本發(fā)明屬于生物防控領(lǐng)域，具體涉及到能夠特異性裂解水稻白葉枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae)菌株的噬菌體分離物和其作為生物農(nóng)藥在植物病害防治中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

噬菌體(bacteriophage，phage)是一種在細(xì)胞內(nèi)生長繁殖的病毒，早在1896年，hankin通過研究發(fā)現(xiàn)，在印度的恒河和亞穆納河的河水中，存在一種可以通過磁性濾器的物質(zhì)，其對(duì)霍亂有明顯的抗菌作用。隨后，edwardtwort和felixdherele分別在1915年和1917年各自獨(dú)立發(fā)現(xiàn)一種物質(zhì)，他們發(fā)現(xiàn)這一物質(zhì)能夠特異性裂解宿主細(xì)菌，并在雙層平板上形成空斑，因此將其命名為噬菌體(何覓之.大腸桿菌k88、k99光譜噬菌體的分離與生物學(xué)特性鑒定.2012)。自生物進(jìn)化至今，環(huán)境中的噬菌體數(shù)量已達(dá)到10¹¹(艾振江.小單孢菌40027菌株的分離及其特性的研究.2009)，其廣泛分布于蘇竹君的周圍，并以不同的形態(tài)和生活方式存在。目前，海洋是噬菌體含量最高的地方，平均每毫升海水中的噬菌體的含量可高達(dá)9×10⁸個(gè)，并且海洋中的70％的細(xì)菌都能被噬菌體感染(brtissow,2005)。

噬菌體是一種細(xì)菌病毒，無法獨(dú)立繁殖，通過利用宿主細(xì)胞中的各類生長因子，包括核糖體、氨基酸、能量產(chǎn)生系統(tǒng)，來實(shí)現(xiàn)其自身生長繁殖，同時(shí)特異性裂解一種減少或至少幾種細(xì)菌。噬菌體有嚴(yán)格的宿主特異性，只侵染敏感菌，對(duì)動(dòng)植物細(xì)胞和其他細(xì)菌沒有感染性。噬菌體的繁殖過程，有烈性循環(huán)和溶源性循環(huán)兩種途徑。烈性循環(huán)即噬菌體侵染宿主菌后立即展開復(fù)制增值過程，在短時(shí)間內(nèi)連續(xù)完成吸附、侵染、復(fù)制、裝配、釋放五個(gè)步驟，最終使宿主細(xì)胞裂解釋放出子代噬菌體；溶源性循環(huán)即噬菌體侵染宿主菌后，并不立即使宿主細(xì)胞裂解，而是直接將自身的基因組整合到宿主菌基因組上，當(dāng)出現(xiàn)生物或化學(xué)因素刺激時(shí)，已經(jīng)整合的前噬菌體進(jìn)入復(fù)制階段，從而裂解宿主菌，釋放子代噬菌體。根據(jù)其增值方式的不同，將經(jīng)歷烈性循環(huán)的噬菌體稱為烈性噬菌體，經(jīng)歷溶源性循環(huán)的噬菌體稱為溫和噬菌體。其中，烈性噬菌體在殺菌效果上有著廣泛的應(yīng)用，作為生物農(nóng)藥制劑具有極大的應(yīng)用價(jià)值與應(yīng)用前景。

早在1921年，黃單胞菌被認(rèn)為是胡椒和番茄的細(xì)菌性瘡痂病的病原菌(doidgeem.atomatocanker.ammapplbiol.1921,7:407-430.)。隨后，dowson重新將該細(xì)菌命名為野油菜黃單胞菌(dowsondw.onthesystematicpositionandgeneticnamesofthegramnegative bacterialplantpathogens.zenfurbak,paraundinf.1939,100:177-193.)，并提出了黃單胞菌屬的概念(youngjm,dyedw,bradburyjf,etal.aproposednomenclatureandclassificationforplantpathogenicbacteria.nzjagrires.1978,21(1):153-177.)。黃單胞菌會(huì)引發(fā)細(xì)菌性病點(diǎn)斑，以及使多種植物的葉片、莖、果實(shí)的枯萎(bochj,bonasu.xanthomonasavrbs3family-typeiiieffectors:discoveryandfunc.annurevphytopathol.2010,48:419-436.)。這些致病菌表現(xiàn)出了較高的特異性，根據(jù)其宿主的不同，這些致病菌也分成了很多治病變種，并用其宿主的名字進(jìn)行命名，如由柑橘黃單胞菌(xanthomonascitrisubsp.citri)引起的柑橘潰瘍病，是一種在柑橘品種種植區(qū)(包括酸橙、檸檬、橘子等)能引起重大經(jīng)濟(jì)損失的植物疾病(rodriguez-rlm,grajalesa,arrieta＝ortizml,etal..genomes-basedphylogenyofthegenusxanthomonas.bmcmicrobiol.2012,12(1):43.)。黃單胞菌易于在水中或種子和植物繁殖過程中傳播，當(dāng)接觸到易感植株時(shí)，該細(xì)菌就會(huì)經(jīng)由由植物的傷口或天然開后侵染植物(radeakerjlw,louwsfj,schultzmh,etal..acomprehensivespeciestostraintaxonomicframeworkforxanthomonas.phytopathology,2005,95(9):1098-1111.)，入侵后，黃單胞菌的分泌系統(tǒng)將分泌大量的效應(yīng)蛋白，從而引起植物的細(xì)菌性疾病。

在黃單胞菌屬中，有一類細(xì)菌能引起水稻相關(guān)疾病，因而命名為水稻黃單胞菌(xanthomonasoryzae)。這種黃單胞菌中有兩個(gè)致病變種，分別為引起水稻白葉枯病的水稻白葉枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae,簡稱xoo)及引起水稻條斑病的水稻細(xì)菌性條斑病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzicola,簡稱xoc)。水稻白葉枯病菌菌體呈桿狀，菌體被粘質(zhì)的胞外多糖包圍。在自然條件下，該病菌不僅可以侵染栽培稻、野生稻等水稻，也使李氏禾和茭白等禾本科植物致病。水稻的葉部存在水孔，其根、莖部也可能存在傷口。白葉枯病菌從這些部位侵入植物體，從而使水稻患病。被侵染的水稻植株的葉片兩側(cè)會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則水漬狀壞死斑。由白葉枯病菌引起的細(xì)菌性葉疫病是全球水稻種植區(qū)最嚴(yán)重的一種細(xì)菌性疾病(hopkinscm,whiteff,choish,etal..identificationofafamilyofavirulencegenesfromxanthomonasoryzaepv.oryzae.mololantmicrobeinteract,1992,5(6):451-459.)，尤其是亞洲的高產(chǎn)水稻種植區(qū)，如果發(fā)病較早，很可能80％的水稻都會(huì)受損，即使發(fā)病時(shí)間較晚，該病也會(huì)嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量。在亞洲，白葉枯病極其常見，僅在日本平均每年水稻損失約為22000～110111噸。在菲律賓雨季，白葉枯病會(huì)對(duì)易感水稻造成22.5％的損失，即使是旱季也有7.5％的易感水稻患病，對(duì)于抗性水稻，其損失在雨季和旱季也分別有9.5％和1.8％(mathysg,faorpppd,agp,etal..europeanandmediterraneanplantproteinorganization.faoplantprotectb.1990,20(3):509-511.)。

目前，預(yù)防水稻白葉枯病的主要方法是種植抗性品種，如2011年最新研發(fā)的品種macassane，其對(duì)白葉枯病表現(xiàn)出了較高的抗性，且已經(jīng)在非洲的莫桑比亞嘗試種植(jeungju,heusg,shinms,etal..dynamicsofxanthomonasoryzaepv.oryzaepopulationsinkoreaandtheirrelationshiptoknowbacterialblightresistancegenes.phytopathlogy,2006,96(8):867-875.)。雖然抗病品種的推廣對(duì)病害的控制起到了明顯的作用，但由于病原菌的變異使抗病性喪失的現(xiàn)象仍屢屢發(fā)生。除了種植抗病品種，另一種廣泛使用的防治方法就是使用化學(xué)農(nóng)藥。然而，化學(xué)藥劑只能減緩病菌的傳播，并不能治愈患病的植物，且長期使用農(nóng)藥極易引發(fā)細(xì)菌的耐藥性，從而影響防治效果，農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的破壞也不容忽視。雖然農(nóng)藥和抗性品種可以幫助減少致病率的發(fā)生，但其產(chǎn)生的副作用以及公眾對(duì)健康的關(guān)注都鼓勵(lì)著可替代性防控藥劑的研究尤其引人注目。早在之前，噬菌體就被看做是一種植物疾病的防控藥劑，但由于噬菌體具有宿主特異性、多變的細(xì)菌敏感性、快速出現(xiàn)的細(xì)菌耐藥性，以及與紫外光之間的相互作用等影響因素。，所以并未受到重視。然而，現(xiàn)如今，在噬菌體的幫助下，減少農(nóng)藥的使用并防止細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的生物防治再次引起了人們的注意，通過噬菌體侵染并裂解病菌的方法，將有效且安全地防止疾病發(fā)生，減少經(jīng)濟(jì)損失。

早在1960年，人們已經(jīng)展開了對(duì)白葉枯病菌噬菌體的研究，基于這些噬菌體不同的形態(tài)學(xué)和血清學(xué)的性質(zhì)，日本科學(xué)家wakimoto初步將侵染白葉枯病菌的噬菌體分為op1和op2兩類(wakimotos.classificationofstrainsofxantho-monasoryzaeonthebasisoftheirsusceptibilityagainstbacteriophages.annphytopatholsocjpn.1960,25:193-198.)。1965年，goto和okabe將他們從菲律賓獲得的7中白葉枯病菌噬菌體與op噬菌體進(jìn)行了比較，并根據(jù)其血清學(xué)性質(zhì)將其分為3類，第一、二類即op1和op2，而第三類是一種新的噬菌體，其宿主范圍及血清學(xué)性質(zhì)與前兩種噬菌體均不同。隨后，xp10，xp12，xp20等不同類型的白葉枯病菌噬菌體相繼被發(fā)現(xiàn)。此外，1968年人們又發(fā)現(xiàn)了一種纖維狀白葉枯病菌噬菌體xf(kuott,huangtc,wury,etal..phagexp12ofxanthomonasoryzae(uyedaetishiyama)dowson.canjmicrobiol.1968,14(10):1139-1142.)。目前，已經(jīng)對(duì)xp10、op1和op2的dna進(jìn)行了測(cè)序分析，結(jié)果表明這些噬菌體都是雙鏈dna，其大小分別是44373、43785和46643bp(yuzenkovaj,nechaevs,berlinj,etal..genomeofxanthomonasoryzaebacteriophagexp10:anoddt-oddphage.jmolbiol.2003,330(4):735-748.；inouey,matsuurat,oharat,etal.sequenceanalysisofthegenomeofop2,alyticbacteriophageofxanthomonasoryzaepv.oryzae.jgenplantpathol,2006,72(2):104-110.)，最近，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種名為xop411的白葉枯病菌噬菌體，經(jīng)過比較，發(fā)現(xiàn)該噬菌體在組織結(jié)構(gòu)、基因組大小、噬菌體形態(tài)甚至基 因組序列上與op1、xp10都相同，但和op2完全不同(leecn,hurm,chowty,etal.comparisonofgenomesofthreexanthomonasoryzaebacteriophages.bmcgenomics,2007,8(1):442.)。在侵染白葉枯病菌的噬菌體中，大多數(shù)屬于肌尾噬菌體科、長尾噬菌體科和短尾噬菌體科。較早的關(guān)于白葉枯病菌噬菌體的研究表明，op1、op2、xp10、xp12、xp411均屬于長尾噬菌體科。而較為罕見的，屬于絲狀噬菌體科的纖維狀白葉枯病菌噬菌體xf和phixo也同樣被研究和報(bào)道(kuott,huangtc,wury,etal..phagexp12ofxanthomonasoryzae(uyedaetishiyama)dowson.canjmicrobiol.1968,14(10):1139-1142.)。雖然，利用噬菌體療法防控細(xì)菌性疾病這一思路在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已經(jīng)被用于防控細(xì)菌性血型腹水和加氏乳球菌感染等疾病，而在植物疾病中，也被用于控制青枯病菌從而治理青枯病。然而，迄今為止，對(duì)于白葉枯病噬菌體，人們都著重于研究其基本特征，以及其與宿主間的相互作用。最近，韓國科學(xué)家利用噬菌體裂解的性質(zhì)來控制水稻白葉枯病的發(fā)病率，進(jìn)行了一系列的理論研究及盆栽試驗(yàn)，結(jié)果表明，噬菌體對(duì)白葉枯病的防治具有一定的作用(chaejc,yusm,leeyh.diversityofbacteriophagesinfectingxanthomonasoryzaepv.oryzaeinpaddyfieldsanditspotentialtocontrolbacterialleafblightofrice.jmicrobiolbiotechnol.2014,24(6):740-747.)。

目前，噬菌體在水稻白葉枯病的防治上在國內(nèi)還未見報(bào)道。國際上已報(bào)道的能夠防治水稻白葉枯病的噬菌體資源匱乏，僅有韓國chaejc等人進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道，但是在種屬上與國內(nèi)常見的水稻白葉枯病致病菌的種屬不同，該報(bào)道中的噬菌體對(duì)國內(nèi)水稻白葉枯病的防治沒有指導(dǎo)意義。本發(fā)明在較大程度上彌補(bǔ)了國內(nèi)水稻白葉枯病噬菌體防治的空缺，并且在實(shí)驗(yàn)室水平上取得了較好的防治效果，為國內(nèi)水稻白葉枯病的噬菌體防治提供了堅(jiān)實(shí)可靠的理論基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種對(duì)水稻白葉枯病菌具有強(qiáng)烈裂解作用的噬菌體單體。所述的噬菌體已于2015年12月8日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：黃單胞菌噬菌體(xanthomonasoryzaepv.oryzaebacteriophage)xoo_sp15，保藏編號(hào)：cctccno：m2015727，地址，中國，武漢，武漢大學(xué)。

本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供了水稻白葉枯病菌噬菌體xoo_sp15在制備黃單胞菌生物殺菌劑的應(yīng)用。該噬菌體可以單獨(dú)或混合使用，可以特異性地部分或完全地滅活黃單胞菌，為工業(yè)化生產(chǎn)噬菌體生物殺菌劑提供噬菌體來源。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

申請(qǐng)人從自然界土壤中分離得到一種噬菌體分離物，該噬菌體分離物包括一種或多種對(duì)水稻白葉枯病菌具有裂解作用的噬菌體，經(jīng)純化后獲得了一株對(duì)水稻白葉枯病菌具有烈性裂解作用的噬菌體單體，該噬菌體對(duì)水稻白葉枯病菌均有廣譜的殺菌能力。所述的噬菌體已于2015年12月8日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：黃單胞菌噬菌體(xanthomonasoryzaepv.oryzaebacteriophage)xoo_sp15，保藏編號(hào)：cctccno：m2015727，地址，中國，武漢，武漢大學(xué)。

將噬菌體xoo_sp15加入水稻白葉枯病菌菌懸液中，于28℃，190r/min搖床過夜培養(yǎng)，將共培養(yǎng)物12000rpm離心，取上清液，用0.22μm硝酸纖維素膜過濾除菌，得到噬菌體懸液。

從電鏡觀察圖像判斷，噬菌體xoo_sp15屬于有尾噬菌體科，尾部呈注射器狀，頭部為正六面體的衣殼蛋白，其內(nèi)部包裹著的核糖核酸是噬菌體的遺傳物質(zhì)。

水稻白葉枯病菌噬菌體xoo_sp15在制備生物殺菌劑的應(yīng)用，包括以水稻白葉枯病菌噬菌體為有效成分，或以其為唯一有效成分在用于制備水稻白葉枯病菌生物殺菌劑。

本發(fā)明中的噬菌體xoo_sp15可以單獨(dú)或混合使用，可以作為殺菌劑噴灑于植物表面，可特異性、大幅度地緩解植物體中黃單胞菌的生存和繁殖，防止植物的進(jìn)一步病變。

本發(fā)明中的噬菌體xoo_sp15可以單獨(dú)或混合使用，可作為一種潛在農(nóng)藥防治由水稻白葉枯病菌引起的植物病害。

本發(fā)明中的噬菌體可以和其他噬菌體聯(lián)合使用，以獲得較寬的噬菌范圍。

本發(fā)明中噬菌體可以和其他的抗菌劑混合使用，在獲得抗菌廣譜性的同時(shí)，對(duì)水稻白葉枯病菌特異性殺滅，能與該發(fā)明中噬菌體聯(lián)合使用的抗菌劑包括但不限于抗生素和化學(xué)抗菌劑。

本發(fā)明中噬菌體可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，可由宿主菌水稻白葉枯病菌特異性擴(kuò)增，可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)病毒純化方法高度純化，作為植物抗菌劑防止植物中水稻白葉枯病菌侵染。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明中的噬菌體分離物是從自然界土壤中分離的烈性噬菌體，并利用噬菌體xoo_sp15對(duì)黃單胞菌所引起的植物病害進(jìn)行防治，且具有很好的防治效果。該噬菌體經(jīng)過高度純化有望開發(fā)成生物農(nóng)藥避免植物間黃單胞菌的傳播以及植物中黃單胞菌的生長繁殖，有效防治黃單胞菌引起的植物病害。本發(fā)明的噬菌體對(duì)溫度及ph的適用范圍廣，非常適用 于實(shí)際生產(chǎn)需要。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中純化混合噬菌體時(shí)形成的單斑。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中xoo_sp15噬菌體在10⁸pfu/ml濃度下的噬菌斑。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中xoo_sp15噬菌體電鏡圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中培養(yǎng)基中pxo99a與噬菌體共培養(yǎng)及無噬菌體時(shí)的生長狀態(tài)。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中培養(yǎng)基中pxo99a與不同溫度處理后的噬菌體共培養(yǎng)及無噬菌體時(shí)的生長狀態(tài)。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例4中培養(yǎng)基中pxo99a與不同ph處理后的噬菌體共培養(yǎng)及無噬菌體時(shí)的生長狀態(tài)。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例5中不同處理后活體水稻葉片中pxo99a菌落數(shù)(cfu)的差異。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例5中不同處理后活體水稻葉片上病斑長度(cm)的差異。

具體實(shí)施方案

實(shí)施例1：

噬菌體的篩選和純化

1.土壤樣品的采集

本發(fā)明中土壤樣品采自江蘇省無錫市，為農(nóng)田中的土壤(表1)。采用五點(diǎn)取樣法采集，即每個(gè)取樣點(diǎn)至少取5處，先將表層土鏟去1～2厘米，再取深度5～10厘米的土壤，放入袋中，置于4℃冰箱里保存。

2.土壤樣品中針對(duì)水稻白葉枯病菌的噬菌體的分離

預(yù)先擴(kuò)增好水稻白葉枯病菌pxo99a(od600：0.2～0.6)(表1)，將此10種菌懸液各取5ml于錐形瓶內(nèi)混合，稱取5g土樣于該錐形瓶內(nèi)，置于28℃,190r/min的搖床中過夜培養(yǎng)。將搖過夜的土壤懸液離心去土壤顆粒及菌體，取上清，用孔徑為0.22μm的無菌硝酸纖維素濾膜過濾除菌，得到無菌混合噬菌體懸液。

表1土壤、菌種信息

3.噬菌斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定噬菌體的有無

水稻白葉枯病菌雙層平板的制備：高溫滅菌1.5％nb固體培養(yǎng)基，室溫放置50℃，傾倒至培養(yǎng)皿內(nèi)，均勻鋪于皿底，室溫放置20min，使其凝固。將高溫滅菌的0.8％nb半固體培養(yǎng)基，室溫放置約50℃，取5ml與1ml對(duì)數(shù)期pxo99a懸液(od600：0.4～0.8)混勻，倒入上述培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫放置凝固。

取上述分離得到的噬菌體懸液的樣品3μl點(diǎn)于雙層平板上，28℃培養(yǎng)三天，觀察有無噬菌斑，有噬菌斑則證明該懸液中存在混合噬菌體樣品。

4.混合噬菌體樣品的純化

將上述混合噬菌體樣品經(jīng)過連續(xù)性的10倍稀釋，取100μl稀釋后噬菌體懸液，與900μl對(duì)數(shù)期pxo99a懸液混合侵染8min以上，再加入5ml0.8％nb半固體培養(yǎng)基，混合均勻后傾倒至備好的nb平板上，使其平鋪，室溫放置凝固，28℃溫箱培養(yǎng)3天。選取合適的平板，挑取單個(gè)噬菌斑(圖1)。將挑取出來的噬菌體單克隆，加入10ml對(duì)數(shù)期pxo99a懸液中，28℃，190r/min搖床過夜培養(yǎng)，離心、濾膜除菌后獲得第一次純化后噬菌體懸液。重復(fù)此純化步驟3次，得到噬菌體單克隆樣品，并將其命名為xoo_sp15。該噬菌體已于2015年12月8日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：黃單胞菌噬菌體(xanthomonasoryzaepv.oryzaebacteriophage)xoo_sp15，保藏編號(hào)：cctccno：m2015727，地址，中國，武漢，武漢大學(xué)。

實(shí)施例2：

高濃度噬菌體的制備及電鏡觀察

1.噬菌體的制備

將噬菌體xoo_sp15加入提前制備好的pxo99a菌懸液中(od：0.3)，于28℃，190r/min搖床過夜培養(yǎng)，將共培養(yǎng)物12000rpm離心5min，取上清液，用0.22μm硝酸纖維素膜過濾除菌，得到噬菌體懸液，待進(jìn)一步濃縮。

2.噬菌體計(jì)數(shù)方法(效價(jià))

將所得到的噬菌體樣品按10倍比例稀釋，取其中一定稀釋比例的樣品100μl，鋪雙層平板，取合適比例計(jì)算噬菌斑個(gè)數(shù)。稀釋計(jì)數(shù)如圖2。

3.噬菌體的濃縮

制備30mlxoo_sp15噬菌體懸液(10¹⁰pfu/ml)，將得到的噬菌體懸液進(jìn)行超速離心，110000g，離心2h，棄上清，用100μl1m醋酸銨溶液懸浮噬菌體，制得的樣品用于電鏡觀察。

3.噬菌體的電鏡觀察

噬菌體在顯微鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，是目前噬菌體分類的重要依據(jù)，根據(jù)其形態(tài)特點(diǎn)，可將噬菌體分為有尾噬菌體、無尾噬菌體、纖維狀噬菌體。

對(duì)xoo_sp15噬菌體采用負(fù)染電鏡觀察噬菌體粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)，該噬菌體頭部為六邊體，尾部為注射器形狀，具有可收縮的尾部，頭部與尾部之間具有頸部結(jié)構(gòu)，在尾部末端可見類似基板的膨大結(jié)構(gòu)或長尾絲。通過電鏡形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，該噬菌體屬于有尾噬菌體目的長尾噬菌體科。電鏡形態(tài)如圖3。

實(shí)施例3：

培養(yǎng)基中噬菌體對(duì)水稻白葉枯病菌生長的影響

制備xoo_sp15噬菌體懸液(10¹⁰pfu/ml)：準(zhǔn)備兩組試管，在每支試管中裝入5mlnb液體培養(yǎng)基，將備好的水稻白葉枯病菌pxo99a轉(zhuǎn)接入試管中，28℃，190r/min搖床中培養(yǎng)至一定渾濁度(od：0.6～0.8)。第一組試管中不加入任何噬菌體，第二組試管加入300μlxoo_sp15噬菌體懸液。將此兩組試管置于28℃，190r/min搖床中共培養(yǎng)12h，每間隔3h檢測(cè)一次od值，觀察不同處理后水稻白葉枯病菌pxo99a生長的差異。

結(jié)果顯示，當(dāng)無任何噬菌體添加時(shí)，pxo99a生長狀態(tài)正常，未受到任何抑制。當(dāng)添加噬菌體xoo_sp15懸液后，pxo99a生長狀態(tài)受到了一定抑制，生長較為緩慢，幾乎沒有生長，pxo99a出現(xiàn)了一定量的裂解死亡(圖4)。

此結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中，噬菌體xoo_sp15對(duì)pxo99a具有一定的抑制效果，加入噬菌體xoo_sp15的水稻白葉枯病菌pxo99a在液體培養(yǎng)基中生長12小時(shí)之后的od值比不加噬菌體低0.3，加了噬菌體12小時(shí)后的od值為0.705。

實(shí)施例4：

培養(yǎng)基中不同溫度和ph處理后噬菌體對(duì)水稻白葉枯病菌的抑制效果

1.培養(yǎng)基中不同溫度處理后的噬菌體對(duì)水稻白葉枯病菌生長的影響

制備xoo_sp15噬菌體懸液(10¹⁰pfu/ml)，,將噬菌體懸液經(jīng)過4℃、25℃、37℃、50℃、70℃處理2h后，按照實(shí)施例3的所述方法，立即加入試管中，進(jìn)行pxo99a生長狀態(tài)的檢測(cè)。

結(jié)果顯示，經(jīng)過4℃、25℃、37℃處理后的噬菌體對(duì)pxo99a生長狀態(tài)的抑制效果大致相近，均與實(shí)施例3中結(jié)果相近，說明4℃、25℃、37℃(圖5)對(duì)噬菌體效價(jià)的影響不大，未加噬菌體的pxo99a生長12h后的od值為1.013，4℃處理后噬菌體與pxo99a共培養(yǎng)12h后的od值為0.665，25℃,處理后的od值為0.731，37℃處理后的od值為0.705。

這些溫度下的噬菌體均能保持良好的生命活性并處于高效價(jià)狀態(tài)，在培養(yǎng)基中能夠?qū)xo99a的生長起到一定的抑制作用并且的抑制效果仍然最佳。而50℃(圖5)處理后，無論有無噬菌體，pxo99a的生長狀態(tài)相近，即50℃對(duì)噬菌體的活性是有較大影響的，有噬菌體的情況下培養(yǎng)12h后的od值為0.866，說明噬菌體在此溫度下對(duì)pxo99a的生長抑制都是非常微弱。經(jīng)過70℃(圖5)處理后，噬菌體基本滅活，有噬菌體的情況下培養(yǎng)12h后的od值為1.007，說明該溫度下處理的噬菌體對(duì)水稻白葉枯病菌pxo99a的生長無任何影響，即噬菌體幾乎被滅活。

2.培養(yǎng)基中不同ph處理后的噬菌體對(duì)水稻白葉枯病菌生長的影響

制備xoo_sp15噬菌體懸液(10¹⁰pfu/ml)，將噬菌體懸液經(jīng)過ph3、ph5、ph7、ph9處理2h后，按照實(shí)施例3所述方法立即加入試管中，進(jìn)行水稻白葉枯病菌pxo99a生長狀態(tài)的檢測(cè)。

結(jié)果顯示，經(jīng)過ph5、ph7、ph9處理后的噬菌體對(duì)pxo99a生長狀態(tài)的抑制效果大致相近，均與實(shí)施例3中規(guī)律相近，未加噬菌體pxo99a培養(yǎng)12h后的od值為1.089，以上ph處理后培養(yǎng)12h后的od值分別,0.771,0.765,0.725，說明ph5、ph7、ph9(圖6)對(duì)噬菌體效價(jià)的影響不大，這些ph處理后的噬菌體均能保持良好的生命活性并處于高效價(jià)狀態(tài)，在培養(yǎng)基中能夠?qū)xo99a的生長起到一定的抑制作用。而ph3(圖6)處理后，pxo99a的生長受到了一定的抑制，但這種抑制弱于前述三個(gè)ph，ph3處理后培養(yǎng)12h的od值為0.876。

實(shí)施例5：

噬菌體對(duì)xoo_sp15對(duì)活體水稻的白葉枯病的防治效果檢測(cè)

1.水稻白葉枯病菌計(jì)數(shù)方法

采用標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法。

2.噴灑噬菌體后活體水稻中水稻白葉枯病菌pxo99a的菌落數(shù)量(cfu)變化

水稻種子于水中室溫浸泡1天，37℃浸泡1天，28℃浸泡至發(fā)芽，將發(fā)芽后的種子種植于盆栽用容器中(已裝好攪拌均勻的營養(yǎng)土與普通土的混合物，按比例混合，適宜水稻生長)，每盆5株水稻便于五次cfu計(jì)數(shù)，于37℃溫室中生長一個(gè)月以上，待生長狀態(tài)良好時(shí)即可實(shí)驗(yàn)使用。

制備xoo_sp15噬菌體懸液(10¹⁰pfu/ml),作為生物農(nóng)藥用于噴灑感染了白葉枯病菌pxo99a的活體水稻，檢測(cè)活體水稻中pxo99a的菌落數(shù)量(cfu)隨時(shí)間的變化。

制備白葉枯病菌pxo99a菌懸液(od：0.8)，用于感染活體盆栽水稻，感染方法為通常所用的方法，即選取單株水稻中心位置生長狀態(tài)較好且處于垂直豎立狀態(tài)的兩片葉子，用剪刀蘸取菌 懸液后，于水稻葉片距葉片頂端1～2cm處剪斷葉片，使白葉枯病菌通過傷口處侵入水稻葉片，然后憑借葉片維管束感染至其他其他部位。。

盆栽水稻共分為三組，第一組為只感染了白葉枯病菌pxo99a的盆栽水稻，無任何液體噴灑；第二組為感染了白葉枯病菌pxo99a的盆栽水稻，從感染白葉枯病菌pxo99a當(dāng)天開始，第一天及往后每隔三天噴灑一次噬菌體懸液(為了利于噬菌體懸液附著于水稻葉片表面，添加脫脂奶粉增加附著力，脫脂奶濃度0.007g/ml)，噴灑量為10ml每盆(每盆5株水稻)；第三組為感染了白葉枯病菌pxo99a的盆栽水稻，噴灑無噬菌體的脫脂奶溶液(0.007g/ml)，噴灑量與噴灑時(shí)間和噬菌體懸液噴灑方式相同，此處理是為了排除脫脂奶的影響。每一組均有三個(gè)平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

上述三組水稻盆栽從感染白葉枯病菌當(dāng)天開始(記為第0天)于37℃溫室中培養(yǎng)、處理，持續(xù)生長12天，從第0天起，每三天對(duì)水稻葉片內(nèi)白葉枯病菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取每株水稻中間感染了白葉枯病菌的兩片葉子，剪成較小葉片后進(jìn)行后續(xù)計(jì)數(shù)處理，后續(xù)操作均在超凈工作臺(tái)中完成。將葉片于75％乙醇中消毒處理1分鐘，再用無菌水進(jìn)行三次漂洗，將漂洗后的葉片置于研缽中(加石英砂利于研磨)并加入1ml無菌水后進(jìn)行研磨，研磨完全后，取100μl研磨液做連續(xù)性的10倍稀釋，選取合適的稀釋梯度涂平板計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果即為每兩片水稻葉子中白葉枯病菌菌落數(shù)，觀察其時(shí)間梯度變化。

結(jié)果顯示，只噴灑了脫脂奶和未噴灑任何液體的水稻葉片中的白葉枯病菌菌落數(shù)在不同時(shí)間沒有明顯的差異，而噴灑了噬菌體懸液與上述水稻葉片中的白葉枯病菌菌落數(shù)在不同時(shí)間均存在顯著差異，且隨著時(shí)間的流逝菌落數(shù)漸漸拉開差距，第12天時(shí)，未作任何處理及脫脂奶處理的水稻葉片中的菌落數(shù)(cfu)接近10⁹，而噬菌體懸液處理后水稻葉片中菌落數(shù)(cfu)為10⁷(圖7)。該結(jié)果說明，噬菌體懸液對(duì)水稻白葉枯病在菌落數(shù)水平上具有顯著的防治效果，這種效果不是脫脂奶影響的結(jié)果。

3.噴灑噬菌體后活體水稻葉片上病斑長度的變化

水稻種植，混合噬菌體懸液及pxo99a的制備，盆栽水稻的處理方法均如上所述。三組水稻培養(yǎng)生長14天，分別測(cè)量不同時(shí)間病斑長度，每組五個(gè)平行。

結(jié)果顯示，只噴灑了脫脂奶和未噴灑任何液體的水稻葉片上的病斑長度隨時(shí)間變化趨勢(shì)相同。噴灑了噬菌體懸液與前兩種處理方式水稻葉片上的病斑長度變化趨勢(shì)明顯不同，脫脂奶處理和未處理的水稻葉片上第6天開始出現(xiàn)病斑，直到第14天病斑長度達(dá)到了平均20cm；而噬菌體懸液處理的水稻葉片上第9天才開始出現(xiàn)病斑，到第14天時(shí)病斑長度控制在了10cm左右(圖8)。該結(jié)果說明，噬菌體懸液的噴灑對(duì)水稻白葉枯病在病斑長度水平上具有顯著的防治效果，這種效果不是脫脂奶影響的結(jié)果。

本發(fā)明中噬菌體xoo_sp15可以單獨(dú)或混合使用，對(duì)感染水稻白葉枯病菌的水稻，每隔3天噴灑10¹⁰pfu/ml數(shù)量級(jí)的噬菌體，每2天對(duì)水稻葉片內(nèi)水稻白葉枯病菌進(jìn)行cfu計(jì)數(shù)，且在這14天內(nèi)對(duì)水稻病斑進(jìn)行長度測(cè)量，無論是cfu水平還是病斑長度水平上都表明具有顯著效果。