本發(fā)明屬于生物技術(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種體外擴(kuò)增基因編輯活化t細(xì)胞的培養(yǎng)方法、試劑盒及其應(yīng)用。包括但不限于采用zfn、talen、crispr-cas9等基因組編輯技術(shù)所構(gòu)建的功能活化的t細(xì)胞培養(yǎng)方法、試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著免疫學(xué)研究的不斷深入，腫瘤免疫治療取得巨大進(jìn)展。腫瘤免疫治療通過(guò)激發(fā)或調(diào)動(dòng)患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞，腫瘤免疫治療也被認(rèn)為是繼手術(shù)、放療、化療后第四大腫瘤治療技術(shù)。近十年來(lái)，以過(guò)繼細(xì)胞免疫療法(adoptivecelltherapy，act)和免疫檢查點(diǎn)療法(immunecheckpointtherapy)為代表的腫瘤免疫治療方法取得了突破性進(jìn)展，顯示出良好的應(yīng)用前景，標(biāo)志著腫瘤治療新時(shí)代的開(kāi)啟。
在腫瘤免疫治療方案中，t淋巴細(xì)胞處于中心地位。體內(nèi)腫瘤特異性的細(xì)胞免疫功能的低下是腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視無(wú)限制生長(zhǎng)的重要原因之一。細(xì)胞生物治療技術(shù)將自體免疫細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)、分化、擴(kuò)增再回輸至體內(nèi)，繞過(guò)體內(nèi)腫瘤免疫屏障機(jī)制，通過(guò)激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)來(lái)對(duì)抗、抑制和殺滅癌細(xì)胞。如何在體外獲得足夠量可供臨床應(yīng)用的t細(xì)胞是腫瘤過(guò)繼免疫療法中首要面臨的問(wèn)題。
基因組編輯(genomeediting)技術(shù)是在基因組水平上對(duì)dna序列進(jìn)行定點(diǎn)改造修飾的遺傳操作技術(shù)，該技術(shù)被譽(yù)為“后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的助力器”?；蚪M編輯技術(shù)的原理是通過(guò)構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在靶位點(diǎn)切斷dna，產(chǎn)生dna雙鏈斷裂(double-strandbreak，dsb)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的dna修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行非同源末端連接(nonhomologousendjoining，nhej)和同源重組修復(fù)(homologousrecombination，hr)。通過(guò)這兩種修復(fù)途徑，基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因敲除、特異突變引入和定點(diǎn)修飾。但在基因組編輯技術(shù)未被發(fā)現(xiàn)之前，科學(xué)家們只能通過(guò)同源重組的方式對(duì)基因組進(jìn)行定向修飾。但是這種方式過(guò)度依賴(lài)自然重組，效率極低，不能滿(mǎn)足人類(lèi)日益發(fā)展的科研需求。在此情況下，基因編輯技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。在近幾年中，人工核酸內(nèi)切酶(engineeredendonuclease，een)技術(shù)的興起使得基因編輯變得簡(jiǎn)單可行，現(xiàn)常用的een技術(shù)主要為鋅指核酸酶(zincfingernuclease，zfn)、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，talen)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)技術(shù)(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat，crispr)。
目前，在腫瘤細(xì)胞免疫治療中，t細(xì)胞是抗腫瘤細(xì)胞免疫的核心角色，然而，腫瘤細(xì)胞往往表達(dá)一些配體與t細(xì)胞結(jié)合后，抑制t細(xì)胞的活化、增殖及對(duì)腫瘤的殺傷，使其功能發(fā)生紊亂和枯竭，從而達(dá)到免疫逃避的目的。通過(guò)基因編輯技術(shù)將t細(xì)胞中的特定基因或者基因群敲除掉，從而能夠更好的起到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提高經(jīng)過(guò)基因編輯技術(shù)處理過(guò)的t細(xì)胞的擴(kuò)增速度、減少擴(kuò)增時(shí)間、提供一種能夠經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、高效地?cái)U(kuò)增基因編輯活化t細(xì)胞的培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基及其應(yīng)用，從而提高該基因編輯活化t細(xì)胞對(duì)腫瘤或其它疾病的治療作用。
本發(fā)明提供的一種體外擴(kuò)增基因編輯活化t細(xì)胞的培養(yǎng)基，包含t細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包含：白細(xì)胞介素7(il-7)200-1000iu/ml、白細(xì)胞介素21(il-21)300-1000iu/ml、抗cd40單克隆抗體80-120ng/ml、絲氨酸0.2-1.0mmol/ml和s-2-羥戊二酸0.3-1.0mmol/ml。
作為優(yōu)選方案，所述培養(yǎng)基包含t細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包含：白細(xì)胞介素7(il-7)500iu/ml、白細(xì)胞介素21(il-21)550iu/ml、抗cd40單克隆抗體100ng/ml、絲氨酸0.45mmol/ml和s-2-羥戊二酸0.5mmol/ml。
作為優(yōu)選方案，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為rpmi-1640培養(yǎng)基。
本發(fā)明上述培養(yǎng)基不僅可以用于培養(yǎng)基因編輯活化t細(xì)胞，也可以用于培養(yǎng)普通的t細(xì)胞。
因此本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供利用所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)t細(xì)胞方面的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的一種體外擴(kuò)增基因編輯活化t細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
(1)對(duì)經(jīng)基因修飾后的t細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)，所用培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包含抗cd40單克隆抗體80-120ng/ml；
(2)預(yù)培養(yǎng)后，向步驟(1)培養(yǎng)基中加入白細(xì)胞介素7(il-7)200-1000iu/ml、白細(xì)胞介素21(il-21)300-1000iu/ml、抗cd40單克隆抗體80-120ng/ml、絲氨酸0.2-1.0mmol/ml和s-2-羥戊二酸0.3-1.0mmol/ml，進(jìn)行高效擴(kuò)增培養(yǎng)。
作為優(yōu)選方案，步驟(1)中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為rpmi-1640培養(yǎng)基。
作為優(yōu)選方案，步驟(1)中，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。
作為優(yōu)選方案，步驟(2)中，向步驟(1)培養(yǎng)基中加入白細(xì)胞介素7(il-7)500iu/ml、白細(xì)胞介素21(il-21)550iu/ml、抗cd40單克隆抗體100ng/ml、絲氨酸0.45mmol/ml和s-2-羥戊二酸0.5mmol/ml，進(jìn)行高效擴(kuò)增培養(yǎng)。
可選的，所述基因修飾的技術(shù)包括zen，talen或crispr/cas9。
進(jìn)行所述基因修飾時(shí)，是修飾t細(xì)胞中的相關(guān)激活和/或抑制基因。
cd40是t細(xì)胞表面膜蛋白受體之一，cd40與其配體結(jié)合可以通過(guò)激活mtorc1通路，起到pd-1拮抗劑的作用，從而起到促進(jìn)t細(xì)胞快速增殖的作用，本發(fā)明利用抗cd40抗體與cd40結(jié)合從而激活mtorc1通路，促進(jìn)t細(xì)胞快速增殖。
本發(fā)明培養(yǎng)基中加入的絲氨酸和s-2-羥戊二酸都是t細(xì)胞在快速增殖過(guò)程中進(jìn)行能量代謝所必須的物質(zhì)，額外添加一定量的絲氨酸和s-2-羥戊二酸可以大大提高t細(xì)胞的增殖速度。
利用本發(fā)明的培養(yǎng)基，在無(wú)需加入異體血清及其他活化t細(xì)胞因子的條件下可以大量擴(kuò)增基因編輯活化t細(xì)胞，該培養(yǎng)基的誘導(dǎo)方法快速高效、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單、效果穩(wěn)定。另外，根據(jù)行業(yè)通用的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，所述體外擴(kuò)增基因編輯活化t細(xì)胞的方法能夠激活擴(kuò)增t細(xì)胞500-1000倍，明顯高于現(xiàn)有技術(shù)。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例是對(duì)于本發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這些具體實(shí)施方式。本發(fā)明所述基因編輯活化t細(xì)胞中所用的基因編輯技術(shù)主要包括zfn、talen、crispr-cas9等，但本發(fā)明不限于使用以上三種基因編輯技術(shù)。本發(fā)明所述一種體外擴(kuò)增基因編輯活化t細(xì)胞的培養(yǎng)方法、試劑盒及其應(yīng)用主要用于t細(xì)胞體外分離、誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)、擴(kuò)增等；其處理的生物制品包括人外周血、臍帶血、胸水、腹水等；可以應(yīng)用于臨床細(xì)胞生物治療，包括肺癌、腎癌、黑色素瘤、白血病、乳腺癌、直腸癌、胃癌、食道癌、宮頸癌、卵巢癌、骨髓癌、惡性淋巴瘤等惡性腫瘤疾病，也可以應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究、臨床應(yīng)用研究及生物技術(shù)研究，尤其可以應(yīng)用于免疫系統(tǒng)研究和腫瘤殺傷作用的研究。具體實(shí)施例如下：
實(shí)施例1(實(shí)驗(yàn)組)
運(yùn)用crispr-cas9技術(shù)敲除人pd-1基因t細(xì)胞分離和高效擴(kuò)增培養(yǎng)
現(xiàn)以人外周血為處理樣品，運(yùn)用crispr-cas9技術(shù)敲除人pd-1基因，構(gòu)建pd-1基因敲除t細(xì)胞，并對(duì)該基因編輯活化t細(xì)胞進(jìn)行體外高效擴(kuò)增培養(yǎng)。具體步驟如下：
步驟一：從血液中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞
直接抽取供者靜脈血80～100ml，加入抗凝劑--肝素；
將采集的血樣在室溫下2000rpm離心10min，小心吸取上層血漿層培養(yǎng)時(shí)備用；血樣樣本還原至原體積，混勻；稀釋血緩慢加在ficoll上，1000rpm離心20min；吸取分離液界面乳白色單個(gè)核細(xì)胞層，離心洗滌2次，得到pbmc。
步驟二：從pbmc中分離t細(xì)胞
取分離的pbmc，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基rpmi-1640配成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1～2×106個(gè)/ml，37℃，5％co2孵育2小時(shí)后搜集懸浮細(xì)胞即為t細(xì)胞。
步驟三：運(yùn)用crispr-cas9技術(shù)敲除t細(xì)胞上的人pd-1基因
構(gòu)建攜帶pd-1基因sgrna寡聚核苷酸病毒載體
根據(jù)sgrna的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)sgrna在pd-1基因上的靶序列，合成sgrna寡聚核苷酸雙鏈，混合后于95℃退火5min，之后與線性化的慢病毒載體連接，獲得攜帶pd-1基因sgrna寡聚核苷酸病毒載體；
構(gòu)建攜帶cas9-核酸酶相關(guān)載體
將cas9核酸酶克隆進(jìn)相關(guān)載體中，獲得cas9-核酸酶載體；
轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞
采用特定方式將對(duì)應(yīng)的sgrna和cas9-核酸酶同步轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟二收集的t細(xì)胞，完成敲除人pd-1基因，即獲得敲除pd-1基因t細(xì)胞。
步驟四：預(yù)培養(yǎng)pd-1基因敲除t細(xì)胞
收集pd-1基因敲除t細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基rpmi-1640中，加入抗cd40抗體80～120ng/ml，37℃，5％co2孵育培養(yǎng)48h。
步驟五：pd-1基因敲除t細(xì)胞的高效擴(kuò)增培養(yǎng)
向步驟四培養(yǎng)48h后的t細(xì)胞培養(yǎng)液中加入白細(xì)胞介素7(il-7)500iu/ml、白細(xì)胞介素21(il-21)550iu/ml、抗cd40單克隆抗體100ng/ml、絲氨酸0.45mmol/ml和s-2-羥戊二酸0.5mmol/ml繼續(xù)培養(yǎng)。每隔兩天用培養(yǎng)液半量換液，所述半量換液為取一半含細(xì)胞的培養(yǎng)基，離心收集細(xì)胞后去除培養(yǎng)基，加入含有白細(xì)胞介素7(il-7)500iu/ml、白細(xì)胞介素21(il-21)550iu/ml、抗cd40單克隆抗體100ng/ml、絲氨酸0.45mmol/ml和s-2-羥戊二酸0.5mmol/ml的rpmi-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。
從步驟五開(kāi)始，培養(yǎng)48h后，將t細(xì)胞轉(zhuǎn)移至t175培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。以保證細(xì)胞有充足的生長(zhǎng)空間。
從步驟五開(kāi)始，培養(yǎng)14～21天后，收集t細(xì)胞，將t細(xì)胞離心后，使用生理鹽水洗滌三次，即得到活化的t細(xì)胞。
對(duì)比實(shí)施例1：未添加抗cd40單克隆抗體、絲氨酸、s-2-羥戊二酸(對(duì)照組1)
除了實(shí)施例1中步驟四和步驟五中不添加抗cd40單克隆抗體、絲氨酸、s-2-羥戊二酸以外，其他具體操作步驟如實(shí)施例1。
對(duì)比實(shí)施例2(對(duì)照組2)：
除了實(shí)施例1中步驟四和步驟五中添加的抗cd40單克隆抗體的濃度為70ng/ml、絲氨酸的濃度為1.1mmol/ml以外，其他具體操作步驟如實(shí)施例1。
對(duì)比實(shí)施例3(對(duì)照組3)
除了實(shí)施例1中步驟四和步驟五中添加的抗cd40單克隆抗體的濃度為130ng/ml、s-2-羥戊二酸的濃度為0.25mmol/ml以外，其他具體操作步驟如實(shí)施例1。對(duì)實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組1～3所得的基因編輯t細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增倍數(shù)檢測(cè)。
在第1、7、14、21天取200μl細(xì)胞，吹打成單個(gè)細(xì)胞，利用counterstar自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)＝當(dāng)天計(jì)數(shù)的細(xì)胞總數(shù)/第1天培養(yǎng)前的細(xì)胞總數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。
表1t細(xì)胞在不同時(shí)間細(xì)胞數(shù)量的變化(×108/l)