本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種飼料藥物添加劑匯諾肽及其各種制品的含量檢驗(yàn)方法，具體涉及匯諾肽各種制品生物效價(jià)含量的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

匯諾肽是一種多肽類的化合物，最早由浙江匯能生物股份有限公司以那西肽為原料，通過(guò)一定化學(xué)反應(yīng)得到，CAS號(hào)為1887057-00-2。該物質(zhì)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)效果，對(duì)革蘭氏陰性菌有一定的效果，抗球蟲(chóng)效果較好，并具有一定抗病毒效果，適用范圍廣，安全性高，可廣泛用于經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的飼養(yǎng)中。

純品匯諾肽是一種黃褐色粉末，屬脂溶性物質(zhì)，其分子量為1153，分子式為C48H39N11O12S6，分子結(jié)構(gòu)參見(jiàn)下式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，采用快速直觀的HPLC測(cè)定方法，通過(guò)特殊處理，將匯諾肽制品含量結(jié)果能直接表達(dá)為生物效價(jià)含量。

本發(fā)明包括如下內(nèi)容：

匯諾肽制品生物效價(jià)含量的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法，包括待測(cè)樣品的預(yù)處理，指定的色譜條件，測(cè)定圖譜的處理分析等：

(1)用對(duì)匯諾肽有相當(dāng)脂溶性的有機(jī)溶劑和緩沖液的混合溶液對(duì)其制劑進(jìn)行提取，以便能完全提取匯諾肽，從而獲得HPLC測(cè)定所需的待測(cè)液；

(2)指定的色譜條件為：帶紫外可見(jiàn)分光檢測(cè)器的高效液相色譜儀，乙腈：水相＝50：50的流動(dòng)相；0.5mL/min～2.0mL/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱；230nm-250nm的檢測(cè)波長(zhǎng)；

(3)將測(cè)定圖譜的各個(gè)副峰的面積以面積折算系數(shù)(K)對(duì)其折算后，再用處理主峰的方法處理結(jié)果，該面積折算系數(shù)(K)為：1/2～3/4；

(4)將HPLC測(cè)定結(jié)果通過(guò)含量矯正系數(shù)(P)的平均值換算獲得生物效價(jià)含量，含量矯正系數(shù)(P)為0.970～1.050。

本發(fā)明所述的提取用的混合溶液中的有機(jī)溶劑是指N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide DMF)，緩沖液是指磷酸-磷酸鹽緩沖液。

以上(2)的所述水相為≤0.50％重量百分比的磷酸水溶液。

本發(fā)明的有益效果為：

1.本發(fā)明提供了采用有機(jī)溶劑與緩沖液的混合溶液高效提取匯諾肽，以獲得待測(cè)樣提取液的預(yù)處理方法。該處理液可用于匯諾肽制品含量測(cè)定或用于其它非測(cè)定目的。

2.本發(fā)明提供了在指定的HPLC條件下測(cè)定匯諾肽制品主成分及相關(guān)其它成分含量的方法，該方法快速實(shí)用、干擾少、測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好，是一個(gè)有效可靠的新穎測(cè)定方法。

3.本發(fā)明用HPLC測(cè)定結(jié)果在處理后可直接代表匯諾肽制品生物效價(jià)含量的方法，以及在對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行處理時(shí)采用有效而可靠的計(jì)算方法。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。

本發(fā)明涉及的匯諾肽樣品由浙江匯能生物股份有限公司提供，其他所涉及的實(shí)驗(yàn)用試劑均采購(gòu)于浙江醫(yī)藥試劑股份有限公司。

以本發(fā)明涉及的檢測(cè)儀器、條件、方法步驟如下：

①、檢驗(yàn)設(shè)備條件：

高效液相色譜儀(帶紫外可見(jiàn)分光檢測(cè)器)

流動(dòng)相：乙氰：水相(≤0.50％重量百分比的磷酸水溶液)＝50：50；

流速：0.5mL/min-2.0mL/mim。

檢測(cè)柱：反相碳十八大分子填充柱。

檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm-250nm。

②、供試液預(yù)處理：

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：

精密稱定已知匯諾肽制品含量(或已知相當(dāng)?shù)纳镄r(jià)的)的標(biāo)準(zhǔn)品于適宜的容量瓶中，加入20mL的DMF液超聲至徹底溶解，用DMF液稀釋到容量瓶滿刻度，將其制備成1000ppm的貯備液。避光低溫保存，其有效期為三個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)供試液：

上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液恢復(fù)至室溫后，準(zhǔn)確移取預(yù)先計(jì)算所需的體積數(shù)，并置于適宜的容量瓶中，加入10mL的DMF，混均勻后用甲醇液稀釋到容量瓶滿刻度，將其制備成50ppm的供試液，或配制成稀釋系列液。

用微過(guò)濾膜濾過(guò)，以備HPLC檢驗(yàn)測(cè)定用。該液應(yīng)臨用時(shí)配制，并盡可能避光。

待檢樣供試液：

精密稱定預(yù)先計(jì)算制備50ppm濃度所需要的待檢樣品的相當(dāng)質(zhì)量，置于適宜體積的容量瓶中，加入40mL的DMF液，及10mL的磷酸磷酸鹽緩沖液，將樣品充分潤(rùn)濕。室溫下用超聲或用振搖法提取，完成后用DMF液稀釋到容量瓶滿刻度，而將其制備成約50ppm的待檢樣供試液。用微過(guò)濾膜濾過(guò)，供HPLC檢驗(yàn)測(cè)定用。該液應(yīng)臨用時(shí)配制，并盡可能避光。為保證置信度，同一批號(hào)樣應(yīng)進(jìn)行三個(gè)或以上的同等處理平行樣。

③、樣品HPLC測(cè)定：

打開(kāi)HPLC儀器，按照本發(fā)明①指定的檢驗(yàn)條件進(jìn)行設(shè)定，預(yù)運(yùn)行儀器以獲得平穩(wěn)的基線。用微量注射進(jìn)樣器對(duì)標(biāo)準(zhǔn)供試液和待檢樣供試液操作進(jìn)樣，每個(gè)樣液每次進(jìn)樣20μL，以獲得相應(yīng)的色譜譜圖。

④、測(cè)定結(jié)果的計(jì)算方法：

以峰面積外標(biāo)工作曲線法或以單點(diǎn)峰面積外標(biāo)法進(jìn)行處理計(jì)算。

⑤、不同時(shí)間出峰組分在測(cè)定結(jié)果計(jì)算中的處理原則：

在處理主峰匯諾肽峰時(shí)，可直接用標(biāo)準(zhǔn)匯諾肽峰的峰面積外標(biāo)法(工作曲線法或以單點(diǎn)計(jì)算法)進(jìn)行比對(duì)計(jì)算，以求得待檢樣中匯諾肽的含量。

⑥、在得到匯諾肽的HPLC結(jié)果后，可以直接采用含量矯正系數(shù)(P)來(lái)計(jì)算得出其生物效價(jià)含量表達(dá)值。

對(duì)本發(fā)明方案的可行性分析如下：

1、待檢樣供試液對(duì)樣品中待測(cè)定成分的代表性研究：

本發(fā)明中使用的用混合液高效提取處理待測(cè)樣的方法是通過(guò)以下研究獲得的。

研究理論表明：不論采用什么方法進(jìn)行含量測(cè)定，樣品的前處理是十分重要的，要求是前處理獲得的待檢樣供試液必須能穩(wěn)定地代表樣品的待測(cè)成分的真實(shí)含量值。即處理液的回收率較大(≥95％)且能保持一定的穩(wěn)定性(RSD，CV≤2％)時(shí)，該方法才會(huì)是一個(gè)可靠的定量檢驗(yàn)方法。

由于匯諾肽的大分子結(jié)構(gòu)決定了其對(duì)提取條件有相當(dāng)?shù)拿舾行?，影響匯諾肽高效穩(wěn)定地被提取的因素有很多，如溫度、時(shí)間、pH、溶劑類型等，均會(huì)對(duì)其溶出度或者在溶出后的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。前處理過(guò)程或條件控制得不好，極易造成提取不完全或形成降解。我們用不同實(shí)際含量的預(yù)混劑，按不同條件進(jìn)行提取比較操作，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)影響因素的效率統(tǒng)計(jì)研究表明：前處理?xiàng)l件的不同會(huì)導(dǎo)致完全不同的提取液濃度情況，從而導(dǎo)致最終的檢測(cè)結(jié)果不同。只有使用了適宜的處理?xiàng)l件，才能獲得較高的回收值。

實(shí)驗(yàn)證明：

①、采用有機(jī)溶劑和緩沖溶液的混合溶液進(jìn)行處理，才能達(dá)到有效率地提取。

②、不同的有機(jī)溶劑對(duì)脂溶性匯諾肽進(jìn)行提取的效果不同。

③、采用合適的有機(jī)溶劑(DMF)與適宜的緩沖液混合提取匯諾肽，才可以獲得最高的提取值和最穩(wěn)定的提取效率。

數(shù)據(jù)研究表明：該提取方法獲得的待檢樣供試液的平均回收率值達(dá)到102.6％，滿足90％-110％的方法要求；此平均回收率的CV(％)為0.6％，明顯小于2％的方法理論規(guī)定。

2、本發(fā)明測(cè)試方法可靠性研究：

本發(fā)明中使用的方法條件組合是通過(guò)以下研究獲得的。

方法研究理論表明：檢測(cè)方法的可行性和可靠性是決定檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵。因此需要對(duì)其進(jìn)行科學(xué)的評(píng)價(jià)，下面通過(guò)方法精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍對(duì)液相色譜測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證：

①、精密度：

方法精密度是指分析結(jié)果的重復(fù)性或重現(xiàn)性。對(duì)于一個(gè)實(shí)用的定量方法，其重復(fù)性的精密度(既變異系數(shù)CV％，RSD％)必須控制在盡可能小的范圍內(nèi)，考慮到方法本身和操作因素外精密度大小還與待測(cè)物濃度有關(guān)，而一般指標(biāo)是若濃度在≥100mg/kg時(shí)，我們用理論含量為0.5％的某批號(hào)制劑樣品進(jìn)行平行性實(shí)驗(yàn)，共檢測(cè)40個(gè)平行樣。測(cè)試研究數(shù)據(jù)證明表明在本發(fā)明條件下檢測(cè)獲得的樣品測(cè)試結(jié)果的CV(％)＝0.539％，明顯小于5％的要求，說(shuō)明該方法的重復(fù)測(cè)試精密度完全達(dá)到方法理論規(guī)定。

②、準(zhǔn)確度：

方法的準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與真實(shí)值的接近程度，通常采用添加回收率來(lái)表示。作為一個(gè)可用的定量方法，回收率一般應(yīng)在80％～110％的范圍內(nèi)。而作為一個(gè)高效的定量方法，回收率應(yīng)在控制在95％～105％的范圍內(nèi)，且其回收率的精密度應(yīng)保持在2％以下。

通過(guò)對(duì)同一濃度樣品的多次重復(fù)測(cè)試及對(duì)不同真實(shí)濃度的測(cè)試數(shù)據(jù)研究表明，本方法在匯諾肽濃度從0.1％到96.0％范圍內(nèi)，其樣品平行測(cè)定結(jié)果精密度最差為0.30％，滿足≤2％的要求；不同濃度的制劑回收率保持在102％-104％的范圍內(nèi)，而各個(gè)濃度的回收率精密度最差為1.24％，滿足方法理論規(guī)定。

③、線性范圍：

方法的線性范圍表示了該方法可以應(yīng)用樣品測(cè)試的廣泛性，在此線性范圍內(nèi)的樣品使用本方法進(jìn)行測(cè)試，有線性保障。一個(gè)有效的定量分析方法的有效線性范圍，應(yīng)至少保證5個(gè)濃度的統(tǒng)計(jì)線性相關(guān)系數(shù)r≥0.995，并且應(yīng)保證不同濃度回收率的精密度RSD≤5％。

通過(guò)對(duì)匯諾肽濃度從0.1％到96.0％的范圍內(nèi)近15個(gè)不同真實(shí)濃度的匯諾肽樣品的測(cè)試數(shù)據(jù)研究表明，回收率及回收率CV保持符合方法規(guī)定要求外，其線性相關(guān)系數(shù)r＝0.999984％，滿足方法理論規(guī)定。因此認(rèn)為本方法在此范圍內(nèi)的匯諾肽制品生物效價(jià)含量的測(cè)定均適用。

3、匯諾肽HPLC含量與生物效價(jià)含量的轉(zhuǎn)換：

本發(fā)明中匯諾肽的生物效價(jià)含量用HPLC含量來(lái)轉(zhuǎn)換表達(dá)的方法是通過(guò)以下研究獲得的。

由于生物效價(jià)能更為準(zhǔn)確地反映抗菌素的綜合效果，抗生素的測(cè)定結(jié)果一般要求用生物效價(jià)含量來(lái)表達(dá)，含硫多肽類抗生素匯諾肽的最終結(jié)果可以用生物檢定法測(cè)得其生物效價(jià)含量。

匯諾肽的HPLC測(cè)定結(jié)果表達(dá)了制劑中匯諾肽和其它成分的質(zhì)量百分率。由于匯諾肽制劑抗菌效果是由制劑中匯諾肽和其它組分表達(dá)出來(lái)的能力，當(dāng)制劑中匯諾肽百分率增高時(shí)，其抗菌效果會(huì)增強(qiáng)，同時(shí)，其它組分百分率增高也會(huì)部分地增強(qiáng)其抗菌效果。

如果這重百分含量與其生物效價(jià)含量間存在固定的關(guān)聯(lián)性，即兩者的比值保持固定值，則可以通過(guò)HPLC的結(jié)果直接換算成其生物效價(jià)含量。這種關(guān)聯(lián)可以通過(guò)考察兩者的比值是否保持為一個(gè)相對(duì)固定的系數(shù)，并且此系數(shù)有高精密度而加以證明。

通過(guò)對(duì)不同濃度樣品的兩種測(cè)試方法的結(jié)果研究表明，此比值P(含量矯正系數(shù))確實(shí)存在。當(dāng)制劑濃度在0.1％-96.0％的范圍內(nèi)變化時(shí)，研究結(jié)果表明含量矯正系數(shù)(P)波動(dòng)很小，且含量矯正系數(shù)(P)的離散系數(shù)CV為0.954％，明顯小于5％的方法理論要求，這說(shuō)明匯諾肽生物效價(jià)含量可以直接用HPLC測(cè)定結(jié)果通過(guò)含量矯正系數(shù)(P)的平均值換算獲得。一般含量矯正系數(shù)(P)保持0.970-1.050的范圍內(nèi)。

本發(fā)明采用快速直觀的HPLC測(cè)定方法，通過(guò)特殊處理，將匯諾肽制品含量結(jié)果能直接表達(dá)為生物效價(jià)含量，這就大大地縮短了時(shí)間，減輕了勞動(dòng)強(qiáng)度，減少了實(shí)驗(yàn)材料的消耗，因此有較大的實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。