本發(fā)明屬于生物傳感器
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種基于二維二氧化錳納米片--熒光探針構(gòu)建的熒光傳感平臺的方法及其應(yīng)用，可以實現(xiàn)對堿性磷酸酶活性的靈敏檢測。
背景技術(shù)：
：堿性磷酸酶(ALP)是一種磷酸單酯酶，促進各種磷酸化底物的去磷酸化過程。已經(jīng)證明堿性磷酸酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞內(nèi)過程中起著至關(guān)重要的作用，因此常常作為各種疾病的診斷指標(biāo)，包括乳腺癌和前列腺癌、骨病、肝功能異常、糖尿病。此外，堿性磷酸酶在環(huán)境和食品質(zhì)量監(jiān)測中也發(fā)揮著重要的作用。因此，設(shè)計一種簡單，靈敏檢測堿性磷酸酶活性的方法極其重要。目前基于堿性磷酸酶對不同底物的去磷酸化作用檢測其活性的方法多涉及復(fù)雜和耗時冗長的檢測過程。熒光光譜法由于其優(yōu)越的靈敏度，操作簡單，良好的重現(xiàn)性和低成本，受到廣泛的關(guān)注。然而，大多數(shù)采用信號循環(huán)放大來提高靈敏度，忽視了降低背景信號，限制了檢測靈敏度和檢測范圍。因此，采用降低背景信號快速靈敏檢測堿性磷酸酶活性非常值得期待。近年來，二維二氧化錳納米片由于其獨特的物理和化學(xué)性質(zhì)引起了研究人員的關(guān)注。二氧化錳納米片作為氧化還原活性的過渡金屬氧化物具有良好的水溶性和優(yōu)良的生物相容性，由于其具有高的比表面積和良好的物理吸附能力以及熒光猝滅能力在生物傳感器中具有廣泛應(yīng)用。因此，利用二維二氧化錳納米降低背景信號，開發(fā)簡單、高靈敏性、高選擇性的熒光生物傳感器檢測堿性磷酸酶活性至關(guān)重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明公開了一種基于二維二氧化錳納米片為熒光傳感平臺，使用嗎啉乙磺酸還原高錳酸鉀一步合成二氧化錳納米片，二氧化錳納米片吸附FAM-ssDNA，猝滅FAM熒光。在堿性磷酸酶的作用下，將維生素C磷酸酯鎂水解生成抗壞血酸，二維二氧化錳納米片被抗壞血酸還原成錳離子，釋放出FAM-ssDNA并恢復(fù)熒光，構(gòu)建了由二氧化錳納米片和堿性磷酸酶調(diào)節(jié)熒光強度的熒光傳感器。本發(fā)明還提供了一種熒光生物傳感器的應(yīng)用，利用制備的熒光生物傳感器，不同濃度的堿性磷酸酶熒光強度不同，構(gòu)建線性關(guān)系，實現(xiàn)了對堿性磷酸酶靈敏性、特異性的檢測。具體技術(shù)方案如下：一種熒光生物傳感器的制備方法，包括如下步驟：(1)合成單層二維二氧化錳納米片；(2)將FAM-DNA序列和堿性磷酸酶溶解在Tris–HCl緩沖溶液中，得到FAM-DNA緩沖溶液和堿性磷酸酶溶液；(3)取FAM-DNA溶液，加入不同濃度的二氧化錳納米片，搖動混合均勻，得到第一狀態(tài)的熒光生物傳感器；(4)在步驟(3)中得到的混合液中，加入一定量的維生素C磷酸酯鎂和堿性磷酸酶，反應(yīng)得到第二狀態(tài)的熒光生物傳感器。進一步地，步驟(1)中，取5ml高錳酸鉀與12ml嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將混合液超聲30分鐘；步驟(4)中，在37℃的恒溫箱中反應(yīng)30min。進一步地，步驟(3)中，第一狀態(tài)的熒光生物傳感器為“關(guān)閉”的熒光生物傳感器，步驟(4)中，第二狀態(tài)的熒光生物傳感器為“開”的熒光生物傳感器。步驟(1)包括如下步驟：(1-1)高錳酸鉀濃度為10mM，嗎啉乙磺酸緩沖溶液為0.1M，pH＝6.0，取5ml高錳酸鉀與12ml嗎啉乙磺酸緩沖溶液中；(1-2)將混合液超聲30分鐘，形成棕褐色溶液；(1-3)將超聲后的混合液先7000rpm離心15分鐘；(1-4)用去離子水和乙醇洗滌沉淀，去除殘余反應(yīng)物；(1-5)將沉淀在60℃干燥；(1-6)將沉淀超聲分散在50ml去離子水中，在4℃下保存?zhèn)溆?。進一步地，步驟(2)包括如下步驟：(2-1)將10μL100μMFAM-DNA緩沖溶液加入1990μLTris–HCl緩沖溶液得到500nM溶液，4℃下保存?zhèn)溆茫?2-2)將堿性磷酸酶用0.01M，pH值為8.12且含有5mM氯化鎂和0.1mM氯化鋅的Tris-HCl緩沖溶液稀釋得到2500U/ml，-4℃下保存?zhèn)溆?。進一步地，步驟(3)中，取40μL步驟(2)中FAM-DNA溶液，加入40μL二氧化錳納米片，搖動混合均勻，室溫下放置5min，使FAM-DNA吸附在二氧化錳納米片上，F(xiàn)AM的熒光被猝滅。進一步地，步驟(4)中，加入40μL維生素C磷酸酯鎂和不同體積的堿性磷酸酶，在37℃的恒溫箱中反應(yīng)30min，使維生素C磷酸酯鎂與堿性磷酸酶充分反應(yīng)生成抗壞血酸，還原二氧化錳納米片，釋放出FAM-DNA，恢復(fù)熒光。進一步地，步驟(2)中稀釋FAN-DNA的緩沖溶液Tris-HCl的pH為8.5，濃度為0.1M；步驟(3)中，F(xiàn)AM-DNA溶液加入二氧化錳納米片反應(yīng)不同時間，反應(yīng)5minFAM熒光能達(dá)到最大程度的猝滅；和/或，步驟(3)中，F(xiàn)AM-DNA最終濃度為100nM，二氧化錳納米片濃度為0.2mg/mL；步驟(3)中的混合液，用熒光儀檢測熒光強度；步驟(4)中，F(xiàn)AM-DNA最終濃度為100nM，二氧化錳納米片濃度為0.2mg/Ml，維生素C磷酸酯鎂的最終濃度為0.02M，和堿性磷酸酶的最終濃度分別為5.0U/L，10.0U/L，20.0U/L，30.0U/L，50.0U/L，100.0U/L，150.0U/L，200.0U/L，300.0U/L，400.0U/L，500.0U/L；和/或，步驟(4)中，堿性磷酸酶用0.01M，pH值為8.12含有5mM氯化鎂和0.1mM氯化鋅的Tris-HCl緩沖溶液稀釋；步驟(4)中，混合液用熒光儀檢測熒光強度，構(gòu)建線性關(guān)系，實現(xiàn)對堿性磷酸酶活性的檢測。一種熒光生物傳感器，采用上述制備方法制得的基于二維二氧化錳納米片--熒光探針構(gòu)建的熒光傳感平臺。上述熒光生物傳感器的用途，用于對不同濃度的堿性磷酸酶活性檢測。與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本生物傳感器的制備方法，使用的二氧化錳納米片合成簡單，耗能低，成本低，生物相容性好，首先利用二氧化錳納米片猝滅FAM-DNA的熒光，從而降低背景信號；然后利用維生素C磷酸酯鎂與堿性磷酸酶反應(yīng)生成抗壞血酸還原二氧化錳，得到自由的FAM-DNA并恢復(fù)熒光，最后利用FAM-DNA熒光恢復(fù)的強度構(gòu)建與堿性磷酸酶濃度的線性關(guān)系，實現(xiàn)對堿性磷酸酶活性的檢測。因此對堿性磷酸酶活性的檢測具有低背景，靈敏度高、檢測限低、選擇性好的特點。附圖說明圖1為基于二維二氧化錳納米片--熒光探針構(gòu)建的熒光傳感平臺檢測堿性磷酸酶活性的示意圖；圖2A為二氧化錳納米片的掃描電子顯微鏡表征圖；圖2B為二氧化錳納米片的透射電子顯微鏡表征圖；圖3A為FAM-DNA的熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜圖；a為FAM-DNA的熒光激發(fā)光譜；b為FAM-DNA熒光發(fā)射光譜；圖3B為不同濃度的二氧化錳納米片對FAM-DNA熒光強度影響的熒光光譜圖；a為10OnMFAM-DNA；b為0.02mg/mlMnO2，c為0.04mg/mlMnO2，d0.08mg/mlMnO2，e0.12mg/mlMnO2，f0.16mg/mlMnO2，g0.20mg/mlMnO2，h0.3mg/mlMnO2，i0.4mg/mlMnO2，j0.5mg/mlMnO2；圖3C為二氧化錳納米片濃度與熒光強度變化的曲線圖；圖3D為二氧化錳納米片濃度與熒光強度的線性關(guān)系圖；圖3E為該方法可行性的熒光光譜圖；a為10OnMFAM-DNA；b為在a溶液中含有0.2mg/mlMnO2；c為在b溶液中含有0.2mg/ml的維生素C磷酸酯鎂和500U/L的堿性磷酸酶；圖4A為堿性磷酸酶培養(yǎng)時間的優(yōu)化圖；圖4B為實驗溫度的優(yōu)化圖；圖4C為pH值對本實驗的優(yōu)化圖。圖4D為維生素C磷酸酯鎂濃度的優(yōu)化圖圖5A基于二維二氧化錳納米片--熒光探針構(gòu)建的熒光傳感平臺對不同濃度檢測堿性磷酸酶活性的熒光光譜圖；a5.0U/L，b10.0U/L，c20.0U/L，d30.0U/L，e50.0U/L，f100.0U/L，g150.0U/L，h200.0U/L，i300.0U/L，j400.0U/L，k500.0U/L圖5B為堿性磷酸酶的濃度與熒光強度變化的曲線圖；圖5C為堿性磷酸酶的濃度與熒光強度的線性關(guān)系圖圖6為此方法的選擇性圖，分別用堿性磷酸酶、三磷酸腺苷、抗生物素蛋白、溶菌酶、凝血酶和血紅蛋白。具體實施方式下面根據(jù)附圖對本發(fā)明進行詳細(xì)描述，其為本發(fā)明多種實施方式中的一種優(yōu)選實施例。在一個優(yōu)選實施例中，一種基于二維二氧化錳納米片--熒光探針構(gòu)建的熒光傳感平臺的方法及其應(yīng)用，所述方法包括以下步驟：(1)、一步法超聲波合成單層二維二氧化錳納米片，取5ml高錳酸鉀與12ml嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將混合液超聲30分鐘。(2)、將購買的2.5ODFAM-DNA序列和堿性磷酸酶溶解在Tris–HCl緩沖溶液中，得到FAM-DNA緩沖溶液和堿性磷酸酶溶液；(3)、取一定量的(2)中FAM-DNA溶液，加入不同濃度的二氧化錳納米片，搖動混合均勻，得到“關(guān)閉”的熒光生物傳感器。(4)、在步驟(3)中得到的混合液中，加入一定量的維生素C磷酸酯鎂和堿性磷酸酶，在37℃的恒溫箱中反應(yīng)30min，得到“開”的熒光生物傳感器。步驟(1)為：高錳酸鉀濃度為10mM，嗎啉乙磺酸緩沖溶液為0.1M，pH＝6.0，取5ml高錳酸鉀與12ml嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將混合液超聲30分鐘，形成棕褐色溶液，將超聲后的混合液先7000rpm離心15分鐘后，用去離子水和乙醇洗滌沉淀，去除殘余反應(yīng)物，再將沉淀在60℃干燥，最后，將沉淀超聲分散在50ml去離子水中，在4℃下保存?zhèn)溆茫徊襟E(2)為將10μL100μMFAM-DNA緩沖溶液加入1990μLTris–HCl緩沖溶液得到500nM溶液，4℃下保存?zhèn)溆?；將夠買的堿性磷酸酶用0.01M，pH值為8.12且含有5mM氯化鎂和0.1mM氯化鋅的Tris-HCl緩沖溶液稀釋得到2500U/ml，-4℃下保存?zhèn)溆?；步驟(3)為取40μL步驟(2)中FAM-DNA溶液，加入40μL二氧化錳納米片，搖動混合均勻，室溫下放置5min，使FAM-DNA吸附在二氧化錳納米片上，F(xiàn)AM的熒光被猝滅；步驟(4)為加入40μL維生素C磷酸酯鎂和不同體積的堿性磷酸酶，在37℃的恒溫箱中反應(yīng)30min，使維生素C磷酸酯鎂與堿性磷酸酶充分反應(yīng)生成抗壞血酸，還原二氧化錳納米片，釋放出FAM-DNA，恢復(fù)熒光；上述的熒光生物傳感器的應(yīng)用，應(yīng)用方法具體為：利用制備的熒光生物傳感器，加入不同濃度的堿性磷酸酶熒光恢復(fù)強度不同，構(gòu)建線性關(guān)系，實現(xiàn)了基于二維氧化錳納米片--熒光探針構(gòu)建的熒光傳感平臺對堿性磷酸酶靈敏性、特異性的檢測。在另一個優(yōu)選實施例中，可以采用如下方案：一種基于二維二氧化錳納米片構(gòu)建的熒光傳感器包括以下步驟：(1)、一步法超聲合成單層二維二氧化錳納米片，取5ml高錳酸鉀與12ml嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將混合液超聲30分鐘。(2)、將購買的2.5ODFAM-DNA序列和堿性磷酸酶溶解在Tris–HCl緩沖溶液中，得到FAM-DNA緩沖溶液和堿性磷酸酶溶液；(3)、取一定量的(2)中FAM-DNA溶液，加入不同濃度的二氧化錳納米片，搖動混合均勻，得到“關(guān)閉”的熒光生物傳感器。(4)、在步驟(3)中得到的混合液中，加入一定量的維生素C磷酸酯鎂和堿性磷酸酶，在37℃的恒溫箱中反應(yīng)30min，得到“開”的熒光生物傳感器。具體的，步驟(1)二氧化錳納米片的制備：取5ml高錳酸鉀與12ml嗎啉乙磺酸緩沖溶液，將混合液超聲30分鐘，形成棕褐色溶液，將超聲后的混合液先7000rpm離心15分鐘后，用去離子水和乙醇洗滌沉淀，去除殘余反應(yīng)物，再將沉淀在60℃干燥，最后，將沉淀超聲分散在50ml去離子水中。進一步的，步驟(1)中高錳酸鉀濃度為10mM，嗎啉乙磺酸緩沖溶液為0.1M，pH值為6.0。進一步的，步驟(1)中二氧化錳納米片分散液的濃度為1mg/ml，在4℃下保存?zhèn)溆茫痪唧w的，步驟(2)為：將10μL100μMFAM-DNA緩沖溶液加入1990μLTris–HCl緩沖溶液得到500nM溶液，-4℃下保存?zhèn)溆?；將夠買的堿性磷酸酶用0.01M，pH值為8.12且含有5mM氯化鎂和0.1mM氯化鋅的Tris-HCl緩沖溶液稀釋得到2500U/ml，-4℃下保存?zhèn)溆?；進一步的，步驟(2)中稀釋FAN-DNA的緩沖溶液Tris-HCl的pH為8.5，濃度為0.1M。具體的，步驟(3)為：取40μL步驟(2)中FAM-DNA溶液，加入40μL二氧化錳納米片，搖動混合均勻，室溫下放置5min，使FAM-DNA吸附在二氧化錳納米片上，F(xiàn)AM的熒光被猝滅，得到“關(guān)閉”的熒光生物傳感器。進一步的，步驟(3)中FAM-DNA溶液加入二氧化錳納米片反應(yīng)不同時間，反應(yīng)5minFAM熒光能達(dá)到最大程度的猝滅。進一步的，步驟(3)中FAM-DNA最終濃度為100nM，二氧化錳納米片濃度為0.2mg/mL；進一步的，步驟(3)中的混合液，用熒光儀檢測熒光強度。具體的，步驟(4)為：在步驟(3)中得到的混合液中，加入40μL維生素C磷酸酯鎂和不同體積的堿性磷酸酶，在37℃的恒溫箱中反應(yīng)30min，使維生素C磷酸酯鎂與堿性磷酸酶充分反應(yīng)生成抗壞血酸，還原二氧化錳納米片，釋放出FAM-DNA，恢復(fù)熒光，得到“開”的熒光生物傳感器。進一步的，步驟(4)中FAM-DNA最終濃度為100nM，二氧化錳納米片濃度為0.2mg/Ml，維生素C磷酸酯鎂的最終濃度為0.02M，和堿性磷酸酶的最終濃度分別為5.0U/L，10.0U/L，20.0U/L，30.0U/L，50.0U/L，100.0U/L，150.0U/L，200.0U/L，300.0U/L，400.0U/L，500.0U/L；進一步的，步驟(4)中堿性磷酸酶用0.01M，pH值為8.12含有5mM氯化鎂和0.1mM氯化鋅的Tris-HCl緩沖溶液稀釋；進一步的，步驟(4)中的混合液，用熒光儀檢測熒光強度，構(gòu)建線性關(guān)系，實現(xiàn)對堿性磷酸酶活性的檢測。由于二氧化錳納米片可以吸附FAM-DNA，猝滅其熒光信號，因此降低背景信號，而維生素C磷酸酯鎂與堿性磷酸酶反應(yīng)生成抗壞血酸使二氧化錳納米片還原成錳離子，釋放出FAM-DNA并恢復(fù)熒光信號，而FAM-DNA的熒光信號強度與抗壞血酸的濃度相關(guān)，也就與堿性磷酸酶的濃度有關(guān)。隨著堿性磷酸酶濃度的增加，F(xiàn)AM-DNA的熒光信號強度會隨之增加，因此，此熒光傳感器可對不同濃度的堿性磷酸酶活性檢測。優(yōu)選實施例1一種基于二維二氧化錳納米片--熒光探針構(gòu)建的熒光傳感平臺的方法，包括以下步驟：(1)、配置10mM的高錳酸鉀溶液和0.1M，pH＝6.0的嗎啉乙磺酸緩沖溶液，用于合成二氧化錳納米片。(2)、將購買的FAM-DNA序列(FAM-DNA:FAM-AAAAAAAAAAAAAAA)溶解在0.1MTris-HCl(pH7.4)緩沖溶液中，并在4℃下保存?zhèn)溆?；將購買的堿性磷酸酶溶解在0.01MpH＝8.12且含有5mM氯化鎂和0.1mM氯化鋅的Tris-HCl緩沖溶液中，并在-4℃下保存?zhèn)溆谩?3)、將5ml高錳酸鉀溶液加入到12ml嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將混合液超聲30分鐘形成棕褐色溶液，然后將超聲后的混合液7000rpm離心15分鐘，用去離子水和乙醇洗滌沉淀，去除殘余反應(yīng)物，再將沉淀在60℃干燥，最后，將沉淀超聲分散在50ml去離子水中。(4)、取一定量步驟(3)得到的二氧化錳納米片溶液，加入40ulFAM-DNA溶液，混合均勻，在37℃放置5min，使FAM-DNA熒光衰減，得到“關(guān)閉”的熒光生物傳感器；(5)、重復(fù)步驟(4)后，再加入40μL維生素C磷酸酯鎂和不同體積的堿性磷酸酶，在37℃的恒溫箱中反應(yīng)30min，使維生素C磷酸酯鎂與堿性磷酸酶充分反應(yīng)生成抗壞血酸，還原二氧化錳納米片，釋放出FAM-DNA，恢復(fù)熒光，得到“開”的熒光生物傳感器；一種基于二維二氧化錳納米片--熒光探針構(gòu)建的熒光傳感平臺的方法及應(yīng)用，具體方法為：a、將5ml高錳酸鉀溶液加入到12ml嗎啉乙磺酸緩沖溶液中，將混合液超聲30分鐘形成棕褐色溶液，然后將超聲后的混合液7000rpm離心15分鐘，用去離子水和乙醇洗滌沉淀，去除殘余反應(yīng)物，再將沉淀在60℃干燥，最后，將沉淀超聲分散在50ml去離子水中；實驗中，二氧化錳納米片通過掃描電子顯微鏡(圖2A)和透射電子顯微鏡(圖2B)表征，證明合成的二氧化錳納米片是理想的；b、在含有100nM的FAM-DNA溶液中分別加入不同濃度的二氧化錳納米片，濃度分別為0.0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16，0.20，0.30，0.40，and0.50mg/ml，混合均勻，在37℃放置5min，使FAM-DNA熒光衰減，分別測檢測熒光強度。實驗在含有0.02～0.5mg/mL的二氧化錳時都可以進行，但是從0.20mg/ml時信號衰減緩慢，所以選擇0.20mg/mlL二氧化錳納米片作為實驗最優(yōu)條件。c、在100nM的FAM-DNA溶液中，加入0.20mg/ml二氧化錳納米片，混合均勻，反應(yīng)5min后，再加入40μL維生素C磷酸酯鎂和30μL的堿性磷酸酶，混合均勻，在37℃放置30min，二氧化錳納米片被還原成錳離子，F(xiàn)AM-DNA成游離態(tài)，恢復(fù)熒光。證明該實驗具有可行性。優(yōu)選實施例2一種基于二維二氧化錳納米片--熒光探針構(gòu)建的熒光傳感平臺的方法，包括以下步驟：在含有0.2mg/ml的二氧化錳納米片溶液中加入40ulFAM-DNA溶液，混合均勻，在37℃放置5min，使FAM-DNA熒光衰減，再加入維生素C磷酸酯鎂和堿性磷酸酶，在37℃的恒溫箱中反應(yīng)30min，使維生素C磷酸酯鎂與堿性磷酸酶充分反應(yīng)生成抗壞血酸，還原二氧化錳納米片，釋放出FAM-DNA，恢復(fù)熒光，得到“開”的熒光生物傳感器。一種基于二維二氧化錳納米片--熒光探針構(gòu)建的熒光傳感平臺的方法及應(yīng)用，具體方法為：a、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化錳納米片溶液中分別加入40ulFAM-DNA溶液，混合均勻，在37℃放置5min，使FAM-DNA熒光衰減，再分別加入維生素C磷酸酯鎂和堿性磷酸酶，在37℃的恒溫箱中分別反應(yīng)5、10、15、20、25、30、35min，檢測FAM-DNA的熒光強度。實驗體系的熒光信號強度隨著反應(yīng)時間的增加而增加，但經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)的比較，如圖4A，實驗反應(yīng)時間超過30min后熒光信號增加不明顯，所以選擇實驗反應(yīng)時間30min為最優(yōu)條件。b、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化錳納米片溶液中分別加入40ulFAM-DNA溶液，混合均勻，在37℃放置5min，使FAM-DNA熒光衰減，再分別加入維生素C磷酸酯鎂和堿性磷酸酶，在不同溫度的恒溫箱中30min，檢測FAM-DNA的熒光強度。實驗體系分別在20、30、35、40、50、60℃反應(yīng)30min，如圖4B，由熒光恢復(fù)強度可知實驗的培養(yǎng)溫度為37℃時，實驗的效果最好。c、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化錳納米片溶液中分別加入40ulFAM-DNA溶液，混合均勻，在37℃放置5min，使FAM-DNA熒光衰減，再分別加入維生素C磷酸酯鎂和堿性磷酸酶，分別使用pH值分別為6，7，7.5，8，8.5，9，10的Tris-HCl緩沖溶液，在37℃的恒溫箱中反應(yīng)30min，檢測FAM-DNA的熒光強度。實驗體系的環(huán)境對實驗結(jié)果有很大影響，如圖4C，所用緩沖溶液的pH值為8.5實驗結(jié)果最佳。d、在一系列含有0.2mg/ml的二氧化錳納米片溶液中加入40ulFAM-DNA溶液，混合均勻，在37℃放置5min，使FAM-DNA熒光衰減，再加入不同濃度的維生素C磷酸酯鎂和30ul堿性磷酸酶，在37℃的恒溫箱中反應(yīng)30min，檢測FAM-DNA的熒光強度。實驗中的維生素C磷酸酯鎂濃度可在0.002-0.025M之間，但經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)的比較，如圖4D，維生素C磷酸酯鎂濃度為0.020M，實驗的效果最好。e、在含有0.2mg/ml的二氧化錳納米片溶液中加入40ulFAM-DNA溶液，混合均勻，在37℃放置5min，使FAM-DNA熒光衰減，再加入0.02M維生素C磷酸酯鎂和不同濃度的堿性磷酸酶，在37℃的恒溫箱中反應(yīng)30min，檢測FAM-DNA的熒光強度。在最優(yōu)實驗條件下，堿性磷酸酶的最終濃度分別為5.0U/L，10.0U/L，20.0U/L，30.0U/L，50.0U/L，100.0U/L，150.0U/L，200.0U/L，300.0U/L，400.0U/L，500.0U/L；檢測熒光恢復(fù)強度，構(gòu)建線性關(guān)系，實現(xiàn)對堿性磷酸酶活性的檢測。本申請的檢測結(jié)果與現(xiàn)有技術(shù)相比，結(jié)果如下：堿性磷酸酶檢測方法檢測范圍參考文獻本申請5-500U/L本申請比色5-100mU/mLGaoet.al.(2014)比色20–200U/LYanget.al.(2015)電化學(xué)1-20U/mlMiaoet.al.(2011)熒光3.4--100.0U/LTanget.al.(2016)熒光0.1—10U/LZhanget.al.(2015熒光0–30UL1Liet.al.(2014)上面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進行的各種改進，或未經(jīng)改進直接應(yīng)用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3