本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工領(lǐng)域，涉及一種甘草中甘草酸含量的檢測方法。
背景技術(shù)：
：甘草為豆科植物甘草的干燥根及根莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳、調(diào)和諸藥之功效，素有“十藥九草”、“無草不藥”之稱。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黃酮、生物堿、氨基酸等化學(xué)成分，具有廣泛的生理活性。甘草酸是甘草中最為重要的化學(xué)成分，具有消毒、消炎、抗過敏、治療潰瘍、鎮(zhèn)咳、抗腫瘤和防治病毒肝炎、高血脂癥和抗癌癥等疾病的作用，引起藥理學(xué)家和化學(xué)家的極大重視。由于甘草的銷量一直呈上升趨勢，特別是近20多年增幅更大，國內(nèi)外的需求量增大，市場走俏，誘發(fā)了對(duì)野生甘草的大量采挖，使野生資源受到嚴(yán)重破壞，甘草短缺已經(jīng)成了世界性的問題。隨著人工種植甘草面積的日益增大，甘草成品生產(chǎn)帶來的邊角料也積聚增多，為了簡便、準(zhǔn)確的確定不同產(chǎn)地的甘草的質(zhì)量，充分利用甘草資源，同時(shí)得到純度高、色澤好的甘草產(chǎn)品，提供一種檢測方法對(duì)不同產(chǎn)地的野生與栽培甘草中甘草酸的含量變化，為甘草的藥用資源和深入開發(fā)利用，提供基礎(chǔ)依據(jù)，具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：本發(fā)明的目的在于提供一種甘草中甘草酸含量的方法，本方法操作簡單，具有良好的精密度、重現(xiàn)性和可靠性，通用于測定各種不同來源的甘草藥材中的甘草酸含量，可用于甘草藥材的質(zhì)量控制。技術(shù)方案：本發(fā)明所述的甘草中甘草酸含量的檢測方法，包括：取甘草藥材，加入提取液提取后過濾，制得樣品溶液；其中所述的提取液含有甲醇、醋酸銨水溶液和冰醋酸；對(duì)所述的樣品溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測，計(jì)算分析獲得甘草藥材中甘草酸的含量；高效液相色譜檢測時(shí)，流動(dòng)相由乙腈和磷酸水溶液按體積比35～45∶55～65配制而成。所述醋酸銨水溶液的濃度為0.1～0.3mol·L-1；所述甲醇、醋酸銨水溶液和冰醋酸的體積比為60～70：30～40：1。優(yōu)選的，所述醋酸銨水溶液的濃度為0.2mol·L-1；所述甲醇、醋酸銨水溶液和冰醋酸的體積比為67∶33∶1。甘草藥材在提取前可先粉碎至粉末狀，細(xì)度一般為200～400目，以提高活性成分浸出速率。所述甘草藥材與提取液的質(zhì)量體積比(mg/ml)為1:0.5～4。所述提取為超聲提??；超聲提取的時(shí)間為20～30min，功率為80～90w。提取結(jié)束后可選擇的用提取液稀釋后進(jìn)行過濾。過濾采用0.4～0.5μm微孔濾膜進(jìn)行。高效液相色譜檢測時(shí)，色譜檢測條件為：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相由乙腈和0.010～0.050mol·L-1磷酸水溶液按體積比35～45∶55～55配制而成；流速為0.8～1.2mL·min-1；檢測波長為252±0.5nm；柱溫為25～35℃。理論板數(shù)按甘草酸單銨鹽峰計(jì)算為不低于2000(該理論板數(shù)是一個(gè)基礎(chǔ)值，低于這個(gè)值理論上該方法可信度較低)。優(yōu)選的，高效液相色譜檢測時(shí)，流動(dòng)相由乙腈和0.01mol·L-1磷酸水溶液按體積比38∶62配制而成，流速為1.0mL·min-1，檢測波長為252nm，柱溫為30℃。具體的，色譜柱可以采用Agilent(安捷倫)TC-C18。另外，檢測過程中，對(duì)照品為流動(dòng)相稀釋的甘草酸單銨鹽溶液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本方法通過高效液相色譜，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同來源甘草藥材的質(zhì)量檢測，發(fā)現(xiàn)其相互間差異較大，且野生甘草中甘草酸的含量相對(duì)要高于人工種植甘草。經(jīng)過試驗(yàn)表明，該方法簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，線性關(guān)系(甘草酸檢測濃度在0.0392-0.3528mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系)、精密度(RSD＝1.20％)、穩(wěn)定性、回收率(100.6％)、樣品分離度、對(duì)稱性及峰形均較好，且保留時(shí)間適中(一般30min以內(nèi))，更加適合于常規(guī)檢測。本方法準(zhǔn)確、簡便、快捷，能夠更有效、更全面的控制甘草藥材的質(zhì)量。本方法采用甲醇-0.1～0.3mol·L-1醋酸銨溶液-冰醋酸作提取溶劑，較之于稀乙醇、甲醇、流動(dòng)相等其他溶劑，提取效率更高更完全。本方法采用以乙腈-0.01～0.05mol·L-1磷酸溶液為流動(dòng)相，靈敏度高，重現(xiàn)性好，樣品分離度、對(duì)稱性及峰形均較好，且保留時(shí)間適中，更加適合于常規(guī)檢測。附圖說明圖1為實(shí)施例1高效液相色譜圖；其中A-對(duì)照品；B-甘草藥材(新疆阿拉山口甘草)；圖2為實(shí)施例4土庫曼斯坦甘草樣品的高效液相色譜圖；圖3為實(shí)施例5新疆喀什甘草的高效液相色譜圖；圖4為實(shí)施例7中哈薩克斯坦甘草的高效液相色譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。儀器：高效液相色譜儀，島津LC-15C。實(shí)施例1線性關(guān)系考察稱取甘草酸單銨鹽對(duì)照品約20mg，精密稱定，置于10mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為2.000mg·mL-1的甘草酸單銨鹽溶液，折合甘草酸為1.960mg·mL-1，作為對(duì)照品貯備液。再精密量取對(duì)照品貯備液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8mL，置于10mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得到含甘草酸分別為0.0392、0.1176、0.1960、0.2744、0.3528mg·mL-1的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述各對(duì)照品溶液5μL，進(jìn)行高效液相色譜檢測，色譜條件如下：色譜柱：Agilent-C18(具體型號(hào)是TC-C18)(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.01mol·L-1磷酸水溶液(體積比為38∶62)；溶劑：甲醇-0.2mol·L-1醋酸銨水溶液-冰醋酸(體積比為67∶33∶1)；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：252nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。理論板數(shù)按甘草酸單銨鹽峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。以峰面積積分值(A)對(duì)對(duì)照品濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝1.23×107C+34051.1(r＝0.9999)。結(jié)果表明，甘草酸檢測濃度在0.0392-0.3528mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。部分圖譜見圖1。實(shí)施例2精密度試驗(yàn)精密吸取濃度為0.1960mg·mL-1的對(duì)照品溶液5μL，按實(shí)施例1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值分別為：2459390、2455275、2432390、2470314、2463095、2458402。結(jié)果，RSD＝0.52％，表明儀器精密度良好。實(shí)施例3穩(wěn)定性試驗(yàn)供試品溶液的制備：取甘草藥材粉末(細(xì)度為300目)約60mg，精密稱定，置于100mL容量瓶中，加入溶劑(甲醇-0.2mol·L-1醋酸銨水溶液-冰醋酸，體積比為67∶33∶1)適量(30～40ml)，超聲(超聲功率80-90w)提取30min，靜置，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。精密量取同一供試品溶液5μL，分別在0、1、2、3、4、5、24h進(jìn)行高效液相色譜檢測，色譜條件同實(shí)施例1，測得峰面積積分值分別為：4640021、4705275、4622390、4610314、4643095、4718402，均值為4656582.8；結(jié)果，RSD＝0.96％，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。實(shí)施例4重復(fù)性試驗(yàn)稱取同一甘草樣品(土庫曼斯坦甘草)粉末約60mg，平行6份，精密稱定，按實(shí)施例3方法制備供試品溶液。精密吸取5μL，按實(shí)施例1色譜條件測定，測得峰面積積分值分別為：2362390、2407013、2399805、2357874、2341022、2360655，均值為2371459.8；結(jié)果，RSD＝1.10％，表明方法重復(fù)性較好。色譜圖見圖2。實(shí)施例5加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的甘草樣品(新疆喀什甘草)9份，每份約60mg，精密稱定，加入相應(yīng)量的對(duì)照品，按上述方法(實(shí)施例3)制備供試品溶液，按上述色譜條件(實(shí)施例1)測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1，色譜圖見圖3。表1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝9)實(shí)施例6最低檢測限測定將對(duì)照品溶液稀釋測定，色譜條件同實(shí)施例1，測得信噪比為3∶1時(shí)，甘草酸的最低檢測濃度為0.0784μg·mL-1。實(shí)施例7樣品含量測定取5個(gè)不同產(chǎn)地的甘草藥材各60mg，精密稱定，分別按上述方法制成供試品溶液，按上述方法測定甘草酸含量，結(jié)果見表2，部分圖譜見下圖4。表2不同來源甘草藥材的含量測定結(jié)果序號(hào)產(chǎn)地平均含量/％1土庫曼斯坦2.32新疆喀什2.43新疆阿拉山口4.54烏茲別克斯坦5.25哈薩克斯坦5.6實(shí)施例8以哈薩克斯坦甘草藥材為樣品，采用不同溶劑進(jìn)行提取后用高效液相色譜檢測甘草酸含量，提取方法參照實(shí)施例3，色譜條件參考實(shí)施例1。結(jié)果參見表3。表3當(dāng)前第1頁1 2 3