本發(fā)明屬于生物分析領(lǐng)域，尤其是涉及一種人尿中對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑濃度的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：對(duì)羥基苯甲酸酯又名尼泊金酯,常溫條件下為無(wú)色晶體或結(jié)晶性粉末，包括了其甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯、丁酯、異丁酯等,通常來(lái)說(shuō)，隨著其烷基碳鏈的增大，其毒性降低，抗菌作用增強(qiáng)。羥基苯甲酸酯水溶性較差，可以通過(guò)合成其鈉鹽來(lái)提高其水溶性。對(duì)羥基苯甲酸甲酯，也稱尼泊金甲酯或羥苯甲酯，白色結(jié)晶粉末或無(wú)色結(jié)晶，易溶于醇，醚和丙酮，極微溶于水，沸點(diǎn)270-280℃。主要用作有機(jī)合成、食品、化妝品、醫(yī)藥的殺菌防腐劑，也用作于飼料防腐劑。對(duì)羥基苯甲酸甲酯防腐劑主要添加在食品中，如果長(zhǎng)期大量食用對(duì)羥基苯甲酸甲酯，可能會(huì)造成腸胃不適，皮膚、黏膜發(fā)炎和產(chǎn)生女性荷爾蒙。對(duì)羥基苯甲酸乙酯對(duì)霉菌的抑菌效能較強(qiáng)，對(duì)細(xì)菌也有一定的抑制作用。在藥劑中用作抑菌防腐劑，廣泛用于液體制劑、半固體制劑。本品在食品工業(yè)和日化工業(yè)中具有相似的用途，廣泛用于食品和化妝品的防腐。對(duì)羥基苯甲酸乙酯服用量大也會(huì)對(duì)人體造成腸胃等不適。對(duì)羥基苯甲酸丙酯又名尼泊金丙酯，對(duì)羥基安息香酸丙酯。對(duì)霉菌、酵母與細(xì)菌有廣泛的抗菌作用，其抗菌作用大于尼泊金乙酯。曾用于醬油、醬菜生產(chǎn)中的食品防腐劑。健康危害：吸入、攝入或經(jīng)皮膚吸收對(duì)身體有害。對(duì)眼、粘膜和上呼吸道和皮膚有刺激作用。對(duì)羥基苯甲酸丁酯又名尼泊金丁酯；用于藥品、化妝品及食品的抑菌和防腐。對(duì)酵母和霉菌有很強(qiáng)的抑制作用。對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑已在人體血液和尿液中廣泛檢出，在人體內(nèi)主要以代謝物對(duì)羥基苯甲酸的形式存在。研究表明，該類防腐劑可能與乳腺癌的發(fā)病有關(guān)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該類防腐劑可能具有雌激素活性，因此其在環(huán)境介質(zhì)和人體組織中的殘留、污染和毒性受到廣泛關(guān)注。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高、成本低的對(duì)羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯濃度檢測(cè)方法，尤其適合對(duì)尿液中對(duì)羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯濃度的檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案是：人尿中人尿中對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑濃度的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，包括以下步驟：1)樣品處理：取待測(cè)尿液樣品于試管或離心管中，加樣1/10倍體積的水，然后加入β-葡糖糖苷酸酶，搖勻并密封，放入37℃水浴中加熱至反應(yīng)完全，取一定量的反應(yīng)液，加入3倍量的沉淀劑(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，渦旋混勻后，15000rpm離心10min，取上清5-10μL進(jìn)行樣分析。2)HPLC-MS/MS分析：將處理后的樣品用三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀，在以下條件下進(jìn)行分析液相條件：流動(dòng)相：A:0.1％甲酸水溶液，B:乙腈；流速：0.3ml/min；進(jìn)樣量：5μL；柱溫：45℃；色譜柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn表1.梯度洗脫程序Time/minA％B％09552.070305.060407.010908.010908.195510.0955表2.質(zhì)譜條件其他質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管電壓(kV):3.2kV；源溫度(℃):120；脫溶劑氣溫度(℃):350；脫溶劑氣流量(L/Hr):800；氣簾氣流量(L/Hr):50；駐留時(shí)間(s)：0.1s3)根據(jù)樣品的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程中，計(jì)算尿液中對(duì)羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯的濃度。進(jìn)一步，步驟(1)樣品處理方法為：取500μL尿液，加50μL水，50μL的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，搖勻并密封，放入37℃水浴中加熱120min。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液100μL，加入300μL沉淀劑(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，渦旋混勻后，15000rpm離心10min，取上清5μL進(jìn)樣分析。以上方法步驟(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作過(guò)程：a.標(biāo)準(zhǔn)品處理：取500μL尿液，加入50μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成相當(dāng)于尿液中塑化劑各成分濃度為：5，10，25，50，100，250，500ng/ml的系列溶液，加入50υΛ的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，搖勻并密封，放入37℃水浴中加熱120min。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液100μL，加入300μL沉淀劑(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，渦旋混勻后，15000rpm離心10min，取上清5μL進(jìn)樣分析。b.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積與尿液樣品相應(yīng)成分峰面積的差值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在HPLC-MS分析時(shí)，按照常規(guī)方法繪制4種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線可以確定4種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限，具體見(jiàn)表3。表3HPLC-MS/MS測(cè)定對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑的線性方程，相關(guān)系數(shù)，檢出限LOD和定量限LOQ本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：UPLC-MS/MS檢測(cè)方法檢測(cè)人尿中對(duì)羥基苯甲酸酯類濃度，簡(jiǎn)單快捷，靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，適合尿液中防腐添加劑的同時(shí)定性定量檢測(cè)，過(guò)量防腐劑的食品可通過(guò)代謝在尿中檢出，為食品行業(yè)中食品中防腐添加劑的監(jiān)管提供了技術(shù)支持。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明的四種對(duì)羥基苯甲酸酯類的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(A:對(duì)羥基苯甲酸甲酯；B:對(duì)羥基苯甲酸乙酯；C:對(duì)羥基苯甲酸丙酯；D:對(duì)羥基苯甲酸丁酯)。圖2是最低定量限(5ng/ml)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖((A:對(duì)羥基苯甲酸甲酯；B:對(duì)羥基苯甲酸乙酯；C:對(duì)羥基苯甲酸丙酯；D:對(duì)羥基苯甲酸丁酯)。圖3是標(biāo)線(25ng/ml)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖((A:對(duì)羥基苯甲酸甲酯；B:對(duì)羥基苯甲酸乙酯；C:對(duì)羥基苯甲酸丙酯；D:對(duì)羥基苯甲酸丁酯)具體實(shí)施方式實(shí)施例1樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5中對(duì)羥基苯甲酸酯類濃度的檢測(cè)(其樣品處理方法和檢測(cè)條件相同)：(1)標(biāo)準(zhǔn)品處理：取500uL尿液，加入50uL標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成相當(dāng)于尿液中塑化劑各成分濃度為：5，10，25，50，100，250，500ng/ml的系列溶液。加入50uL的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，搖勻并密封，放入37℃水浴中加熱120min。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液100uL，加入300uL沉淀劑(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，渦旋混勻后，15000rpm離心10min，取上清5uL進(jìn)行樣分析。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積與尿液樣品相應(yīng)成分峰面積的差值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。(3)樣品處理：取500uL尿液，加50uL水，50uL的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，搖勻并密封，放入37℃水浴中加熱120min。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液100uL，加入300uL沉淀劑(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，渦旋混勻后，15000rpm離心10min，取上清5uL進(jìn)行樣分析。(4)檢測(cè)條件為：三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀，液相條件：流動(dòng)相：A:0.1％FA水溶液，B:乙腈；流速：0.3ml/min；進(jìn)樣量：5uL；柱溫：45℃；色譜柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn梯度洗脫程序，與表1相同質(zhì)譜條件：與表2相同其他質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管電壓(kV):3.2kV；源溫度(℃):120；脫溶劑氣溫度(℃):350；脫溶劑氣流量(L/Hr):800；氣簾氣流量(L/Hr):50；駐留時(shí)間(s)：0.1s(5)根據(jù)樣品的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程中，計(jì)算尿液中4種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑的濃度(結(jié)果見(jiàn)表4)。表4樣品1-5中4種對(duì)羥基苯甲酸酯的濃度實(shí)施例22.1方法回收率實(shí)驗(yàn)取六份供試品溶液，分別加等體積10，100,800ng/ml的各成分對(duì)照品溶液，混合均勻，配制成5，50,400ng/ml的各成分對(duì)照品溶液，進(jìn)樣，每樣本平行操作六份，計(jì)算回收率。結(jié)果詳見(jiàn)表5。表5回收率測(cè)試結(jié)果2.2方法精密度實(shí)驗(yàn)按QC樣品配制方法配制成5，50,400ng/ml的各成分溶液，進(jìn)樣，每樣本平行操作六份，考察方法的精密度。結(jié)果詳見(jiàn)表6。表6方法精密度試驗(yàn)結(jié)果2.3溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)按QC樣品配制方法配制成5，50,400ng/ml的各成分溶液，進(jìn)樣，每樣本平行操作三份，考察100％加樣溶液隨時(shí)間的變化規(guī)律。100％加樣溶液室溫放置在4小時(shí)后考察各化合物濃度的變化情況，要求：化合物的RSD應(yīng)不大于10.0％。若符合驗(yàn)證方案要求，則說(shuō)明對(duì)照品溶液在該時(shí)間段內(nèi)放置是穩(wěn)定的，為以后檢測(cè)時(shí)測(cè)試溶液放置時(shí)間的期限提供依據(jù)。結(jié)果詳見(jiàn)表7。表7穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例3最低定量限(5ng/ml)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)線(25ng/ml)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品的制備和檢測(cè)條件：(1)標(biāo)準(zhǔn)品處理：取500uL尿液，加入50uL標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成相當(dāng)于尿液中塑化劑各成分濃度為：5，10，25，50，100，250，500ng/ml的系列溶液。加入50uL的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，搖勻并密封，放入37℃水浴中加熱120min。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液100uL，加入300uL沉淀劑(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，渦旋混勻后，15000rpm離心10min，取上清5uL進(jìn)行樣分析。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積與尿液樣品相應(yīng)成分峰面積的差值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。(3)樣品處理：取500uL尿液，加50uL水，50uL的β葡糖糖苷酸酶(80U/mL)，搖勻并密封，放入37℃水浴中加熱120min。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液100uL，加入300uL沉淀劑(甲醇/乙腈＝1：1)沉淀蛋白，渦旋混勻后，15000rpm離心10min，取上清5uL進(jìn)行樣分析。(4)檢測(cè)條件為：三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀，液相條件：流動(dòng)相：A:0.1％FA水溶液，B:乙腈；流速：0.3ml/min；進(jìn)樣量：5uL；柱溫：45℃；色譜柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn梯度洗脫程序，與表1相同質(zhì)譜條件：與表2相同其他質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管電壓(kV):3.2kV；源溫度(℃):120；脫溶劑氣溫度(℃):350；脫溶劑氣流量(L/Hr):800；氣簾氣流量(L/Hr):50；駐留時(shí)間(s)：0.1s檢測(cè)結(jié)果的色譜圖分別見(jiàn)圖2和圖3。以上對(duì)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請(qǐng)范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3