本發(fā)明涉及精氨酸和銅離子的檢測(cè)方法，具體涉及一種碳點(diǎn)作為開(kāi)關(guān)型探針利用熒光和比色雙模式連續(xù)檢測(cè)精氨酸和銅離子的方法。

背景技術(shù)：

在組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，精氨酸(Arg)受到了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。由于其在血管擴(kuò)張、免疫反應(yīng)、神經(jīng)傳輸、細(xì)胞分裂、傷口愈合等過(guò)程，扮演了重要角色。但是，精氨酸的強(qiáng)親水性以及與受體間的弱相互作用，使其在水溶液中的檢測(cè)面臨很大挑戰(zhàn)。目前，僅有少數(shù)研究報(bào)道，利用化學(xué)傳感器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。但復(fù)雜的合成過(guò)程大大限制了這些傳感器的實(shí)際應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一種制備簡(jiǎn)單，選擇性好，靈敏度高的熒光探針檢測(cè)水體中的精氨酸具有重要意義。

銅離子(Cu²⁺)作為在人體內(nèi)含量第三豐富的過(guò)渡金屬離子，在許多生物反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用。體內(nèi)銅的含量對(duì)于血液、中樞神經(jīng)和免疫系統(tǒng)，頭發(fā)、皮膚和骨骼組織以及腦、肝、心等內(nèi)臟的發(fā)育和功能有重要影響。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、靈敏、簡(jiǎn)便的分析方法檢測(cè)銅離子非常有必要。為解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員做出了很大的努力，開(kāi)發(fā)出了一些利用有機(jī)分子作為探針檢測(cè)精氨酸和銅離子的分析方法。但是，這些探針和分析方法還有許多不足，合成過(guò)程復(fù)雜、毒性高、生物相容性差、分析過(guò)程繁瑣等問(wèn)題仍然存在。

熒光分析法由于靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單快捷等檢測(cè)優(yōu)勢(shì)得到廣泛應(yīng)用。熒光碳點(diǎn)作為新興的熒光納米材料在生化傳感、生物成像、環(huán)境分析等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力。因此，本發(fā)明基于碳點(diǎn)優(yōu)越的熒光性質(zhì)和生物性能，將熒光分析和比色分析與納米材料結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種熒光和比色雙模式連續(xù)檢測(cè)精氨酸和銅離子的分析方法。與單純的熒光變化相比，雙輸出模式檢測(cè)方法在實(shí)際應(yīng)用中更具有突出的有勢(shì)，預(yù)示著其在實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)際樣品中的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、簡(jiǎn)單、高選擇性的基于碳點(diǎn)開(kāi)關(guān)型探針的熒光和比色雙模式連續(xù)檢測(cè)精氨酸(Arg)和銅離子(Cu²⁺)的方法。

本發(fā)明檢測(cè)原理是：利用碳點(diǎn)熒光淬滅(關(guān))和恢復(fù)(開(kāi))及顏色變化的性質(zhì)，將其應(yīng)用在精氨酸和銅離子的連續(xù)檢測(cè)中，開(kāi)發(fā)一種雙輸出模式的分析檢測(cè)方法。當(dāng)Arg存在時(shí)，CDs的熒光被Arg有效淬滅。同時(shí)，CDs溶液顏色由淺黃色變?yōu)闇\粉色。當(dāng)體系中加入Cu²⁺時(shí)，熒光強(qiáng)度可以恢復(fù)，并且溶液顏色由淺粉色恢復(fù)成淺黃色。

一種碳點(diǎn)，通過(guò)包括以下步驟的方法制得：

1)、將殼聚糖、10％的冰醋酸和乙二胺置于微波反應(yīng)器中，充分?jǐn)嚢?，殼聚糖?0％的冰醋酸和乙二胺的質(zhì)量比為：0.5-1.5∶5.25-15.75∶2.25-6.75；

2)、將裝有反應(yīng)物的微波反應(yīng)器置于微波爐中，高火狀態(tài)下反應(yīng)4-16min，得到棕色固體；

3)、取出微波反應(yīng)器，自然冷卻，加入20-50mL的二次水，攪拌溶解，過(guò)濾去除不溶物得到澄清淺黃色的溶液，利用500-1000Da的透析袋，在玻璃容器中透析處理至少3天，即得到純凈的碳點(diǎn)的水溶液；

4)、將上述碳點(diǎn)水溶液冷凍干燥后得到碳點(diǎn)固體。

所述碳點(diǎn)表現(xiàn)出良好的選擇性，在碳點(diǎn)溶液中，只有加入精氨酸，使得溶液顏色由淺黃色變?yōu)闇\粉色，碳點(diǎn)的熒光淬滅，而加入丙氨酸、組氨酸、谷氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、天氨酸、酪氨酸、半光氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸，溶液顏色無(wú)明顯變化，并且碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化。在碳點(diǎn)/精氨酸混合體系中，只有繼續(xù)加入Cu²⁺，使得溶液顏色由淺粉色變?yōu)闇\黃色，碳點(diǎn)的熒光恢復(fù)，而加入其他金屬離子，溶液顏色無(wú)明顯變化，并且碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化。

本發(fā)明提供的一種熒光和比色雙模式連續(xù)檢測(cè)精氨酸和銅離子的方法，步驟為：

1)、配置濃度0.1mg/mL的如上所述碳點(diǎn)溶液；

2)、配置一系列濃度的精氨酸和銅離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液；

3)、向碳點(diǎn)溶液中加入精氨酸，使碳點(diǎn)的熒光逐漸淬滅，得到碳點(diǎn)/精氨酸溶液，溶液顏色由淺黃色變?yōu)闇\粉色；

4)、繼續(xù)向步驟3)中熒光淬滅的溶液中加入銅離子，使碳點(diǎn)熒光恢復(fù)，溶液顏色由淺粉色恢復(fù)到淺黃色；

5)、測(cè)定碳點(diǎn)/精氨酸反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度，根據(jù)精氨酸的濃度和相對(duì)熒光強(qiáng)度變化值之間的關(guān)系建立檢測(cè)精氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

6)、測(cè)定碳點(diǎn)/精氨酸和銅離子反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度，根據(jù)銅離子的濃度和相對(duì)熒光強(qiáng)度變化值之間的關(guān)系建立檢測(cè)銅離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

7)、定量檢測(cè)：測(cè)定待測(cè)樣品和碳點(diǎn)或碳點(diǎn)/精氨酸反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化，計(jì)算反應(yīng)前后相對(duì)熒光強(qiáng)度變化值，參照步驟5)或6)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到待測(cè)樣品中精氨酸或銅離子的溶度。

本發(fā)明提供的一種熒光和比色雙模式檢測(cè)精氨酸的方法，步驟為：

1)、配置濃度0.1mg/mL的如上所述碳點(diǎn)溶液；

2)、配置一系列濃度的精氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液；

3)、向碳點(diǎn)溶液中加入精氨酸，使碳點(diǎn)的熒光逐漸淬滅，得到碳點(diǎn)/精氨酸溶液，溶液顏色由淺黃色變?yōu)闇\粉色；

4)、測(cè)定碳點(diǎn)/精氨酸反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度，根據(jù)精氨酸的濃度和相對(duì)熒光強(qiáng)度變化值之間的關(guān)系建立檢測(cè)精氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

5)、定量檢測(cè)：測(cè)定待測(cè)樣品和碳點(diǎn)反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化，計(jì)算反應(yīng)前后相對(duì)熒光強(qiáng)度變化值，參照步驟4)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到待測(cè)樣品中精氨酸或銅離子的溶度。

上述熒光碳點(diǎn)和分析方法可在細(xì)胞熒光成像中應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下有益技術(shù)效果：

(1)本發(fā)明所述的基于碳點(diǎn)的開(kāi)關(guān)型熒光探針與傳統(tǒng)有機(jī)探針相比，制備步驟簡(jiǎn)單，無(wú)需后續(xù)添加強(qiáng)酸強(qiáng)堿或表面鈍化劑進(jìn)行處理，反應(yīng)物在同一體系中進(jìn)行碳化、聚合及表面修飾，即可得到目標(biāo)碳點(diǎn)。

(2)本發(fā)明碳點(diǎn)原材料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉。生產(chǎn)設(shè)備僅需微波爐，操作簡(jiǎn)易，能在十幾分鐘內(nèi)快速完成反應(yīng)，節(jié)能省時(shí)。

(3)本發(fā)明的碳點(diǎn)在水溶液中都具有良好的溶解度和分散性，并且是粒徑小于10nm的納米顆粒，生物相容性好、毒性小，可應(yīng)用于生物成像，在生物體內(nèi)表現(xiàn)出有良好的應(yīng)用潛能。

(4)本發(fā)明利用熒光分析和比色分析相給合的方法，與單一的檢測(cè)方式相比，雙輸出檢測(cè)模式在實(shí)際樣品的檢測(cè)中更具有優(yōu)越性，提高了分析方法的選擇性和靈敏度，對(duì)待測(cè)物可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定性、定量分析。

(5)本發(fā)明提供的基于碳點(diǎn)開(kāi)關(guān)型探針的熒光和比色雙模式連續(xù)檢測(cè)精氨酸(Arg)和銅離子(Cu²⁺)的分析方法，具有高效、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)；同時(shí)也拓展了碳點(diǎn)的應(yīng)用范圍。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1制備的碳點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜及紫外吸收光譜；

圖2為碳點(diǎn)檢測(cè)精氨酸的熒光發(fā)射光譜圖；

圖3為碳點(diǎn)檢測(cè)精氨酸的紫外吸收光譜；

圖4為碳點(diǎn)/精氨酸檢測(cè)銅離子的熒光發(fā)射光譜；

圖5為碳點(diǎn)、碳點(diǎn)/精氨酸和碳點(diǎn)/精氨酸/銅離子溶液體系在日光燈和紫外燈下的照片；

圖6為本發(fā)明提供的分析方法在人肝癌HepG2細(xì)胞激光共聚焦中的應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，實(shí)施例給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

制備碳點(diǎn)的方法：

步驟1，稱(chēng)量0.8g殼聚糖于微波反應(yīng)器中，加入8mL 10％的冰醋酸，充分?jǐn)嚢瑁S后加入4mL乙二胺，再次充分?jǐn)嚢?，得到粘稠狀反?yīng)物；

步驟2，將微波反應(yīng)器置于微波爐(700瓦)高火狀態(tài)下反應(yīng)8min，得到棕色固體；

步驟3，取出微波反應(yīng)器，自然冷卻，向其中加入30mL二次水，攪拌溶解得到棕色溶液，過(guò)濾去除不溶物得到澄清的淺黃色溶液，通過(guò)500-1000Da的透析袋，在玻璃容器中透析處理至少3天去除雜質(zhì)，即得到純凈的碳點(diǎn)的水溶液；

步驟4，將上述碳點(diǎn)水溶液冷凍干燥后得到碳點(diǎn)固體，配制成0.1mg/mL的碳點(diǎn)溶液。

實(shí)施例2

取實(shí)施例1制備的熒光碳點(diǎn)水溶液(0.1mg/mL)1.8mL置于熒光比色皿中，分別加入0.2mL不同濃度(從低到高)的Arg溶液，混合均勻，在熒光光度計(jì)中掃描發(fā)射光譜(λ_ex＝365nm，λ_em＝454nm)，根據(jù)精氨酸的濃度和相對(duì)熒光強(qiáng)度變化值之間的關(guān)系，計(jì)算碳點(diǎn)對(duì)精氨酸的檢測(cè)范圍及檢出限。(見(jiàn)圖2)

實(shí)施例3

配置碳點(diǎn)/精氨酸的溶液1.8mL置于熒光比色皿中，分別加入0.2mL不同濃度(從低到高)的Cu²⁺溶液，混合均勻，在熒光光度計(jì)中掃描發(fā)射光譜(λ_ex＝365nm，λ_em＝454nm)，根據(jù)銅離子的濃度和相對(duì)熒光強(qiáng)度變化值之間的關(guān)系，計(jì)算碳點(diǎn)/精氨酸對(duì)Cu²⁺的檢測(cè)范圍及檢出限。(見(jiàn)圖4)

實(shí)施例4

如圖5，第一排：將實(shí)施例1制備的熒光碳點(diǎn)水溶液置于比色皿中，在日光燈下為淺黃色(左)，加入Arg后變?yōu)闇\粉色(中)，再加入Cu²⁺后，逐漸恢復(fù)成淺黃色(右)；第二排：為第一排溶液在365nm紫外燈下的圖片，碳點(diǎn)溶液為藍(lán)色熒光(左)，加入Arg熒光淬滅(中)，再加入Cu²⁺藍(lán)色熒光逐漸恢復(fù)(右)。

實(shí)施例5

實(shí)施例1制備的熒光碳點(diǎn)水溶液(0.1mg/mL)用于標(biāo)記的人子宮頸癌HepG2細(xì)胞，如圖6a所示，細(xì)胞形態(tài)良好，可見(jiàn)碳點(diǎn)幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性，可用于活細(xì)胞標(biāo)記。圖6從左到右依次為：(a)暗場(chǎng)(激發(fā)為405nm)碳點(diǎn)標(biāo)記的細(xì)胞圖(藍(lán)色熒光)；(b)暗場(chǎng)(激發(fā)為405nm)，在a中加入精氨酸后的細(xì)胞圖(藍(lán)色熒光猝滅)；(c)暗場(chǎng)(激發(fā)為405nm)，在b中加入銅離子后的細(xì)胞圖(藍(lán)色熒光恢復(fù))。