本發(fā)明涉及一種測(cè)定脂質(zhì)囊泡中蛋白或多肽類藥物包封率的方法，屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

多肽、蛋白類藥物脂質(zhì)囊泡的研究是當(dāng)前一個(gè)十分活躍的領(lǐng)域。脂質(zhì)囊泡是由脂質(zhì)組成、內(nèi)部為水相的閉合囊泡，其內(nèi)水相和膜內(nèi)分別可包裹親水和疏水性物質(zhì)。根據(jù)組成的不同，脂質(zhì)囊泡有脂質(zhì)體、傳遞體、類質(zhì)體、醇質(zhì)體等種類，但其結(jié)構(gòu)均為球形閉合囊泡。蛋白口服后會(huì)受到胃腸道酸、堿條件，體液及酶的破壞而發(fā)生降解和失活。而以脂質(zhì)囊泡為載體口服后由于脂質(zhì)雙層的保護(hù)作用，可降低各種因素對(duì)蛋白類藥物的降解程度，提高藥物的穩(wěn)定性；同時(shí)口服脂質(zhì)囊泡還具有種類多樣，選擇性和輔佐性強(qiáng)，不良反應(yīng)低的特點(diǎn)，尤其作為黏膜免疫抗原載體而倍受青睞。目前包封率是脂質(zhì)囊泡質(zhì)量評(píng)價(jià)中的重要指標(biāo)之一。目前報(bào)道的測(cè)定方法有以下幾種：(1)透析法：利用半透膜分子大小差別，通過及時(shí)更換外相達(dá)到分離的目的。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，缺點(diǎn)是耗時(shí)較長(zhǎng)，所耗介質(zhì)較多,易造成藥物滲漏。(2)超速離心法：利用自由藥物與含藥脂質(zhì)囊泡的重力差異進(jìn)行分離。但該方法成本較高，且各批樣品間重現(xiàn)性差，由于離心力較大會(huì)使脂質(zhì)囊泡中藥物滲漏丟失而導(dǎo)致藥物的包封率偏低。(3)凝膠柱色譜法：常用的色譜柱為葡聚糖凝膠 (Sephadex) 柱和瓊脂糖凝膠 (Sepharose)柱，利用脂質(zhì)囊泡和游離藥物相對(duì)分子質(zhì)量的差異進(jìn)行分離，但存在洗脫時(shí)間長(zhǎng)、洗脫體積大、藥物濃度低等問題。(4)超濾膜過濾法：利用游離藥物能通過濾膜，而含藥脂質(zhì)囊泡被截留在濾膜上來分離游離藥物與脂質(zhì)囊泡。該方法的缺點(diǎn)是膜上藥物體積小，膜對(duì)藥物的吸附較強(qiáng)，導(dǎo)致包封率偏高。上述各種脂質(zhì)囊泡藥物包封率測(cè)定法存在一個(gè)共同的問題，即所得包封率均存在一定的誤差。如透析法、層析法及濾膜法，都是利用分子大小差異進(jìn)行分離，故較難將脂質(zhì)囊泡與藥物晶體和/或脂質(zhì)囊泡碎片分離，影響包封率測(cè)定的結(jié)果；且三種方法都耗時(shí)較長(zhǎng)，與藥物濃度有很大關(guān)系，在層析柱或者濾膜的選擇上也存在困難；離心法雖相對(duì)測(cè)量速度較快，但易造成脂質(zhì)囊泡中藥物的滲漏，對(duì)儀器存在明顯依賴，使用成本較高。因此，非常有必要尋找其他的測(cè)量方法，既快速簡(jiǎn)便，又能準(zhǔn)確地反映藥物的包封情況。

目前實(shí)驗(yàn)室研究測(cè)定蛋白質(zhì)含量的常用方法主要有Folin-酚試劑法( Lowry法)、考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue G-250，CBB) 染色法，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法等，其中Lowry法與BCA法屬于化學(xué)法。Lowry法的測(cè)定原理為蛋白質(zhì)與堿性硫酸銅作用形成銅-肽鍵絡(luò)合物，后者與色氨酸和酪氨酸共同作用使酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸還原生成藍(lán)色化合物；BCA 法的測(cè)定原理為蛋白質(zhì)價(jià)銅離子還原成亞銅離子，后者在堿性溶液中與BCA 結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物。Bradford 法屬于染料結(jié)合法，即考馬斯亮藍(lán) G-250在酸性溶液中呈紅棕色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，顏色深淺與蛋白濃度呈正比關(guān)系。

各種方法測(cè)定蛋白濃度的范圍如下：Lowry法標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度設(shè)置范圍為10～100 μg/mL；BCA 法標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度設(shè)置在20～1000 μg/mL；Bradford法為31.25～2000 μg /mL。每種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性，在蛋白質(zhì)樣品中往往會(huì)含有一些化學(xué)試劑，會(huì)干擾蛋白濃度測(cè)定。影響 Lowry法測(cè)定蛋白的主要因素有某些氨基酸、非離子表面活性劑、蔗糖、含硫化合物；影響 BCA法測(cè)蛋白的主要因素有蔗糖、尿素、EDTA，影響B(tài)radford法的主要因素有甘油、乙酸、去污劑和一些堿性緩沖系統(tǒng)。對(duì)于脂質(zhì)囊泡蛋白藥物而言，選擇BCA法可以減少非離子表面活性劑對(duì)蛋白濃度檢測(cè)時(shí)的干擾。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，BCA法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS、Triton X-100、Tween-20、Tween-60、Tween-80等表面活性劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有脂質(zhì)囊泡中蛋白或多肽類藥物包封率測(cè)定方法的不足，提供一種快速簡(jiǎn)便的包封率計(jì)算方法。

根據(jù)本發(fā)明的包封率計(jì)算方法，其特征在于，利用脂質(zhì)囊泡內(nèi)外蛋白或多肽與顯色試劑的反應(yīng)速率差異實(shí)現(xiàn)包封率的計(jì)算，所述方法包括以下步驟：

（1）常規(guī)制備包裹有蛋白或多肽的脂質(zhì)囊泡溶液；

（2）將步驟（1）中的脂質(zhì)囊泡溶液中的總蛋白濃度稀釋到合適范圍內(nèi)；

（3）取一定量步驟（2）中的脂質(zhì)囊泡溶液，加入破乳劑，使脂質(zhì)囊泡溶解；

（4）將步驟（2）和步驟（3）的脂質(zhì)囊泡溶液，分別按每孔20 μL加至96孔板，再在每孔中加入200 μL 能與蛋白或多肽進(jìn)行顯色反應(yīng)的試劑；

（5）在步驟（4）96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中分別加入0.5 mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加樣，再加入200 μL能與蛋白或多肽進(jìn)行顯色反應(yīng)的試劑；

（6）將步驟（4）和（5）的96孔板在一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間，直至出現(xiàn)顏色變化；

（7）將步驟（6）的96孔板放置于酶標(biāo)儀，選擇562 nm處讀取吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算步驟（4）各孔蛋白濃度。

（8）根據(jù)公式 脂質(zhì)囊泡蛋白包封率=(C_總-C_游)/C_總×100%

計(jì)算包封率，式中，C_總表示破乳脂質(zhì)囊泡的蛋白總濃度，C_游為未處理脂質(zhì)囊泡所測(cè)得的蛋白濃度。

其中，步驟（1）所述脂質(zhì)囊泡中包裹的物質(zhì)可替換為其他能與檢測(cè)試劑發(fā)生相互作用的物質(zhì)；所述脂質(zhì)囊泡，系能夠形成囊泡結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)分子，其成分包括磷脂、膽固醇、表面活性劑和其他類脂分子等。

步驟（2）所述脂質(zhì)囊泡稀釋后的總蛋白濃度范圍應(yīng)處于20～1000 μg/mL。

步驟（3）所述破乳劑為包括且不限于Triton X-100、Tween 20或Tween 80等非離子表面活性劑和其他類型的破乳劑；所述破乳劑終濃度為0.1%～0.5%。

步驟（4）或（5）中所述能與蛋白或多肽進(jìn)行顯色反應(yīng)的試劑為BCA反應(yīng)試劑；

所述BCA反應(yīng)試劑由購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒中的按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制而成。

步驟（6）中所述反應(yīng)溫度為37 oC～60oC；所述反應(yīng)時(shí)間為20～40分鐘；

其中的96孔板也可以換成普通石英比色皿進(jìn)行檢測(cè)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明方法可避免常規(guī)的游離蛋白/多肽分子的分離或去除步驟，能一步快速直接測(cè)量出脂質(zhì)囊泡中游離蛋白和總蛋白的含量，從而計(jì)算出脂質(zhì)囊泡中的蛋白包封率，適合大規(guī)模脂質(zhì)囊泡包裹蛋白/多肽的處方工藝篩選時(shí)，包封率的快速測(cè)定和比較。其原理是BCA反應(yīng)試劑中含有銅離子，已知二價(jià)銅離子在堿性的條件下，被蛋白質(zhì)還原成一價(jià)銅離子，一價(jià)銅離子和二喹啉甲酸（BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個(gè)銅離子，形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562 nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此由吸光值可以推算出蛋白濃度。根據(jù)上述反應(yīng)原理，一方面利用脂質(zhì)囊泡外游離蛋白的催化作用，使BCA與銅離子發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)吸光度值可以計(jì)算出游離蛋白的濃度C_游；另一方面，由于脂質(zhì)囊泡結(jié)構(gòu)的密封性，銅離子無法順利與脂質(zhì)囊泡內(nèi)的包裹蛋白發(fā)生作用，只有當(dāng)通過表面活性劑對(duì)脂質(zhì)囊泡進(jìn)行溶解破壞，釋放出脂質(zhì)囊泡中包裹的蛋白之后，才能與游離蛋白一起與銅離子和BCA發(fā)生化學(xué)顯色反應(yīng)，從而再根據(jù)吸光度值獲得總蛋白的濃度C_總，因此根據(jù)以下公式可達(dá)到快速計(jì)算脂質(zhì)囊泡蛋白藥物包封率的目的。

脂質(zhì)囊泡蛋白包封率=(C_總-C_游)/C_總×100%

另外，該法還可用于評(píng)價(jià)游離蛋白的分離效果。例如，用透析或離心超濾管將游離蛋白除去后，可對(duì)處理后的脂質(zhì)囊泡取樣直接加入顯色劑，并另取樣加表面活性劑破乳后再加顯色劑，如兩者所測(cè)得的數(shù)值差別明顯，表明所用分離方法對(duì)游離蛋白的清除效果較好，即分離有效，反之則反；同時(shí)可以據(jù)此計(jì)算出分離后游離蛋白的殘余量，如圖4所示。

綜上所述，根據(jù)本發(fā)明提供了一種聯(lián)合BCA檢測(cè)蛋白原理和表面活性劑對(duì)脂質(zhì)囊泡蛋白藥物包封率的方法。該方法解決了常規(guī)方法在測(cè)量脂質(zhì)囊泡蛋白藥物包封率時(shí)，需要預(yù)先分離游離蛋白藥物的問題，省時(shí)省力。利用酶標(biāo)儀和該方法，可進(jìn)行大規(guī)模脂質(zhì)囊泡蛋白藥物包封率的測(cè)定和計(jì)算，操作方便，重復(fù)性好，為需要脂質(zhì)囊泡蛋白藥物的相關(guān)生產(chǎn)應(yīng)用和研究領(lǐng)域提供了一項(xiàng)有效的方法依據(jù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明脂質(zhì)囊泡蛋白包封率測(cè)定原理示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中脂質(zhì)囊泡蛋白濃度測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中脂質(zhì)囊泡總蛋白濃度（+Triton X-100）和游離蛋白濃度（-Triton X-100）測(cè)量值隨時(shí)間變化結(jié)果；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3使用離心超濾法（UF）分離游離蛋白后，起始總蛋白濃度（Initial+Triton）與超濾分離后總蛋白濃度（UF+Triton）測(cè)量值隨時(shí)間變化結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例中所述BCA反應(yīng)試劑由購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒中的按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制而成。

實(shí)施例1：

按常規(guī)反相蒸發(fā)法制備包裹牛血清白蛋白(BSA)的脂質(zhì)體，具體如下：稱取20 mg大豆卵磷脂與5 mg膽固醇，用9 mL乙醚溶解后加至圓底燒瓶，加入3 mL 1 mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）溶液，水浴超聲2～5分鐘形成穩(wěn)定的白色乳懸液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干除去有機(jī)溶劑，取出剩余液體，冰水浴探頭超聲處理，至溶液變澄清即得脂質(zhì)體溶液。將脂質(zhì)體溶液稀釋10倍后濃度為0.1 mg/mL。取96孔板，將稀釋后的脂質(zhì)體溶液按每孔20 μL加樣；另取稀釋后的脂質(zhì)體溶液，加入Triton X-100至終濃度為0.5%，同樣按每孔20 μL加樣；標(biāo)準(zhǔn)品孔中每孔加入0.5 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加樣，不足20 μL加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足；所有孔加200 μL BCA反應(yīng)試劑后，在40 oC放置40 min出現(xiàn)顏色改變，迅速置于酶標(biāo)儀，選擇562 nm處讀取吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔的蛋白濃度和相應(yīng)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如附圖2所示，經(jīng)線性擬合后所得回歸方程為 y=0.015+1.483 x （y為吸光度，X為蛋白濃度，單位為mg/mL），再根據(jù)此方程計(jì)算樣品濃度。以加Triton X-100的脂質(zhì)體孔所得為總蛋白濃度C_總= 0.455，以無Triton X-100的脂質(zhì)體孔所得為游離蛋白濃度C_游= 0.176，根據(jù)公式計(jì)算包封率為61.2%。

脂質(zhì)囊泡蛋白包封率=(C_總-C_游)/C_總×100%

實(shí)施例2：

按常規(guī)薄膜分散法制備包裹牛血清白蛋白(BSA)的傳遞體，具體如下：稱取30 mg大豆卵磷脂，6 mg膽固醇，2 mg脫氧膽酸鈉，用適量氯仿溶解后加至圓底燒瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干除去有機(jī)溶劑，使燒瓶底部形成一均勻的薄膜；將燒瓶置于真空干燥器抽真空至少3小時(shí)，以完全除去殘余的有機(jī)溶劑，加入5 mL 1 mg/mL 的BSA溶液，振蕩使薄膜水化，水浴超聲處理30分鐘，至溶液變澄清即得傳遞體溶液，取適量傳遞體溶液稀釋10倍備用。取96孔板，將稀釋后的傳遞體溶液按每孔20 μL加樣；另取稀釋后的傳遞體溶液，加入Triton X-100至終濃度為0.25%，同樣按每孔20 μL加樣；標(biāo)準(zhǔn)品孔中每孔加入0.5 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加樣，不足20 μL加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足；所有孔加200 μL BCA反應(yīng)試劑后，在50oC放置20 min，迅速置于酶標(biāo)儀，選擇562 nm處讀取吸光度值。每隔10 min掃板一次，連續(xù)記錄一個(gè)小時(shí)，之后在室溫下，顯色后第3、7、24小時(shí)復(fù)掃一次，記錄不同時(shí)間下的吸光度變化。根據(jù)每次測(cè)量所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各孔蛋白濃度，如附圖3所示為游離蛋白濃度（-Triton X-100）與總蛋白濃度（+Triton X-100）的時(shí)間變化曲線。該圖可看出當(dāng)測(cè)量時(shí)間超過1h后，游離蛋白和總蛋白濃度的開始發(fā)生明顯改變，因此需要選取在1h內(nèi)所測(cè)值，根據(jù)公式計(jì)算包封率。此例中，根據(jù)測(cè)量30分鐘時(shí)所得數(shù)值進(jìn)行包封率的計(jì)算，以加Triton X-100的傳遞體孔所得為總濃度C_總= 0.434，以無Triton X-100的傳遞體孔所得為游離濃度C_游= 0.298，根據(jù)公式計(jì)算包封率為31.2%。

脂質(zhì)囊泡蛋白包封率=(C_總-C_游)/C_總×100%

實(shí)施例3：

按照實(shí)施例1制備脂質(zhì)體溶液，取1 mL脂質(zhì)體溶液采用截留分子量為100 kD的超濾離心管將游離的蛋白通過離心除去，再用終濃度為0.1% Triton X-100將分離前后的脂質(zhì)體破乳，各取20 μL，加200 μL BCA反應(yīng)試劑后，在50oC放置20 min，迅速置于酶標(biāo)儀，選擇562 nm處讀取吸光度值。同樣每隔10 min掃板一次，連續(xù)記錄一個(gè)小時(shí)，之后在室溫下，顯色后第3、7、24小時(shí)復(fù)掃一次，記錄不同時(shí)間下的吸光度變化。根據(jù)每次測(cè)量所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各孔蛋白濃度，如附圖4所示為起始總蛋白濃度（Initial+Triton）與超濾分離后總蛋白濃度（UF+Triton）的時(shí)間變化曲線。該圖可看出經(jīng)過超濾離心后，總蛋白濃度明顯降低，且數(shù)值不隨時(shí)間的改變而改變，說明游離蛋白的分離效果很好，本實(shí)施例選取在30 min時(shí)所測(cè)值，起始總蛋白濃度為0.375，分離后總濃度值為包裹蛋白濃度C_包=0.148，根據(jù)公式計(jì)算包封率為39.5%。

脂質(zhì)囊泡蛋白包封率=C_包/C_總×100%

實(shí)施例4：

將牛血清白蛋白換用卵清蛋白，按實(shí)施例2制備傳遞體溶液。對(duì)所制備的脂質(zhì)體溶液，先采用截留分子量為100 kD的透析袋透析除去游離的卵清蛋白，再取一定量分離前后的傳遞體溶液用終濃度0.5 % Tween 80破乳，如實(shí)施例3所述加BCA反應(yīng)試劑顯色，測(cè)得包裹蛋白濃度C_包，根據(jù)公式計(jì)算包封率為38.2%。

脂質(zhì)囊泡蛋白包封率=C_包/C_總×100%

實(shí)施例5：

將牛血清白蛋白換用人血清蛋白，按實(shí)施例1制備脂質(zhì)體溶液。對(duì)所制備的脂質(zhì)體溶液，采用凝膠色譜柱分離除去游離的卵清蛋白，再取分離前后一定量脂質(zhì)體溶液，用終濃度0.5 % Tween 20破乳，如實(shí)施例4分別加入BCA反應(yīng)試劑，顯色，測(cè)得包裹蛋白濃度C_包，根據(jù)公式計(jì)算包封率為66.7%。

脂質(zhì)囊泡蛋白包封率=C_包/C_總×100%

實(shí)施例6：

將牛血清白蛋白換用人血清白蛋白，按實(shí)施例2制備脂質(zhì)體溶液，計(jì)算包封率。同時(shí)，對(duì)所制備的脂質(zhì)體溶液，采用常規(guī)超速離心法將脂質(zhì)體與游離蛋白分開，再取一定量上清，加BCA反應(yīng)試劑，顯色，測(cè)得游離蛋白濃度C_游，根據(jù)公式計(jì)算包封率為35.4%。

脂質(zhì)囊泡蛋白包封率=(C_總-C_游)/C_總×100%