本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種病毒滅活劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用的主要疫苗包括弱毒疫苗和滅活疫苗。由于滅活疫苗的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、安全、使用方便、易于保存、能刺激動(dòng)物產(chǎn)生高滴度抗體和顯著的疫苗保護(hù)效果等優(yōu)點(diǎn)，因此開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)高效的滅活疫苗是防控各種病毒感染疾病的最有效手段。滅活疫苗，顧名思義就是要將具有感染性的活的病原體用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法滅活，使其喪失致病性，但仍保留其免疫原性，用其制造的疫苗。

傳統(tǒng)的病毒滅活劑甲醛，是一種有強(qiáng)烈刺激性的致癌物質(zhì)。其既可作用于病毒含氨基的核苷酸堿基，又可作用于病毒殼蛋白。甲醛作用于病毒殼蛋白時(shí)，易使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)或病毒顆粒聚集，從而使病原體蛋白的中和免疫原性遭到嚴(yán)重破壞。且用甲醛滅活時(shí)間長(zhǎng)，一般需要在37～39℃處理24h以上或更長(zhǎng)時(shí)間；殘留的游離甲醛，若隨疫苗注入機(jī)體后，會(huì)產(chǎn)生刺激性反應(yīng)。因此，在保證滅活絕對(duì)安全的前提下，提高滅活速度、縮短滅活時(shí)間，降低有效抗原的損失，一直是新型病毒滅活劑的開(kāi)發(fā)目標(biāo)。

肉桂是我國(guó)常用中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，歷代重要本草均有記載。肉桂及其所含的成分具有多方面的藥理作用，常見(jiàn)報(bào)道的包括抗菌、抗氧化、降血糖、抗醛糖還原酶、抗炎、抗補(bǔ)體、抗腫瘤活性，以及對(duì)消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。肉桂用于預(yù)防和治療病毒感染的報(bào)道極少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種病毒滅活劑；第二目的在于提供所述的病毒滅活劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的病毒滅活劑為終濃度0.5~1mg/ml的肉桂提取物。

本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的病毒滅活劑在制備滅活副黏液病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒以及流感病毒藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明公開(kāi)了一種肉桂提取物（kpc-rg1）的病毒滅活作用，經(jīng)研究表明，該種提取物在常溫下即可以與病毒外殼的包膜蛋白發(fā)生迅速、強(qiáng)力結(jié)合，從而使病毒滅活、失去感染和擴(kuò)增能力，但保有抗原性。

本發(fā)明所述的肉桂包括：肉桂、大葉清化桂、錫蘭肉桂、華南桂、鈍葉桂、陰香、天竺桂、銀葉桂、香桂、柴桂、川桂；優(yōu)選的，所述肉桂包括：肉桂、大葉清化桂和錫蘭肉桂；更優(yōu)選的，所述肉桂包括：肉桂和大葉清化桂。

所述肉桂的植物部位為樹(shù)皮。

本發(fā)明所述的滅活劑滅活病毒的方法是將待滅活的病毒液用本發(fā)明所述的病毒滅活劑進(jìn)行4~37℃的滅活。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明病毒滅活劑肉桂提取物（kpc-rg1）對(duì)vero細(xì)胞增殖的抑制作用示意圖；

圖2為hsv-1及kpc-rg1預(yù)處理的hsv-1病毒感染細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響示意圖；

圖3為kpc-rg1處理后，hsv-1病毒滴度變化示意圖；

圖4為h1n1攻毒后小鼠體重的變化情況示意圖；

圖5為小鼠血清中針對(duì)h1n1病毒的血凝抑制效價(jià)示意圖；

圖6為感染后第3天和實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（28天）各組小鼠肺部h1n1病毒m基因rna拷貝數(shù)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明所述的病毒滅活劑為終濃度0.5~1mg/ml的肉桂提取物。

所述的病毒滅活劑還包括肉桂提取物重量百分比1~5%的桂皮醛；

所述的肉桂提取物是在ph值為1~5的條件下制備得到的肉桂水提液。

所述的肉桂提取物是以肉桂為原料經(jīng)前處理、提取、后處理步驟制備得到，具體包括以下步驟：

a、前處理：將原料肉桂粉碎過(guò)篩的的物料a備用；

b、提取：物料a中加入物料a重量3~30倍的水，于溫度4~80℃下提取1~3次，每次1~24h，合并提取液得到提取液b；

c、后處理：將提取液b濃縮至相對(duì)密度為1.01~1.05得到濃縮液c，濃縮液c中加入酸性磷酸鹽緩沖液中，以鹽酸調(diào)節(jié)ph值至1~5，靜置8~24h，取沉淀部分即為所述的肉桂提取物；加入沉淀部分重量百分比1~5%的桂皮醛混合均勻即為目標(biāo)物病毒滅活劑。

所述的肉桂提取物是以肉桂為原料經(jīng)前處理、提取、后處理步驟制備得到，具體包括以下步驟：

a、前處理：將原料肉桂粉碎過(guò)篩的的物料a備用；

b、提取：物料a中加入物料a重量3~12倍的水，于溫度4~40℃下提取1~3次，每次1~8h，合并提取液得到提取液b；

c、后處理：將提取液b濃縮至相對(duì)密度為1.01~1.05得到濃縮液c，濃縮液c中加入ph值3~6的酸性磷酸鹽緩沖液中，以鹽酸調(diào)節(jié)ph值至2~4，靜置8~24h，取沉淀部分即為所述的肉桂提取物；加入沉淀部分重量百分比1~5%的桂皮醛混合均勻即為目標(biāo)物病毒滅活劑。

所述的肉桂提取物是以肉桂為原料經(jīng)前處理、提取、后處理步驟制備得到，具體包括以下步驟：

a、前處理：將原料肉桂粉碎過(guò)篩的的物料a備用；

b、提?。何锪蟖中加入物料a重量10倍的水，于溫度20℃下提取3次，每次2h，合并提取液得到提取液b；

c、后處理：將提取液b濃縮至相對(duì)密度為1.01~1.05得到濃縮液c，濃縮液c中加入ph值6的酸性磷酸鹽緩沖液中，以鹽酸調(diào)節(jié)ph值至3，靜置12h，取沉淀部分即為所述的肉桂提取物；加入沉淀部分重量百分比1~5%的桂皮醛混合均勻即為目標(biāo)物病毒滅活劑。

本發(fā)明所述的病毒滅活劑的應(yīng)用為所述的病毒滅活劑在制備滅活副黏液病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒以及流感病毒藥物中的應(yīng)用。

所述的病毒滅活劑在制備滅活副黏液病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒以及流感病毒疫苗中的應(yīng)用。

所述的滅活副黏液病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒以及流感病毒疫苗的制備方法包括以下步驟：

a、制備抗原液；

b、在抗原液中加入濃度為0.5~1mg/ml的肉桂提取物充分混勻后，將混合液放置于溫度為20~30℃的條件下震蕩孵育5~10min得到目標(biāo)物滅活疫苗；其中肉桂提取物和抗原液的配比比例為1：2.5（其中肉桂提取物以質(zhì)量單位計(jì)，病毒以血凝單位計(jì)）。

所述的制備抗原液是將病毒按體積百分?jǐn)?shù)1%~3%的接種量接種在宿主細(xì)胞中，當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到40%~90%時(shí)，將培養(yǎng)液更換為維持液，維持觀察48~72h后收集病毒得到抗原液。

所述的培養(yǎng)液是所述的培養(yǎng)液是根據(jù)病毒宿主細(xì)胞不同對(duì)應(yīng)選擇（病毒宿主細(xì)胞不同，培養(yǎng)基也不同）；所述的維持液是含2%胎牛血清的培養(yǎng)液。

下面以具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1病毒滅活劑的制備

步驟一：將肉桂樹(shù)皮粉碎，以3倍量水4℃浸泡提取1次，提取1小時(shí)。步驟二：濾過(guò)，取濾液，藥渣備用。步驟三：濾液加入乙醇至乙醇含量達(dá)65%，靜置。步驟四、離心，上清液備用并保存沉淀。步驟五：取步驟四中的上清液，減壓濃縮，真空干燥。步驟六：加水溶解，過(guò)濾。步驟七：濾液以稀鹽酸調(diào)ph值至5。步驟八：過(guò)濾，取沉淀，干燥。將步驟四和步驟八及市售桂皮醛按10:10:0.5的比例混合既得所述病毒滅活劑。

實(shí)施例2病毒滅活劑的制備

步驟一：將肉桂樹(shù)皮粉碎，以8倍量水常溫（20℃）攪拌3次，每次兩小時(shí)。步驟二：濾過(guò)，取濾液，藥渣備用。步驟三：濾液加入乙醇至乙醇含量達(dá)80%，靜置。步驟四、離心，上清液備用，保留沉淀部分。步驟五：將步驟四中的上清液，減壓濃縮，真空干燥。步驟六：加水溶解，過(guò)濾。步驟七：濾液以稀鹽酸調(diào)ph值至2。步驟八：過(guò)濾，取沉淀，干燥。將步驟四和步驟八及市售桂皮醛按10:10:0.5的比例混合既得所述病毒滅活劑。

實(shí)施例3肉桂樹(shù)皮總多糖、總多酚的制備

肉桂樹(shù)皮總多糖的制備：步驟一：將肉桂樹(shù)皮粉碎，以30倍量水80℃攪拌提取3次，每次24小時(shí)。步驟二：濾過(guò)，取濾液，藥渣備用。步驟三：濾液加入乙醇至乙醇含量達(dá)90%，靜置。步驟四、離心，上清液備用，保留沉淀部分。步驟五：將步驟四中的上清液，減壓濃縮，真空干燥。步驟六：加水溶解，過(guò)濾。步驟七：濾液以稀鹽酸調(diào)ph值至1。步驟八：過(guò)濾，取沉淀，干燥。將步驟四和步驟八及市售桂皮醛按10:10:0.5的比例混合既得所述病毒滅活劑。

實(shí)施例6

kpc-rg1對(duì)vero細(xì)胞增殖的抑制作用

vero細(xì)胞鋪板96孔板，在37℃，5%c02培養(yǎng)箱過(guò)夜長(zhǎng)滿單層后，加入不同濃度的肉桂提取物（kpc-rg1），分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、細(xì)胞對(duì)照組、空白對(duì)照組，48h后用cck8試劑盒檢測(cè)每個(gè)濃度下的od值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，當(dāng)kpc-rg1的濃度小于0.05mg/ml時(shí)，對(duì)vero細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒作用。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1。

實(shí)施例7

kpc-rg1對(duì)hsv-1病毒活性的抑制

將40ug/ml的kpc-rg1和mol=0.1的hsv-1病毒液在4度共同孵育24小時(shí)，再加入到vero細(xì)胞鋪板的96孔板中，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照(不加病毒，只加培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)后于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并計(jì)算病毒懸液的tcid50值。結(jié)果顯示，kpc-rg1對(duì)hsv-1病毒的滅活作用顯著，并對(duì)vero細(xì)胞起到了很好的保護(hù)作用。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

實(shí)施例8

kpc-rg1對(duì)rsv病毒及hiv-1病毒的體外抗病毒活性測(cè)試

樣品配制：kpc-rg1用無(wú)菌水溶至8mg/ml并于80℃水浴中加熱15分鐘溶解。溶液于2000rpm離心2分鐘后取上清儲(chǔ)存于4℃作為kpc-rg1母液。在ec50測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，kpc-rg1和參照化合物被3倍倍比稀釋測(cè)試8個(gè)濃度點(diǎn)，每個(gè)濃度測(cè)試雙復(fù)孔。最高測(cè)試濃度為1000μg/ml。細(xì)胞培養(yǎng)基中的dmso最終濃度為0.5%。并按下表的方法進(jìn)行抗病毒活性測(cè)試：

表1抗病毒實(shí)驗(yàn)方法列表

rsvalong病毒致細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞以一定密度（表1）接種到微孔板并于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，不同濃度的化合物和病毒（表1）的預(yù)混液加入細(xì)胞板中于37℃，5%co2培養(yǎng)3-5天至病毒對(duì)照孔中的細(xì)胞病變完全。細(xì)胞活性隨后使用cck8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒按照檢測(cè)試劑的說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)?；衔锊煌瑵舛认碌目共《净钚杂蓪?duì)病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)的抑制作用來(lái)決定。所有數(shù)據(jù)經(jīng)空白感染對(duì)照校準(zhǔn)。ec50由graphpadprism軟件進(jìn)行分析計(jì)算。

hiv-1病毒致細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)：測(cè)試化合物和參照化合物倍比稀釋后與病毒（表1）混合，隨后化合物和病毒的混合液與mt-4細(xì)胞加入微孔板并于33℃或37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-6天至病毒對(duì)照孔中的細(xì)胞病變完全。細(xì)胞活性隨后使用cck8或celltiterglo細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒按照檢測(cè)試劑的說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)?；衔镌诓煌瑵舛认碌目共《净钚杂蓪?duì)病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)的抑制作用來(lái)決定。ec50由graphpadprism軟件進(jìn)行分析計(jì)算。

結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)所有抗病毒活性實(shí)驗(yàn)的參照化合物的抗病毒活性與預(yù)期符合，證明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。kpc-rg1的抗病毒活性與陽(yáng)性對(duì)照藥類似，對(duì)兩種病毒均有較好活性抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2.肉桂提取物抗病毒活性列表

實(shí)施例9

驗(yàn)證kpc-rg1的抗流感病毒作用以及由于kpc-rg1誘導(dǎo)的“原位固化免疫效應(yīng)”而產(chǎn)生的動(dòng)物保護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物分組

測(cè)試樣品：kpc-rg1

實(shí)驗(yàn)病毒株：h1n1(a/puertorico/8/1934)。病毒通過(guò)狗腎細(xì)胞進(jìn)行繁殖。病毒株在-70℃儲(chǔ)存前測(cè)得其ha滴定度（hau）為256；實(shí)驗(yàn)用病毒為250hau。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：28-30天年齡的小鼠。

a)pbs對(duì)照組：6只小鼠。

b)病毒組（pr8攻毒組）：8只小鼠（250hau/只）。

c）kpc-rg1給藥組，共8只小鼠。

實(shí)驗(yàn)方法

指定劑量的kpc-rg1（100ug/只）與病毒（250hau/只）室溫下用適量的pbs預(yù)先混合培養(yǎng)5-10min。28-30天年齡的小鼠接種預(yù)先混合好的kpc-rg1/病毒溶液或者病毒溶液。kpc-rg1/病毒在pbs中的總體積為50ul/只小鼠。接種前麻醉。pbs做為空白對(duì)照。觀察小鼠28天存活水平。并于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（28天）眼球采血收集小鼠血清，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)（hi）檢測(cè)小鼠血清中針對(duì)h1n1病毒的血凝抑制效價(jià)（hititer）。血凝抑制結(jié)果≧20為陽(yáng)性有效hi效價(jià)。n=3。同時(shí)于感染后第3天和實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（28天）獲取鼠肺，提取肺總rna，rt-pcr檢測(cè)各組小鼠肺部h1n1病毒m基因rna拷貝數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小鼠28天存活情況

表3各組小鼠28天存活水平

攻毒組小鼠在攻毒后第三天出現(xiàn)死亡，攻毒后一周內(nèi)死亡過(guò)半，存活率為37.5%（8只小鼠共計(jì)死亡5只）。kpc-rg1組在攻毒后未出現(xiàn)死亡，存活率百分之百。體重和生存結(jié)果揭示藥物對(duì)小鼠有顯著保護(hù)性效果。

小鼠體重變化情況見(jiàn)圖4

對(duì)照pbs組小鼠體重穩(wěn)定增長(zhǎng)，而涉及病毒攻擊的攻毒組、kpc-rg1組小鼠體重均在攻毒后下降，一周后體重逐漸恢復(fù)并上升。

小鼠血凝抑制效價(jià)（抗體水平）見(jiàn)圖5

感染后28天，攻毒組、kpc-rg1組小鼠血清中均可檢測(cè)出128的血凝抑制效價(jià)，表明病毒對(duì)小鼠的攻擊使小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了相應(yīng)抗體和保護(hù)性。

小鼠肺部病毒載量檢測(cè)見(jiàn)圖6

攻毒后3天檢測(cè)病毒感染肺部情況，各組小鼠肺部病毒載量均達(dá)到10的7次方每50mg肺，表明病毒在小鼠肺部感染增殖情況。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)28天時(shí)，攻毒組小鼠肺部病毒載量已檢測(cè)不到，表明病毒已被小鼠免疫系統(tǒng)清除。上述結(jié)果揭示了病毒從感染再到清除的肺部感染進(jìn)程。

綜合上述結(jié)果，病毒在攻毒后對(duì)各組小鼠肺部均發(fā)生了感染，導(dǎo)致攻毒組小鼠在感染后一周內(nèi)死亡過(guò)半。而kpc-rg1組小鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，表明藥物對(duì)h1n1流感病毒攻擊小鼠有顯著保護(hù)效果。感染后28天存活下來(lái)的攻毒組和藥物組小鼠均有顯著的抗體產(chǎn)生，病毒也已被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除。