本發(fā)明涉及1-芘甲酸作為熒光探針在檢測(cè)溶液pH值中的應(yīng)用，屬于光分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行或完成、細(xì)胞和細(xì)胞器的許多重要生理過程都與pH值密切相關(guān)。因此，pH值的精確測(cè)量對(duì)化學(xué)、生物學(xué)研究都十分重要。現(xiàn)有的pH測(cè)量方法主要有電極法、指示劑法和熒光光譜法等。

現(xiàn)有的pH測(cè)量方法還存在如下不足：(1)電極法由于存在電化學(xué)干擾、可能的機(jī)械損傷等缺陷而不適于活體pH檢測(cè)；(2)指示劑法由于顯色范圍寬，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度降低；(3)熒光光譜法是一種基于光學(xué)信號(hào)建立的檢測(cè)方法，其與前兩種方法相比具有靈敏度高、選擇性好、能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)、原位檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因而受到較高的重視，但pH熒光探針普遍存在的問題是對(duì)氫離子的響應(yīng)范圍寬，從而導(dǎo)致探針的靈敏度低、選擇性差、容易受到金屬離子的干擾。

因此，發(fā)展一種不易受金屬離子干擾、窄響應(yīng)范圍、可用于測(cè)定較窄pH范圍的熒光探針仍是一個(gè)重要的研究方向。

1-芘甲酸，其化學(xué)式如(I)所示，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商品化，但該物質(zhì)作為pH熒光探針是新的用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有pH熒光探針技術(shù)的不足，提供了1-芘甲酸作為pH熒光探針的應(yīng)用及其測(cè)定pH值的方法。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

1-芘甲酸作為pH熒光探針的應(yīng)用。

一種測(cè)定pH值的方法，包括如下步驟：

1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：將1-芘甲酸加入不同pH值的緩沖溶液中，配置成相同濃度的1-芘甲酸溶液，記錄各溶液的熒光強(qiáng)度，測(cè)定pH值與熒光強(qiáng)度的定量關(guān)系；

2)將1-芘甲酸加入待測(cè)溶液中，配置成相同濃度的1-芘甲酸溶液，記錄溶液的熒光強(qiáng)度；

3)根據(jù)定量關(guān)系計(jì)算待測(cè)溶液的pH值。

優(yōu)選的，上述步驟1)中，在激發(fā)波長(zhǎng)為350nm，發(fā)射波長(zhǎng)為382nm處，測(cè)定1-芘甲酸溶液熒光強(qiáng)度與pH值的定量關(guān)系。

優(yōu)選的，上述步驟1)中，在激發(fā)波長(zhǎng)為350nm，發(fā)射波長(zhǎng)為401nm處，測(cè)定1-芘甲酸溶液熒光強(qiáng)度與pH值的定量關(guān)系。

優(yōu)選的，配置成的所述1-芘甲酸溶液中1-芘甲酸的濃度為2.0×10^-5mol/L。

優(yōu)選的，所述緩沖溶液為磷酸、醋酸、硼酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液中的一種。

本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)可在水溶液中檢測(cè)pH值：1-芘甲酸水溶性好，能很容易地配制成水溶液，并能在水溶液中方便地檢測(cè)氫離子濃度；

(2)抗干擾能力好：利用1-芘甲酸對(duì)pH緩沖溶液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，緩沖溶液的濃度在一個(gè)較寬的范圍內(nèi)不會(huì)影響到1-芘甲酸的熒光強(qiáng)度，而且，緩沖溶液的種類，如磷酸、醋酸、硼酸、HEPES等緩沖溶液也不影響熒光響應(yīng)，應(yīng)用范圍較廣；

(3)選擇性強(qiáng)：常見的金屬離子對(duì)1-芘甲酸熒光探針識(shí)別氫離子的特性影響很小。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明：

圖1是在不同pH值的緩沖溶液(緩沖溶液濃度為2.0×10^-3mol/L，其中的1-芘甲酸濃度為2.0×10^-5mol/L)中1-芘甲酸的熒光發(fā)射圖譜(所采用緩沖溶液的pH分別為11.07、9.92、8.97、8.05、7.00、6.40、5.81、5.22、5.00、4.61、4.43、4.04、3.69、3.43、2.90、2.73、2.32、2.20；激發(fā)波長(zhǎng)為350nm)；

圖2是根據(jù)圖1繪制的I₄₀₁/I₃₈₂隨pH變化的趨勢(shì)圖(pH＝11.07、9.92、8.97、8.05、7.00、6.40、5.81、5.22、5.00、4.61、4.43、4.04、3.69、3.43、2.90、2.73、2.32、2.20；I₄₀₁、I₃₈₂為發(fā)射波長(zhǎng)為382nm和401nm處的熒光強(qiáng)度；激發(fā)波長(zhǎng)為350nm)；

圖3是根據(jù)圖1繪制的在發(fā)射波長(zhǎng)為382nm處1-芘甲酸熒光強(qiáng)度隨pH值的變化圖(計(jì)算得1-芘甲酸的酸解離常數(shù)pKa＝4.97)；

圖4為在pH為5.00的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄緩沖溶液(緩沖溶液濃度為2.0×10^-3mol/L，其中的1-芘甲酸濃度為2.0×10^-5mol/L)中分別加入1.0×10^-4mol/L的Al³⁺、Ba²⁺、Cd²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺的I₄₀₁/I₃₈₂比值變化示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明：

以下所述緩沖溶液可為磷酸、醋酸、硼酸、HEPES等緩沖溶液。緩沖溶液中1-芘甲酸的濃度為2.0×10^-5mol/L，僅為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，在實(shí)際操作中，可根據(jù)需要選擇不同的濃度。

實(shí)施例1

1-芘甲酸對(duì)不同pH值的熒光識(shí)別：

分別配制含有1-芘甲酸的不同pH值(pH＝11.07、9.92、8.97、8.05、7.00、6.40、5.81、5.22、5.00、4.61、4.43、4.04、3.69、3.43、2.90、2.73、2.32、2.20)的緩沖溶液(緩沖溶液濃度為2.0×10^-3mol/L，其中1-芘甲酸的濃度為2.0×10^-5mol/L。采用350nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定并繪制不同pH值緩沖溶液中1-芘甲酸的熒光光譜(如圖1所示)。

如圖1所示，用350nm波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)在382nm和401nm處附近熒光強(qiáng)度最大，且1-芘甲酸的熒光發(fā)射波長(zhǎng)在382nm處時(shí)，隨著pH值的減小，1-芘甲酸對(duì)氫離子的響應(yīng)表現(xiàn)為熒光淬滅；在401nm處時(shí)，隨著pH值的減小，1-芘甲酸對(duì)氫離子的響應(yīng)表現(xiàn)為熒光增強(qiáng)，是一種很好的比率型pH熒光探針。

如圖2所示I₄₀₁/I₃₈₂隨pH變化的趨勢(shì)圖，I₄₀₁/I₃₈₂在pH為2.0～6.0的范圍內(nèi)積極響應(yīng)，且隨著pH值的減小，熒光強(qiáng)度比值I₄₀₁/I₃₈₂急劇升高。在pH2.0～6.0的范圍內(nèi)，I₄₀₁/I₃₈₂與pH可近似為線性關(guān)系。將1-芘甲酸加入待測(cè)溶液中，配置具有相同1-芘甲酸濃度的待測(cè)溶液，即待測(cè)溶液中1-芘甲酸濃度為2.0×10^-5mol/L，記錄溶液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算I₄₀₁/I₃₈₂，通過上述線性關(guān)系計(jì)算出待測(cè)溶液的pH值。

如圖2所示，在發(fā)射波長(zhǎng)為382nm處1-芘甲酸熒光強(qiáng)度隨pH值的變化圖。根據(jù)圖3以及IF-pH曲線，以382nm處的峰強(qiáng)度為基準(zhǔn)，用Henderson-Hasselbach-type方程：pKa＝pH+log[(F_max-F)/(F-F_min)]計(jì)算出此探針的pKa值為4.97，即計(jì)算得1-芘甲酸的酸解離常數(shù)pKa為4.97，屬于弱酸。由此可見，1-芘甲酸熒光探針可用于酸性體系中pH值的測(cè)定。

實(shí)施例2

1-芘甲酸熒光探針對(duì)氫離子的選擇性：

向pH值為5.0的緩沖溶液(其中1-芘甲酸的濃度為2.0×10^-5mol/L)中，滴加含Al³⁺的金屬離子溶液，使得緩沖溶液中Al³⁺的濃度1.0×10^-4mol/L。采用相同方法配置分別含Ba²⁺、Cd²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺的緩沖溶液(每份緩沖溶液中的相應(yīng)金屬離子濃度均為1.0×10^-4mol/L，1-芘甲酸的濃度為2.0×10^-5mol/L)。

采用350nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定上述每份待測(cè)溶液的熒光光譜，并計(jì)算I₄₀₁/I₃₈₂，以熒光強(qiáng)度比值I₄₀₁/I₃₈₂對(duì)應(yīng)不同金屬離子作圖(如圖4所示)。

如圖4所示，每份待測(cè)溶液中1-芘甲酸的熒光強(qiáng)度比值I₄₀₁/I₃₈₂相差不大，說(shuō)明1-芘甲酸對(duì)氫離子的熒光識(shí)別幾乎不受金屬離子的影響，即1-芘甲酸熒光探針對(duì)氫離子具有較高的選擇性。

以上實(shí)施例并非僅限于本發(fā)明的保護(hù)范圍，所有基于本發(fā)明的基本思想而進(jìn)行的修改或變動(dòng)都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。