實驗，通過計算其相對標準偏差(RSD)的范圍來判斷分析方法的重現(xiàn)性。所述的準確性用回收率來表示，見表3，方法的重現(xiàn)性用相對標準偏差(RSD)來表示，見表4?？梢钥闯龌厥章试?0～120％，RSD<10％。
表3：丙氨酰-酪氨酸(AY)的加標回收率實驗
表4：丙氨酰-酪氨酸(AY)的重現(xiàn)性實驗
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
1、本發(fā)明建立了一種利用超高效液相色譜串接質(zhì)譜法快速檢測白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)的方法，能夠準確地對白酒中的丙氨酰-酪氨酸(AY)進行定性、定量，為白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)的準確判定、快速檢測提供科學依據(jù)。
2、本發(fā)明超高效液相色譜串接三重四級桿質(zhì)譜儀操作簡單快捷、準確可靠、重復性好(相比其他的方法，效率提高10倍以上，由45min提高到現(xiàn)在的4min)。
3、本發(fā)明ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column液相色譜柱與流動相(A相為乙腈：水：三氟乙酸的體積比為80：20：0.1，B相為0.01％～0.1％三氟乙酸水溶液)的選擇對白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)達到了優(yōu)異的分離效果，峰型較好，能夠與基線完全分離，分離效果較好。
4、本發(fā)明的操作步驟少，從而降低了實驗誤差并提高了數(shù)據(jù)的準確性。
5、本發(fā)明通過降低檢測時間可以節(jié)約人力、物力以及財力,提高了工作效率。
附圖說明
圖1為丙氨酰-酪氨酸(AY)標準溶液的離子流圖。
具體實施方式
為闡明對本發(fā)明的理解，下面結(jié)合實例對本發(fā)明做進一步的闡述。
本實施例按如下步驟對某白酒中丙氨酰-酪氨酸(AY)進行測定，所用儀器為：超高效液相色譜儀(配有三重四級桿質(zhì)譜儀TQD)。
(1)對待測白酒酒樣進行前處理：
準確量取50mL待測白酒酒樣于100mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至4mL，去除待測白酒酒樣中的醇類物質(zhì)，然后用超純水定容至10mL，最后經(jīng)0.22μm濾膜針頭過濾器過濾，獲得待測樣品；
(2)設(shè)定超高效合相色譜儀的條件為：
色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm Column液相色譜柱；
柱溫為30℃；
樣品室溫度為20℃；
流動相：A相由乙腈、水和三氟乙酸按體積比為80：20：0.1構(gòu)成；B相為體積濃度為0.01％的三氟乙酸水溶液；
流速為0.3mL/min；
洗脫方式為梯度洗脫；
進樣量為2μL；
檢測所用時間為4min；
三重四級桿質(zhì)譜檢測器的條件設(shè)定為：
離子化方式：ESI-；
監(jiān)測方式：SIR；
錐空電壓：30V
毛細管電壓：3.00kV
脫溶劑氣溫度：400℃
脫溶劑氣流量：1000L/h
錐空氣流量：50L/h
離子源溫度：150℃
質(zhì)譜方法參數(shù)表如表1：
表1：質(zhì)譜方法參數(shù)表
(3)丙氨酰-酪氨酸的標準曲線的繪制
取丙氨酰-酪氨酸，配制2.5mg/L的儲備液，然后分別將其稀釋，配制成50、100、200、400、500ng/mL的5個不同的標準工作溶液，然后按照步驟(2)所設(shè)定的條件取1.5mL各標準工作溶液進樣、用超高效液相色譜分離、質(zhì)譜檢測(譜圖如圖1所示，譜圖對應(yīng)的是濃度為200ng/mL工作溶液)，以待測物在質(zhì)譜中的響應(yīng)值對其所相應(yīng)的質(zhì)量濃度進行線性回歸，獲得丙氨酰-酪氨酸的線性回歸方程(見表2)，線性回歸方程所對應(yīng)的曲線即為相應(yīng)的丙氨酰-酪氨酸的標準曲線；
(4)待測白酒酒樣的檢測
將待測白酒酒樣按步驟(1)的方式進行前處理后，取1.5mL按步驟(2)的條件進行檢測，通過使用質(zhì)譜儀檢測，獲得待測樣品的色譜圖，對待測樣品根據(jù)母離子進行定性分析，然后根據(jù)丙氨酰-酪氨酸的標準曲線對待測白酒進行定量分析，即獲得待測白酒中所含有的丙氨酰-酪氨酸(AY)及相應(yīng)含量。
(5與現(xiàn)有標準方法(液相方法)的數(shù)據(jù)對比如下：
配置丙氨酰-酪氨酸配制質(zhì)量濃度為50ng/mL、200ng/mL以及400ng/mL的三中樣品，分別通過本發(fā)明方法和國家標準方法進行檢測，監(jiān)測數(shù)據(jù)見表5。
表5：使用兩種檢測方法檢測數(shù)據(jù)比對