本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種對(duì)酚類化合物氧化的生物催化系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

酚類化合物具有廣泛的生理活性，如抗氧化、清除自由基、抗紫外線輻射、抑菌效應(yīng)及抗病毒作用等，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化妝品原料和食品添加劑的生產(chǎn)方面也有著廣泛的用途，與人們的生活和工業(yè)生產(chǎn)密切相關(guān)(cuvelieretal.,2014)。

酚類化合物作為一種重要的生產(chǎn)原料和有機(jī)中間體而被廣泛應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域，所以具有相當(dāng)大的市場(chǎng)需求和應(yīng)用價(jià)值。對(duì)羥基苯甲醛是一種十分重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，被廣泛用于醫(yī)藥、香料、農(nóng)藥、石油化工、電鍍和液晶等領(lǐng)域，尤其是作做為合成抗菌增效劑甲氧芐胺嘧啶、羥氨芐青霉素、羥氨芐頭抱霉素、茴香醛、香蘭素、乙基香蘭素和復(fù)盆子酮等合成的原料(fitzgeraldetal.,2005；guang-youetal.,2009)。對(duì)羥基苯甲酸是用途廣泛的有機(jī)合成原料，特別是其酯類，包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯(尼泊金甲)、乙酯(尼泊金乙)、丙酯等，也可做食品添加劑，用于醬油、醋、清涼飲料(汽水除外)等，還廣泛用于食品、化妝品、醫(yī)藥的防腐、防霉劑和殺菌劑等方面(ritzer&sundermann,2002)。對(duì)羥基苯乙醇是一種重要的醫(yī)藥和香料中間體，其用途廣泛，可用于合成美多心安、倍他洛爾等心血管藥物，合成具有抗衰老、抗疲勞等重要藥理活性的紅景天苷和羥基酪醇，以及合成具有抗艾滋病病毒活性的間羥基內(nèi)精醇和芐基異喹啉生物堿(berninietal.,2011；pesnotetal.,2011)。

另外，研究表明，許多食品飲料(如葡萄酒、茶、咖啡等等)中都含有酚類化合物，這些具有抗氧化作用的生物活性化合物對(duì)人體的健康狀況起到有益的作用(silvaetal.,2000)。

合成化合物的方法主要有傳統(tǒng)的化學(xué)合成法和生物催化/轉(zhuǎn)化法，化學(xué)合成法具有反應(yīng)步驟多、立體選擇性差、條件不夠溫和、容易產(chǎn)生副產(chǎn)物和對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)。

隨著生化技術(shù)的進(jìn)展，酶催化反應(yīng)越來(lái)越多地被有機(jī)化學(xué)家作為一種手段應(yīng)用于化合物合成。利用酶催化反應(yīng)，許多生產(chǎn)原料和有機(jī)中間體得以人工合成，進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)(mandai,2010)。應(yīng)用生物技術(shù)為基礎(chǔ)的酶催化反應(yīng)體系具有很多優(yōu)越性，用酶催化反應(yīng)方法通?？梢砸徊降轿?避免了副產(chǎn)物和中間有害產(chǎn)物的多次轉(zhuǎn)移(nestletal.,2014)。酶催化反應(yīng)過(guò)程通常都是在常溫常壓和接近中性的條件下進(jìn)行的,與常常需要高溫高壓 的化工過(guò)程相比,反應(yīng)條件大大簡(jiǎn)化,不僅反應(yīng)速度快、副產(chǎn)物少，而且對(duì)結(jié)構(gòu)有化學(xué)選擇性和非對(duì)映異構(gòu)體選擇性，并且還有嚴(yán)格的區(qū)域選擇性和對(duì)映體選擇性，因而其投資省,費(fèi)用少,耗能低,并且效果好,過(guò)程穩(wěn)定,操作簡(jiǎn)便。上述這些原因使得酶催化技術(shù)獲得突破性進(jìn)展，成為一個(gè)非常熱門(mén)生物合成研究領(lǐng)域(hudlicky&reed,2009；martinsetal.,2011)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)酚類化合物進(jìn)行氧化的酶催化氧化系統(tǒng)及應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種對(duì)酚類化合物進(jìn)行氧化的生物催化系統(tǒng)，對(duì)酚類化合物進(jìn)行不同程度的氧化的生物催化系統(tǒng)為creh、crei、crej、cree、cref、cred或上述酶的功能等同體。

進(jìn)一步的是，對(duì)酚類化合物進(jìn)行不同程度的氧化的生物催化系統(tǒng)為creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg、crec或上述酶的功能等同體。

生物催化系統(tǒng)creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg、crec的氨基酸編碼序列分別為seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7和seqidno：8，或者與seqidno1、seqidno2、seqidno3、seqidno4、seqidno5、seqidno6、seqidno7和seqidno8同源的其它序列，以及可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中酚類化合物的磷酸化、氧化、水解等任一反應(yīng)的其它相似酶的同源序列。

所述對(duì)酚類化合物進(jìn)行不同程度的氧化為磷酸化、氧化、水解中的一種或幾種。

所述酚類化合物包含但不限于如下：對(duì)甲酚、3-甲基甲酚、4-乙基苯酚、4-丙基苯酚、3-乙基苯酚、4-異丙基苯酚、4-乙烯基苯酚、3-乙烯基苯酚等酚類化合物。

所述對(duì)酚類化合物進(jìn)行磷酸化的催化系統(tǒng)為creh和crei；其，催化系統(tǒng)識(shí)別酚類化合物，對(duì)其酚羥基進(jìn)行磷酸化，生成磷酸化酚類化合物；催化體系包括底物、atp、輔因子mg²⁺、mn²⁺、creh、crei。

所述對(duì)磷酸化酚類化合物進(jìn)行氧化的催化系統(tǒng)為crej、cree和cref；其，催化系統(tǒng)識(shí)別磷酸化酚類化合物，并對(duì)其進(jìn)行氧化，生成磷酸化酚類化合物的氧化產(chǎn)物；所述磷酸化酚類化合物的氧化產(chǎn)物為相應(yīng)的醇、醛、酮、酸中的一種或幾種；催化體系包括底物、nadph、crej、cree、cref。

所述對(duì)磷酸化酚類化合物氧化產(chǎn)物進(jìn)行水解的催化系統(tǒng)為cred；其，識(shí)別磷酸化氧化產(chǎn)物，并對(duì)其磷酸酯鍵進(jìn)行水解，生成去磷酸化氧化產(chǎn)物；所述去磷酸化氧化產(chǎn)物為相應(yīng)的醇、醛、酮、酸中的一種或幾種；催化體系包括底物、輔因子mg²⁺、mn²⁺、cred。

所述對(duì)酚類化合物進(jìn)行磷酸化、氧化和水解的催化系統(tǒng)為creh、crei、crej、cree、cref、cred；其，creh和crei催化系統(tǒng)首先識(shí)別酚類化合物，對(duì)其酚羥基進(jìn)行磷酸化，生成磷酸化酚類化合物；而后crej、cree和cref催化系統(tǒng)識(shí)別磷酸化酚類化合物，并對(duì)其進(jìn)行氧化，生成磷酸化酚類化合物氧化生成相應(yīng)的醇、醛、酮、酸中的一種或幾種的產(chǎn)物；最后cred催化系統(tǒng)識(shí)別磷酸化氧化產(chǎn)物，并對(duì)其磷酸酯鍵進(jìn)行水解，生成去磷酸化氧化生成相應(yīng)的醇、醛、酮、酸中的一種或幾種的產(chǎn)物；催化體系包括底物、輔因子mg²⁺、mn²⁺、nadph、creh、crei、crej、cree、cref、cred。

所述對(duì)酚類化合物進(jìn)行磷酸化、氧化和水解的催化系統(tǒng)為creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg、crec；其，creh和crei催化系統(tǒng)首先識(shí)別酚類化合物，對(duì)其酚羥基進(jìn)行磷酸化，生成磷酸化酚類化合物；其次crej、cree和cref催化系統(tǒng)識(shí)別磷酸化酚類化合物，并對(duì)其進(jìn)行氧化，生成磷酸化酚類化合物氧化生成相應(yīng)的醇、醛、酮、酸中的一種或幾種的產(chǎn)物；再次cred催化系統(tǒng)識(shí)別磷酸化氧化產(chǎn)物，并對(duì)其磷酸酯鍵進(jìn)行水解，生成去磷酸化氧化生成相應(yīng)的醇、醛、酮、酸中的一種或幾種的產(chǎn)物；同時(shí)，creg催化系統(tǒng)識(shí)別氧化磷酸化酚類化合物的醇氧化物和去磷酸化酚類化合物的醇氧化物，從而強(qiáng)化相應(yīng)醇到醛或酮的轉(zhuǎn)化；crec催化系統(tǒng)識(shí)別和氧化磷酸化酚類化合物的醛氧化物以及去磷酸化酚類化合物的醛氧化物，從而強(qiáng)化相應(yīng)醛到酸的轉(zhuǎn)化；催化體系包括底物、輔因子mg²⁺、mn²⁺、nadph、nad⁺、nadp⁺、creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg、crec。

一種對(duì)酚類化合物進(jìn)行氧化的生物催化系統(tǒng)，所述催化系統(tǒng)在氧化催化酚類化合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明對(duì)酚類化合物進(jìn)行氧化的酶催化氧化系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種酚類化合物進(jìn)行不同程度的氧化，生成醇、醛、酮或酸。該方法簡(jiǎn)單易得，對(duì)環(huán)境友好，對(duì)涉及酚類化合物氧化產(chǎn)物的制備和生產(chǎn)具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明酶催化氧化系能對(duì)酚類化合物進(jìn)行廣泛和高效的氧化，生成相應(yīng)的醇、醛、酮或酸產(chǎn)物。該系統(tǒng)對(duì)酚類化合物進(jìn)行氧化，反應(yīng)生產(chǎn)安全，涉及的八個(gè)關(guān)鍵酶制備簡(jiǎn)單，工藝成熟，整個(gè)過(guò)程不含有害雜質(zhì)，無(wú)毒，對(duì)環(huán)境非常友好。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)甲酚磷酸化產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)甲酚磷酸化產(chǎn)物核磁圖譜。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的4-羥基苯甲醇磷酸化產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的4-羥基苯甲醇磷酸化產(chǎn)物核磁圖譜。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的4-羥基苯甲醛磷酸化產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的4-羥基苯甲醛磷酸化產(chǎn)物核磁圖譜。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例提供的4-羥基苯甲酸磷酸化產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例提供的4-羥基苯甲酸磷酸化產(chǎn)物核磁圖譜。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例提供的4-羥基苯甲醇高分辨質(zhì)譜。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例提供的4-羥基苯甲醛高分辨質(zhì)譜。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例提供的4-羥基苯甲酸高分辨質(zhì)譜。

圖12為本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)甲酚一鍋法氧化反應(yīng)的hplc圖譜。

圖13為本發(fā)明實(shí)施例提供的3-甲基苯酚氧化反應(yīng)的hplc圖譜。

圖14為本發(fā)明實(shí)施例提供的3-羥基苯甲醇高分辨質(zhì)譜。

圖15為本發(fā)明實(shí)施例提供的3-羥基苯甲醛高分辨質(zhì)譜。

圖16為本發(fā)明實(shí)施例提供的3-羥基苯甲酸高分辨質(zhì)譜。

圖17為本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)羥基苯乙酮高分辨質(zhì)譜。

圖18為本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)羥基苯丙酮的高分辨質(zhì)譜。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。

首先，利用creh/crei與酚類化合物進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)酚類化合物苯環(huán)上的酚羥基進(jìn)行磷酸化；然后利用crej/cree/cref對(duì)磷酸化產(chǎn)物苯環(huán)上的其它取代基團(tuán)進(jìn)行氧化得到相應(yīng)的醇、醛、酮或酸；最后，利用cred對(duì)氧化的磷酸酯化產(chǎn)物進(jìn)行水解，去除磷酸基團(tuán)，得到去磷酸化酚類化合物的氧化產(chǎn)物醇、醛、酮或酸。為了提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，creg可以用來(lái)提高相應(yīng)醇到醛或酮的轉(zhuǎn)化率；crec可以用來(lái)提高相應(yīng)醛到酸的轉(zhuǎn)化率。

具體為：

(1)creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec酶的表達(dá)和純化。creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec八個(gè)酶的氨基酸序列分別為seqidno1、seqidno2、seqidno3、seqidno4、seqidno5、seqidno6、seqidno7和seqidno8，編碼這八個(gè)酶的基因可通過(guò)以谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicumatcc13032)基因組為模板進(jìn)行pcr的方法獲得，相應(yīng)的基因?yàn)閏reh(ncgl0528)、crei(ncgl0529)、crej(ncgl0530)、cree(ncgl0525)、cref(ncgl0526)、cred(ncgl0524)、creg(ncgl0527)和crec(ncgl0523)。

將獲得的8個(gè)基因分別連接到pet28b蛋白表達(dá)載體上，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到蛋白表達(dá)菌株e.colibl21(de3)中，進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，進(jìn)行超聲裂解，并通過(guò)ni-ata蛋白親和層析柱進(jìn)行蛋白純化。

creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec酶的同源酶或功能等同體可以通過(guò)分子生物學(xué)手段，在數(shù)據(jù)庫(kù)中以creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec8個(gè)酶中任一酶的序列為模板進(jìn)行序列比對(duì)搜索。同源酶或功能等同體包含但不限于如下：分別與8個(gè)酶同源的corynebacteriumefficiensys-314菌株中ce0555、ce0556、ce0557、ce0558、ce0559、ce0560、ce0561、ce0562基因編碼的蛋白質(zhì)；分別與8 個(gè)酶同源的arthrobactersp.fb24菌株中arth_2001、arth_2000、arth_1999、arth_1998、arth_1997、arth_1996、arth_1995、arth_1994基因編碼的蛋白質(zhì)；與creh、crei同源的geobactermetallireducensgs-15菌種中g(shù)met_2100、gmet_2100編碼的蛋白質(zhì)；與crec同源的pseudomonasputidaf1菌株中pput_2043基因編碼的蛋白質(zhì)序列、corynebacteriumglutamicumatcc13032菌株中ncgl2578基因編碼的蛋白質(zhì)序列、pseudomonasmendocinakr1菌株中pcuc基因編碼的蛋白質(zhì)序列；與creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec8個(gè)酶中任一酶同源的其他酶。同源酶或功能等同體的表達(dá)和純化與creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec酶的表達(dá)純化方法相同。

(2)酚類化合物的磷酸化反應(yīng)。建立反應(yīng)體系，以酚類化合物作為底物，反應(yīng)體系中加入atp，并加入輔因子mg²⁺、mn²⁺，加入creh和crei兩種酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度。一定時(shí)間后，可將酚類化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的磷酸化酚類化合物。

(3)磷酸化酚類化合物的氧化反應(yīng)。建立反應(yīng)體系，以磷酸化酚類化合物作為底物，反應(yīng)體系中加入輔因子nadph，加入crej、cree和cref三種酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度。一定時(shí)間后，可將磷酸化酚類化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的磷酸化酚類化合物氧化產(chǎn)物—醇、醛、酮或酸。

(4)磷酸化酚類化合物氧化產(chǎn)物的水解反應(yīng)(酚類化合物氧化產(chǎn)物的獲得)。建立反應(yīng)體系，以磷酸化酚類化合物氧化產(chǎn)物作為底物，反應(yīng)體系中加入輔因子mg²⁺、mn²⁺，加入cred酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度。一定時(shí)間后，可將磷酸化酚類化合物氧化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酚類化合物氧化產(chǎn)物。

(5)酚類化合物醇氧化物(或磷酸化酚類化合物醇氧化物)的氧化反應(yīng)(creg)；建立反應(yīng)體系，以酚類化合物醇氧化物(或磷酸化酚類化合物醇氧化物)作為底物，反應(yīng)體系中加入輔因子nad⁺，加入creg酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度。一定時(shí)間后，可將酚類化合物醇氧化物(或磷酸化酚類化合物醇氧化物)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛或酮氧化產(chǎn)物。

(6)酚類化合物醛氧化物(或磷酸化酚類化合物醛氧化物)的氧化反應(yīng)(crec)；建立反應(yīng)體系，以酚類化合物醛氧化物(或磷酸化酚類化合物醛氧化物)作為底物，反應(yīng)體系中加入輔因子nadp⁺，加入crec酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度。一定時(shí)間后，可將酚類化合物醛氧化物(或磷酸化酚類化合物醛氧化物)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酸氧化產(chǎn)物。

實(shí)施例中，選取4種酚類化合物(對(duì)甲酚、4-乙基苯酚、3-甲酚、4-丙基苯酚)作為酚類化合物的代表，選取谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicumatcc13032)的8個(gè)酶creh(ncgl0528)、crei(ncgl0529)、crej(ncgl0530)、cree(ncgl0525)、cref(ncgl0526)、cred(ncgl0524)、 creg(ncgl0527)和crec(ncgl0523)作為獲取此生物氧化系統(tǒng)中酶的代表進(jìn)行闡述。但本發(fā)明并不局限于此，凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域等同替換，例如與本生物氧化系統(tǒng)8種酶同源的可實(shí)現(xiàn)本系統(tǒng)中磷酸化、氧化、水解任一反應(yīng)的其它酶，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括基因組提取、pcr擴(kuò)增、dna片段連接、酶切、轉(zhuǎn)化等，如無(wú)特殊說(shuō)明，通常按照分子生物學(xué)常規(guī)手段進(jìn)行操作或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1

creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec酶表達(dá)菌株的構(gòu)建。

首先根據(jù)creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec酶八種蛋白相應(yīng)的編碼基因creh(ncgl0528)、crei(ncgl0529)、crej(ncgl0530)、cree(ncgl0525)、cref(ncgl0526)、cred(ncgl0524)、creg(ncgl0527)和crec(ncgl0523)的序列設(shè)計(jì)引物，如下：

creh-f：gcgccatatggctaataaatctttccccaagccc

creh-r：acgcggatccgtggactaggcatgtgtatc

crei-f：tcgccatatgggagacaccatgaccaacagt

crei-r：gcccaagcttaacgaggtagtacgggtaca

crej-f：cgtgccatgggcacaatgacttcccagact

crej-r：cgggaagcttagcgttccaagtcacgggaa

cree-f：gacacatatgaatacttcagctgaaactgga

cree-r：ggagctctcccaagcgggtaaat

cref-f：gcgccatatgaagatcatgtctactattcatt

cref-r：tcataagctttcacacttgcgtttctggcg

cred-f：gacacatatgactcgcagtaatttacccgc

cred-r：cggaattcgagaagcacgcctggttg

creg-f：gacacatatgcctagtccacgcactgttc

creg-r：cggaattcagtagacatgatcttctccttag

crec-f：ccgccatatgccgatgaatgctgcaacca

crec-r：gcgcggatccgtgtttagctgagaactttcag

以谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicumatcc13032)基因組為模板，用上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行pcr，獲得相應(yīng)的dna片段，分別進(jìn)行酶切，而后分別連接到表達(dá)載體pet28b上，構(gòu)建出creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec的表達(dá)載體。分別將creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入e.colibl21(de3)中，篩選得到正確的表達(dá)菌株。

實(shí)施例2

creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec的蛋白表達(dá)與純 化。

分別接種上述獲得的表達(dá)菌株于含有50ug/ml卡那霉素的lb中，37℃，220rpm，培養(yǎng)過(guò)夜。按1:100(v/v)接種新鮮的lb培養(yǎng)基(含4％甘油，50μg/ml卡那霉素)，37℃，220rpm培養(yǎng)2-4小時(shí)，至od600＝0.4-0.6。加入終濃度為0.2mm的iptg，20℃，220rpm培養(yǎng)18小時(shí)。4℃，5000rpm離心5min收集菌體，每1l發(fā)酵液的菌體用50ml裂解緩沖液(nah2po450mm，nacl300mm，甘油10％，咪唑10mm)溶解，用漩渦震蕩儀混勻。用超聲儀對(duì)菌體進(jìn)行超聲裂解，分別收集裂解液，4℃，12000g離心30min，取上清。每50ml上清加入1mlni-nta樹(shù)脂，4℃孵育20min。而后分別加入蛋白純化柱中，靜止10min，收集樹(shù)脂，用洗滌緩沖液(nah2po450mm，nacl300mm，甘油10％，咪唑20mm)洗滌樹(shù)脂，直至無(wú)雜蛋白流出。用洗脫緩沖液(nah2po450mm，nacl300mm，甘油10％，咪唑250mm)洗脫目的蛋白。

利用脫鹽柱或?qū)游龇▽?duì)目的蛋白進(jìn)行脫鹽，分別得到純化目的蛋白。

實(shí)施例3

對(duì)甲酚(4-甲基苯酚)的磷酸化反應(yīng)。

建立酶反應(yīng)體系：

對(duì)甲酚1mm，

mg²⁺20mm，

mn²⁺2mm，

atp1mm，

creh蛋白10μm，

crei蛋白10μm。

30℃孵育30min，即可將對(duì)甲酚轉(zhuǎn)化為對(duì)甲酚磷酸化產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率為100％。反應(yīng)式如下：

對(duì)甲酚磷酸化產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜見(jiàn)圖1，核磁圖譜見(jiàn)圖2。

其中，creh、crei蛋白可以由其同源蛋白或功能等同體替代，也可以實(shí)現(xiàn)將對(duì)甲酚轉(zhuǎn)化為對(duì)甲酚磷酸化產(chǎn)物。

實(shí)施例4

對(duì)甲酚磷酸化產(chǎn)物的氧化反應(yīng)。

建立酶反應(yīng)體系：

對(duì)甲酚磷酸化產(chǎn)物1mm，

nadph2-6mm，

crej蛋白10μm，

cree蛋白10μm，

cref蛋白10μm。

30℃孵育30min，即可將對(duì)甲酚磷酸化產(chǎn)物連續(xù)氧化，轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲醇磷酸化產(chǎn)物、4-羥基苯甲醛磷酸化產(chǎn)物和4-羥基苯甲酸磷酸化產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率為100％。三種產(chǎn)物的產(chǎn)率根據(jù)nadph加入量的不同有所區(qū)別，當(dāng)nadph增加至6mm時(shí)，可完全轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲酸磷酸化產(chǎn)物。

反應(yīng)式如下：

4-羥基苯甲醇磷酸化產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜和核磁圖譜見(jiàn)圖3和圖4，4-羥基苯甲醛磷酸化產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜和核磁圖譜見(jiàn)圖5和圖6，4-羥基苯甲酸磷酸化產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜和核磁圖譜見(jiàn)圖7和圖8。

其中，crej、cree、cref蛋白可以由其同源蛋白或功能等同體替代，也可以實(shí)現(xiàn)將對(duì)甲酚磷酸化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的磷酸化氧化產(chǎn)物。

實(shí)施例5

對(duì)甲酚磷酸化氧化產(chǎn)物的水解反應(yīng)。

建立酶反應(yīng)體系：

對(duì)甲酚磷酸化氧化產(chǎn)物1mm，

mg²⁺20mm，

mn²⁺2mm，

cred蛋白10μm。

30℃孵育30min，即可將對(duì)甲酚磷酸化對(duì)甲酚氧化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲醇、4-羥基苯甲醛和4-羥基苯甲酸，轉(zhuǎn)化率都為100％。反應(yīng)式如下：

4-羥基苯甲醇的高分辨質(zhì)譜見(jiàn)圖9，4-羥基苯甲醛的高分辨質(zhì)譜見(jiàn)圖10，4-羥基苯甲酸的高分辨質(zhì)譜見(jiàn)圖11。

其中，cred蛋白可以由其同源蛋白或功能等同體替代，也可以實(shí)現(xiàn)將對(duì)甲酚磷酸化氧化產(chǎn)物水解為相應(yīng)的氧化產(chǎn)物。

實(shí)施例6

creg對(duì)4-羥基苯甲醇或磷酸化4-羥基苯甲醇的氧化反應(yīng)。

建立酶反應(yīng)體系：

4-羥基苯甲醇或磷酸化4-羥基苯甲醇1mm，

nad⁺2mm，

creg蛋白10μm。

30℃孵育30min，即可將4-羥基苯甲醇或磷酸化4-羥基苯甲醇轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲醛或磷酸化4-羥基苯甲醛，轉(zhuǎn)化率都為100％。反應(yīng)式如下：

其中，creg蛋白可以由其同源蛋白或功能等同體替代，也可以實(shí)現(xiàn)將4-羥基苯甲醇或磷酸化4-羥基苯甲醇轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲醛或磷酸化4-羥基苯甲醛。

實(shí)施例7

crec對(duì)4-羥基苯甲醛或磷酸化4-羥基苯甲醛的氧化反應(yīng)。

建立酶反應(yīng)體系：

4-羥基苯甲醛或磷酸化4-羥基苯甲醛1mm，

nadp⁺2mm，

crec蛋白10μm。

30℃孵育30min，即可將4-羥基苯甲醛或磷酸化4-羥基苯甲醛轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲酸或磷酸化4-羥基苯甲酸，轉(zhuǎn)化率都為100％。反應(yīng)式如下：

其中，crec蛋白可以由其同源蛋白或功能等同體替代，也可以實(shí)現(xiàn)將4-羥基苯甲醛或磷酸化4-羥基苯甲醛轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲酸或磷酸化4-羥基苯甲酸。

實(shí)施例8

對(duì)甲酚的一鍋法氧化反應(yīng)。

建立酶反應(yīng)體系：

對(duì)甲酚1mm，

mg²⁺20mm，

mn²⁺2mm，

atp3mm，

nad⁺1mm，

nadp⁺1mm，

nadph⁺1-3mm，

creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec蛋白各10μm。

30℃孵育30min，即可將對(duì)甲酚轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲酸，轉(zhuǎn)化率為100％。反應(yīng)式如下：

hplc圖譜見(jiàn)圖12。

其中，creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec蛋白可以由其同源蛋白或功能等同體替代，也可以實(shí)現(xiàn)將對(duì)甲酚轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲酸。

實(shí)施例9

此系統(tǒng)對(duì)3-甲基苯酚的氧化反應(yīng)。

根據(jù)實(shí)施例3-5的條件，以3-甲基苯酚為底物分別進(jìn)行磷酸化、氧化、水解反應(yīng)。

建立反應(yīng)體系，以3-甲基苯酚作為底物，反應(yīng)體系中加入atp，并加入輔因子mg²⁺、mn²⁺，加入creh和crei兩種酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度，將3-甲基苯酚轉(zhuǎn)化為磷酸化3-甲基苯酚；以磷酸化3-甲基苯酚作為底物，反應(yīng)體系中加入輔因子nadph，加入crej、cree和cref三種酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度，將磷酸化3-甲基苯酚轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的磷酸化氧化產(chǎn)物；建立反應(yīng)體系，以磷酸化氧化產(chǎn)物作為底物，反應(yīng)體系中加入輔因子mg²⁺、mn²⁺，加入cred酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度，將磷酸化氧化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為3-羥基苯甲醇、3-羥基苯甲醛、3-羥基苯甲酸。反應(yīng)式如下：

hplc圖譜見(jiàn)圖13，相應(yīng)的高分辨質(zhì)譜見(jiàn)圖14-16。

其中，creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec蛋白可以由其同源蛋白或功能等同體替代。

實(shí)施例10

此系統(tǒng)對(duì)4-乙基苯酚的氧化反應(yīng)。

根據(jù)實(shí)施例3-5的條件，以4-乙基苯酚為底物進(jìn)行分別進(jìn)行磷酸化、氧化、水解反應(yīng)。

建立反應(yīng)體系，以4-乙基苯酚作為底物，反應(yīng)體系中加入atp，并加入輔因子mg²⁺、mn²⁺，加入creh和crei兩種酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度，將4-乙基苯酚轉(zhuǎn)化為磷酸化4-乙基苯酚；以磷酸化4-乙基苯酚作為底物，反應(yīng)體系中加入輔因子nadph，加入crej、cree和cref三種酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度，將磷酸化4-乙基苯酚轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的磷酸化對(duì)羥基苯乙酮；建立反應(yīng)體系，以磷酸化對(duì)羥基苯乙酮作為底物，反應(yīng)體系中加入輔因子mg²⁺、mn²⁺，加入cred酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度，將磷酸化對(duì)羥基苯乙酮轉(zhuǎn)化為對(duì)羥基苯乙酮。

反應(yīng)式如下：

高分辨質(zhì)譜見(jiàn)圖17。

其中，creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec蛋白可以由其同源蛋白或功能等同體替代。

實(shí)施例11

此系統(tǒng)對(duì)4-丙基苯酚的氧化反應(yīng)。

根據(jù)實(shí)施例3-5的條件，以4-丙基苯酚為底物分別進(jìn)行磷酸化、氧化、水解反應(yīng)。

建立反應(yīng)體系，以4-丙基苯酚作為底物，反應(yīng)體系中加入atp，并加入輔因子mg²⁺、mn²⁺，加入creh和crei兩種酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度，將4-丙基苯酚轉(zhuǎn)化為磷酸化4-丙基苯酚；以磷酸化4-丙基苯酚作為底物，反應(yīng)體系中加入輔因子nadph，加入crej、cree和cref三種酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度，將磷酸化4-丙基苯酚轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的磷酸化對(duì)羥基苯丙酮；建立反應(yīng)體系，以磷酸化對(duì)羥基苯丙酮作為底物，反應(yīng)體系中加入輔因子mg²⁺、mn²⁺，加入cred酶作為酶反應(yīng)催化劑，選擇30℃作為酶反應(yīng)溫度，將磷酸化對(duì)羥基苯丙酮轉(zhuǎn)化為對(duì)羥基苯丙酮。反應(yīng)式如下：

高分辨質(zhì)譜見(jiàn)圖18。

其中，creh、crei、crej、cree、cref、cred、creg和crec蛋白可以由其同源蛋白或功能等同體替代。

seqidno：1

manksfpkpsdlpvpkgaegwedlypyylvfqdklmdqenekfwfcdsqhwptvfkpfetiggefavkclgqynarhlmipnangiefrvhlgylymspipvpedqiaervpmfqerithyfqnwepmlanwkervlgtineleslefkplpdyvpiddivsgkakdgtevlmenfdrliqlayqnwqyhfeflnlgyiayldffnfckevfpdipdqsismmvqgvdmelfrpddelkilaqlavdlglqthfanpddpqatlaaiakaeggatwiarweeaqdpwfnftvgngfyghdkywiehlelplgyiadyirrldegqtisrpkdeliaekervveeyrdlldgeqlaqfdakcglaataypyvenhnfyiehwtmsvfwrkvrelsrtlqgygfweneddmlylnrtevrdvlfdlatawgvgapggpigtiiwpeeierrkaivtalktarpapalntppesitepftrmlwgitteqvqswlgndedaeegtlkgmaaspgvvegyarvilsaddlseiqqdeilvapvtapswgpifgkikatvtdiggmmshaaivcreyglpavtgtgaasttiktgdylkvdgtkgkvvivdpdapriegpgahshahsvaahgvdtha

(a)序列特征：

●長(zhǎng)度：725aa

●類型：蛋白序列

(b)分子類型：蛋白質(zhì)

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來(lái)源：谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum

(f)特異性名稱：creh

seqidno：2

mtnslnipfvqrfdegldpvlevlggkgaslvtmtdagmpvppgfvvttasfdefireagvaehidkflndldaedvkevdrvsaiirdelcsldvpenarfavhqayrdlmercggdvpvavrssataedlpdasfagqqdtylwqvglsavtehirkcwaslftsraiiyrlknnipneglsmavvvqkmvnsrvagvaitmnpsngdrskitidsswgvgemvvsgevtpdnilldkitlqvvsehigskhaelipdatsgslvekpvdeeranrrsltdeemlavaqmakraekhykcpqdiewaldadlpdgenllllqsrpetihsngvkketptpqaaktigtfdfssitvamtgtk

(a)序列特征：

●長(zhǎng)度：364aa

●類型：蛋白序列

(b)分子類型：蛋白質(zhì)

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來(lái)源：谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum

(f)特異性名稱：crei

seqidno：3

mtsqtsqqststggcpfghtsestshhgyqpfdmhnpfpaykelrqeepvmfderigywvvtkyddikttfddwetfssenaqapvrkrgpqatqimtdggftaysglsarippehtriraiaqkaftprrykalepdiramvidrvekmlandqhvgdmvsdlaydiptitiltligadismvdtykrwsdsraamtwgdlsdeeqiphahnlveywqecqrmvadahahggdnltadlvraqqegqeitdheiasllysllfaghettttlisncfrvlldhpeqwqailenpklipaavdevlrysgsivgwrrkalkdteiggvaikegdgvlllmgsanrdearfengeefdisranarehlsfgfgihyclgnmlaklqakicleevtrlvpslhlvadkaigfrenlsfrvptsvpvtwna

(a)序列特征：

●長(zhǎng)度：428aa

●類型：蛋白序列

(b)分子類型：蛋白質(zhì)

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來(lái)源：谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum

(f)特異性名稱：crej

seqidno：4

mntsaetgiliiganqsgvqlaislratgftesitllgeedhrpyqrpalskeflqdkidkerlifrsneyweennirlvkgvrierieknddgsgvaygagqefafrrlalavgarprhldlpgatlegvtylrnaddalalkamigsvtdavvvgggfigleaacslhdlgknvtvleygprligravgeetaaffleqhrsrgvnivldarmkqfvgkdgklsgieledgtvipaqlvivgigvipntelaav lgldinngivvdkhavasdgttiaigdvanipnpipgspaderirlesvnnaiehakiaayslvgqpeayagipwfwsnqgdlklqiagltlgydstvirqdpekkkfsvlyyrgdniiaadcvnapldfmavrsalsrnqnipadlaadisqplkklavdlevtr

(a)序列特征：

●長(zhǎng)度：422aa

●類型：蛋白序列

(b)分子類型：蛋白質(zhì)

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來(lái)源：谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum

(f)特異性名稱：cree

seqidno：5

mstihfidhagktrtieatvgdsvmetavrngvpgivaecggslscatchvfvdpaqydalppmeemedemlwgaavdredcsrlscqikvtegmdlslttpetqv

(a)序列特征：

●長(zhǎng)度：106aa

●類型：蛋白序列

(b)分子類型：蛋白質(zhì)

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來(lái)源：谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum

(f)特異性名稱：cref

seqidno：6

mtrsnlpaweqadpsvhasdpraitfaedfgirpipavgpidttaicatpsngfeqlwkaiepetrtrandihlpivvayaerlcdaypladrelvlvaailhdtgwahvdesriisegfsgnwrkaairfehetegctvarrvlpslgytvdfvehvcdiidghdtrqvaysledalvrdcdrlwrfdragitassswfgmpvsdyvdrlhreilpeliteaahqmatadlnrakallrtdair

(a)序列特征：

●長(zhǎng)度：245aa

●類型：蛋白序列

(b)分子類型：蛋白質(zhì)

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來(lái)源：谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum

(f)特異性名稱：cred

seqidno：7

mpsprtvlitgaagglgrafaegfaaqgdriavadinldgaqetvdklkalgadaaafevdvtslestealaagaaefgggridvlinnaaiyatvtrspfedidpaewdlvmgvnlkgpwlvtrsvspflsdnarvvnlssatvfsgsahwahyvaskggvialtrvlakelggrgitvnavapgftlteaslglmdsaetygvdrgsikrasqpkdivgttmflaspeaeyitgqtlivdggrqfi

(a)序列特征：

●長(zhǎng)度：248aa

●類型：蛋白序列

(b)分子類型：蛋白質(zhì)

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來(lái)源：谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum

(f)特異性名稱：creg

seqidno：8

mnaatrraslqlpythvddfyingswvkaegtqrnpvvdpavgqewgsvpeataseldsavgaartalkswsaltgaertgyllkiateiesrsealaltntrengspisetrgaasnaagifryfatlapwldgedirpfpagsaesivdkdpigvcaliapwnfpinlvviklapallagctviikpasptplsirfiieaieaagvpagvvnlltgsgrfgdalvrhpgvdkvaftgstpvgkkiaaacgellrpvtlelggkssaiilpdadmsvlstrlirscmrntgqtcyistriiapssryaevvqtvastiaagrqgdpydeetvfgpvasasqystvmsyidsareegarvvaggtrsislseglesgefiqptvfadvtpdmrisreeifgpvisilkyddtngvseaialanntkfglgglvfgadeeqalevarqvdsgsvginffgsnhsapfggrhesgmgveygieglsayltyksihrti

(a)序列特征：

●長(zhǎng)度：497aa

●類型：蛋白序列

(b)分子類型：蛋白質(zhì)

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來(lái)源：谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum

(f)特異性名稱：crec

參考文獻(xiàn)

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