一種特利加壓素的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多膚合成技術(shù)領(lǐng)域，尤其是特利加壓素的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 特利加壓素，英文名為Terlipressin,分子式為；C日2HmNi6〇i品，分子量為1227.4 結(jié)構(gòu)式為，結(jié)構(gòu)式：
特利加壓素臨床用于治療嚴(yán)重急性食管靜脈曲張破裂出血，嚴(yán)重急性胃、十二指腸潰 瘍出血，急性糜爛性胃炎或出血性胃炎，膜、膽和腸屢的輔助治療W及糖尿病麗癥酸中毒的 輔助治療，特利加壓素，本身無活性，在體內(nèi)經(jīng)氨基膚酶作用，脫去N末端的3個(gè)甘氨酸殘基 后，緩慢地轉(zhuǎn)化為有活性的賴氨酸加壓素，用于治療肝硬化口脈高壓引起的急性食道靜脈 曲張出血，是一種安全有效的治療急性靜脈曲張出血的藥物。
[0003] 關(guān)于特利加壓素的制備報(bào)道很少，主要涉及到固相合成W及部分液相合成方法。
[0004] 在捷克斯洛伐克專利CZP281589中提到的是液相合成法，WBoc-Gly-氯甲基樹脂 為起始原料，按特利加壓素序列依次接上Boc-Lys(Tos)、Boc-P;ro、Boc-切S度zl)、Boc-Asn、 Boc-Gln、Boc-Phe、Boc-Tyr狂）、Boc-切s度zl)、Boc-Gly、Boc-Gly、Boc-Gly,再經(jīng)氨解、鋼 解、氧化等一系列反應(yīng)制得特利加壓素，此法接膚效率低，僅為75%，工藝時(shí)間長(zhǎng)，且工藝Η 廢嚴(yán)重，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0005] 在中國(guó)專利CN1865282B中提到的是固相合成法，W化nkAmide樹脂為起始原 料，按特利加壓素膚序依次將Fmoc保護(hù)的氨基酸聯(lián)接到固相載體上，然后加入切膚試劑進(jìn) 行切膚，加入己離沉淀，獲得還原型粗品，在pH為7.5-10.0的條件下通空氣氧化，獲得氧 化型粗品，最后采用C18(或C8)柱進(jìn)行分離純化，獲得特利加壓素，此法在制備過程中， 易產(chǎn)生des-Glyi特利加壓素雜質(zhì)(缺失一個(gè)甘氨酸的特利加壓素)，嚴(yán)重影響整個(gè)工藝收 率；氧化過程時(shí)間長(zhǎng)，易發(fā)生膚鏈斷裂現(xiàn)象。
[0006] 在中國(guó)專利CN102408471A中提到的是片段縮合法，液相合成1-3片段，再將此 片段聯(lián)接到固相合成的片段4-12-樹脂上，得到特利加壓素膚樹脂，經(jīng)切割、氧化得到 特利加壓素粗膚，最后采用C18柱分離純化獲得目標(biāo)產(chǎn)品，此法在制備過程中，易產(chǎn)生 des-Glyi，Gly2,Gly3特利加壓素雜質(zhì)（缺失N末端Η個(gè)甘氨酸），且1-3片段合成難度大， 成本高，易形成缺失甘氨酸和多甘氨酸的雜質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)不足，提出一種特利加壓素的制備方法，產(chǎn)品質(zhì)量和收率高。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案；一種特利加壓素的制備方法， 包括： 步驟1 ;采用固相合成法合成3-12特利加壓素片段，獲得中間體i'，F(xiàn)moc-Gly-切S(Trt) -Tyr UBu) -Phe-Gln (Trt) -Asn (T;rt)-切s (Trt) -Pro-Lys (Boc) 樹脂； 步驟2 ;將Boc-Gly-Gl廠OH聯(lián)接到中間體i;上，獲得中間體鎌；Boc-Gly-Gly-Gly-切3燈 ;rt)-TyrUBu) -Phe-Gln(Trt)-Asn(T;rt)-切S(Trt) -Pro-Lys(Boc) 樹脂； 步驟3;中間體ii裂解、環(huán)化獲得特利加壓素粗膚：
步驟4 ;粗膚經(jīng)分離純化獲得特利加壓素純品。
[0009] 按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，步驟1和2中，采用固相合成法，首先按照特利加 壓素的膚序，由C端到N端，依次將Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Lys度OC)-OH、Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Cys(Trt)-〇H、Fmoc-Asn(Trt)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Ty;r(tBu)-〇H、Fmoc-切s(T;rt)-〇H、Fmoc-Gly-OH聯(lián)接到固相樹脂上，獲得中間偉;再 將Boc-Gly-Gly-OH片段聯(lián)接到脫去保護(hù)基團(tuán)Xi的中間體iU：，獲得中間體祖。其中固相樹脂 為化nkAmide樹脂、Ri址Amide-MBHA樹脂、RinkAmide-BHA樹脂、RinkAmide-AM樹脂或 Sieber樹脂；脫保護(hù)試劑為DBU/脈巧/DMF溶液，其中DBU占0. 5%~15%，脈巧占0. 5%~ 20%，溶于DMF中；偶聯(lián)縮合試劑使用TBTU或HOBt或皿TU，活化試劑使用DIC或DIEA。中 間體II的合成包括W下步驟： (1)中間體i的制備： 樹脂活化；將化nk Amide樹脂充分溶脹、洗涂、抽干，加入脫保護(hù)試劑DBU/六氨化巧/DMF溶液，脫除樹脂保護(hù)基團(tuán)，用DMF洗去游離的基團(tuán)，獲得活化的樹脂；其中，樹脂替代度 為0. 4~1. 2 mmol/邑； Fmoc-Gly-樹脂的制備；稱取適量Fmoc-Gly-OH、冊(cè)Bt溶解于DMF中，加入DIC活化， 活化時(shí)間為3~15min,將活化后的氨基酸溶液加入樹脂中，25~35°C下反應(yīng)1.5~4.0h，巧 Η麗顯色法檢測(cè)樹脂透明，反應(yīng)終止；DMF洗涂樹脂除去游離的基團(tuán)，加入己酸酢/化巧/ DMF混合溶液，2(T35°C下封閉1h，DMF洗涂除去游離的基團(tuán)，抽干得到Fmoc-Gly-樹脂；其 中，F(xiàn)moc-Gly-0H、H0Bt、DIC的投料比為樹脂的1. 2~6. 0倍，己酸酢、化巧的投料比是樹脂的 2~20倍； 中間體的制備(膚鏈的延伸）；在Fmoc-Gly-樹脂中加入脫保護(hù)試劑DBU/六氨化 巧/DMF溶液，脫除FmoC保護(hù)基團(tuán)，DMF充分洗涂除去游離的基團(tuán)，按照特利加壓素的 膚序依次將Fmoc-Lys度OC)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-切S(T;rt) -OH、Fmoc-Asn (T;rt) -OH、 Fmoc-Gln (T;rt) -OH、Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Tyr (tBu) -OH、Fmoc-切s (T;rt) -OH、Fmoc-Gly-〇H聯(lián) 接到Fmoc-Gly-樹脂上，得到中間體t，氨基酸、冊(cè)Bt、DIC投料比是1. 2節(jié)0倍，反應(yīng)溫度為 25^35°C，反應(yīng)時(shí)間為1.5^4.0 h，直到反應(yīng)完全，巧Η麗檢測(cè)樹脂為透明。
[0010] (2)中間體拉的制備：在中間體?沖加入脫保護(hù)試劑DBU/六氨化巧/DMF溶液，脫 除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，DMF充分洗涂除去游離的基團(tuán)，加入Boc-Gly-Gly-OH/HOBt/DIC活化液， 25~35°C下反應(yīng)1. 5~4. 0h，直到反應(yīng)完全，氨基酸、HOBt、DIC的投料比為1. 2~6. 0倍。
[0011] (3)中間體Ι?裂解、環(huán)化： 裂解試劑使用混合酸試劑，混合酸試劑為TFA、水和其它捕獲試劑混合物，捕獲試劑選 擇邸T、MPS、苯酪中的至少一種，TFA比例為80%~85%，捕獲試劑比例為10%~15%，其余為水。 裂解時(shí)間為1~4h，裂解溫度15~35°C，裂解試劑用量按每克膚樹脂需要4~20ml裂解試劑。 裂解液用己離洗涂、沉淀、離必，取沉淀用己離反復(fù)洗涂Γ8次后，干燥獲得線性特利加壓 素粗品。
[0012] 將線性特利加壓素粗膚溶解，使用稀氨水調(diào)整溶液pH至7. 5^10. 0,用雙氧水或賄 等氧化試劑環(huán)化，反應(yīng)廣3h，直至環(huán)化結(jié)束，調(diào)整溶液抑至酸性，獲得特利加壓素粗膚。[001引 （4)分離純化 將特利加壓素粗膚溶液使用微孔濾膜過濾，取濾液上C18柱，梯度洗脫，其中流動(dòng)相系 統(tǒng)選擇0. 1%醋酸水溶液-己臘溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇21(Γ280nm之間，取純度為99%W上的 樣品為特利加壓素精制液。
[0014] 由上述技術(shù)方案可見，本方法采用片段縮合法合成特利加壓素，固相合成3-12片 段，再將Boc-Gly-Gly-OH聯(lián)接到固相片段上，每步接膚收率> 99%，膚樹脂經(jīng)裂解、環(huán)化獲 得特利加壓素粗膚，粗膚制備收率為77%，后經(jīng)純化獲得精膚，純度為99 %W上，收率為 92%，工藝總收率70%W上。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明固相合成3-12片段，WDBU/六氨化巧/DMF溶液作 為脫保護(hù)試劑，降低缺失膚雜質(zhì)的產(chǎn)生；WBoc-Gly-Gly-OH片段直接聯(lián)接到3-12片段 上，降低了des-Glyi和des-Glyi,Gly2,Gly3雜質(zhì)的產(chǎn)生，Boc-Gly-Gly-OH成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 Boc-Gly-Gly-Gly-OH，且不含對(duì)產(chǎn)品合成工藝質(zhì)量有影響的雜質(zhì)，總成本和產(chǎn)品質(zhì)量都有 明顯優(yōu)勢(shì)。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本文所述，術(shù)語(yǔ)"氨基保護(hù)基團(tuán)"所指部分是保護(hù)氨基部分，防止氨基參與反應(yīng)，且 對(duì)反應(yīng)本身無不可接受的不利影響。Fmoc，Boc等均為氨基保護(hù)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"駿基保護(hù)基團(tuán)" 所指部分式保護(hù)駿基部分，防止駿基參與反應(yīng)，且對(duì)反應(yīng)本身物不可接受的不利影響。
[0017]本文所述，F(xiàn)moc是9-巧甲氧撰基，Boc是叔了氧撰