本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，是用一種全二維超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、茶葉以及銀杏葉進(jìn)行全二維UPLC高溫高速分析得到其全二維代謝輪廓譜的新方法。

同時(shí)，本發(fā)明公開的檢測(cè)試劑盒，是一種對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆等多種生物類樣品中的代謝物進(jìn)行全二維代謝輪廓譜分析的新技術(shù)。

背景技術(shù)：

近年來，現(xiàn)代色譜法已經(jīng)成為分析化學(xué)領(lǐng)域中復(fù)雜體系組分分析分離的重要工具之一。對(duì)于復(fù)雜樣品中各組分的分離，一種分離模式往往不能提供足夠的峰容量和色譜峰分辯率。因此，將不同模式的分離方法組合起來，構(gòu)建多維色譜分離系統(tǒng)是解決這一問題的有效途徑。自1984年多維分離的概念提出以來，隨著色譜方法的不斷完善、柱切換控制等技術(shù)的發(fā)展，多維分離技術(shù)得到了較快發(fā)展，并已在生物、化學(xué)以及環(huán)境等諸多科學(xué)領(lǐng)域得到應(yīng)用。全二維氣相色譜/質(zhì)譜技術(shù)是最先商品化的多維分離技術(shù)，其在石油、植物揮發(fā)油、血漿等樣品的分離和研究等方面已表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。相對(duì)于氣相色譜只能分析揮發(fā)性或半揮發(fā)性樣品組分來說，二維液相色譜因其可分析復(fù)雜體系組分中多種不揮發(fā)性物質(zhì)而具有更廣闊的應(yīng)用前景，在復(fù)雜體系樣品研究領(lǐng)域占有越來越重要的地位。

相對(duì)于操作復(fù)雜、程序冗繁，并且樣品組分易損失和污染的離線二維液相色譜技術(shù)，全二維在線液相色譜技術(shù)被越來越關(guān)注。隨著接口與控制技術(shù)的發(fā)展，全二維在線液相色譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵在于樣品組分在兩種分離模式之間的轉(zhuǎn)換，如何將分離機(jī)理不同而又相互獨(dú)立的兩支色譜柱串聯(lián)起來，構(gòu)成一個(gè)整體的高效分離分析系統(tǒng)成為科研工作者們的研究重點(diǎn)。一般認(rèn)為，全二維液相分離應(yīng)滿足3個(gè)條件：(a)樣品的每一個(gè)組分都將在不同模式下進(jìn)行分離；(b)所有的樣品組分都以相等的比例從第一維分離系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到第二維分離系統(tǒng)中；(c)在第一維分離系統(tǒng)中已經(jīng)得到的分辨率基本維持不變。這也同時(shí)是傳統(tǒng)的中心切割技術(shù)與全二維技術(shù)的區(qū)別。

由于全二維液相色譜通常采用兩種不同的分離機(jī)理(具有正交性)的色譜柱以分析樣品，即利用樣品組分的不同結(jié)構(gòu)特性把復(fù)雜混合物分離成單一組分，這些特性包括分子量大小、等電點(diǎn)、親水性以及特殊分子間親和作用等，在一維分離系統(tǒng)中不能分離或部分分離的組分，經(jīng)過第一維的色譜柱分離后進(jìn)入接口中，通過濃縮、捕集或定量環(huán)切割后被切換進(jìn)入第二維的色譜柱中，其可能在二維系統(tǒng)中利用不同分離原理得到更好的分離，從而使得分析方法的峰容量、分離能力和分辨率得到極大的提高。但是，由于不同分離機(jī)理的色譜柱往往使用的是不同的流動(dòng)相體系。因此，如何使一維色譜的洗脫產(chǎn)物在進(jìn)入第二維分析系統(tǒng)時(shí)，能夠具有更好的兼容性是目前的研究熱點(diǎn)之一。

基于不同的分析目的，我們可以采用不同分離機(jī)理的柱系統(tǒng)構(gòu)建全二維液相色譜分離系統(tǒng)。本發(fā)明公開了一種新的代謝物輪廓分析全二維液質(zhì)聯(lián)用方法。采用全二維超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、茶葉以及銀杏葉進(jìn)行全二維UPLC高溫高速分析得到其全二維代謝輪廓譜的新方法。同時(shí)，本發(fā)明公開的檢測(cè)試劑盒，是一種對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆等多種生物類樣品中的代謝物進(jìn)行全二維代謝輪廓譜分析的新技術(shù)。這種新方法及其檢測(cè)試劑盒，在對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、茶葉以及銀杏葉進(jìn)行全二維代謝輪廓譜分析時(shí)具有耗時(shí)短、高峰容量、高分辨率以及高靈敏度等特點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是開發(fā)一種新的代謝物輪廓分析全二維液質(zhì)聯(lián)用方法，所述的新方法可基于全二維超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、茶葉以及銀杏葉進(jìn)行全二維UPLC高溫高速分析得到其全二維代謝輪廓譜。該方法具有高靈敏度、高分辨率、高峰容量以及高通量的特點(diǎn)，適于多種生物樣本的全二維代謝輪廓譜分析。

同時(shí)，本發(fā)明亦開發(fā)了一種對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆等多種生物類樣品中的代謝物進(jìn)行全二維代謝輪廓譜分析的試劑盒。使用該試劑盒檢測(cè)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆等多種生物類樣品中全二維代謝輪廓譜的方法具有檢測(cè)成本低，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，快速高效等特點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種新的代謝物輪廓分析全二維液質(zhì)聯(lián)用方法。采用全二維超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(2D-UPLC Q-TOFMS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、茶葉以及銀杏葉進(jìn)行全二維UPLC高溫高速分析得到其全二維代謝輪廓譜。

同時(shí)，本發(fā)明公開了一種新的檢測(cè)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、茶葉以及銀杏葉中代謝物的全二維代謝輪廓譜的試劑盒，該試劑盒由二部分構(gòu)成：(1)緩沖液一第一維液相色譜使用的緩沖液為含醋酸銨、甲酸銨或碳酸氫銨的乙腈或甲醇水緩沖溶液；(2)洗脫液-乙腈或甲醇。使用該試劑盒檢測(cè)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆等多種生物類樣品全二維代謝輪廓譜的方法具有檢測(cè)成本低，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，快速高效的特點(diǎn)。

具體步驟如下，

1)采集非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、茶葉以及銀杏葉樣本若干。

2)樣品預(yù)處理：將待測(cè)樣品液氮攪拌研磨成粉，并凍干稱量，精確稱量60mg樣品于2mL離心管中，加入1.5mL 70％甲醇水超聲1小時(shí)，12000轉(zhuǎn)離心15分鐘后，用0.22μm有機(jī)濾膜過濾后直接上樣分析，預(yù)處理過程簡單快速、重復(fù)性好。

3)選取試劑盒最佳組成：第一維液相色譜緩沖液和洗脫液均選擇10mM甲酸銨乙腈水體系；也可選擇醋酸銨或碳酸氫銨和乙腈(甲醇)體系，但這些體系的分析速度較慢且各組分的分離度也較差。

4)試劑盒使用條件：色譜儀器為本實(shí)驗(yàn)室自行組裝的全二維超高效液相色譜，包括安捷倫1260自動(dòng)進(jìn)樣器、安捷倫1200、1260液相色譜泵、安捷倫1200系列DAD檢測(cè)器和柱溫箱以及VICI十通閥。第一維色譜柱為Waters ACQUITY UPLC^TM BEH Amide親和色譜柱，第二維譜柱為Agilent C₁₈反向色譜柱。第一維和第二維柱溫分別為30、60攝氏度，流速分別為0.01和0.7ml/min，質(zhì)譜儀器為安捷倫6520B四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(6520B Q-TOFMS)。

5)對(duì)各組樣本依次進(jìn)行全二維超高效液相色譜質(zhì)譜高溫高速全二維代謝輪廓譜分析。

第一維液相條件為：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC^TM BEH Amide親和色譜柱，流動(dòng)相A為含10mM甲酸氨的40％乙腈水溶液，B為含10mM甲酸氨的95％乙腈水溶液；梯度洗脫條件為：0～5min為100％B相，5～200min線性變化至0％B相，保持10min，210～210.01min升至100％B相并保持39.99min；流速0.01mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。

第二維液相條件為：色譜柱為Agilent C₁₈反向色譜柱，流動(dòng)相A為0.1％甲酸水溶液，B為乙腈；其液相分析條件分為三個(gè)階段，第一階段為0-75min，梯度洗脫條件為：初始流動(dòng)相為80％A相，0～1.5min為30％A相，1.5～1.51min升至80％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱溫60℃；第二階段為75-165min，梯度洗脫條件為：初始流動(dòng)相為95％A相，0～1.5min為60％A相，1.5～1.51min升至95％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱溫60℃；第三階段為165-200min，梯度洗脫條件為：初始流動(dòng)相為99％A相，0～1.5min為90％A相，1.5～1.51min升至99％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱溫60℃；柱后流出液經(jīng)分流后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。

閥切換流程(圖1)：經(jīng)第一維親和色譜柱分離后與流動(dòng)相共流出的代謝物直接流入十通閥的20微升定量環(huán)中，隨后在2分鐘后經(jīng)十通閥切換，被第二維液相色譜的流動(dòng)相沖入第二維反相色譜柱進(jìn)行分離，色譜流出物通過分流后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。于此同時(shí)，在第二維液相色譜進(jìn)行分析時(shí)，第一維在2分鐘后共流出的代謝物進(jìn)行十通閥的另一個(gè)20微升定量環(huán)中，隨后在下一個(gè)2分鐘后經(jīng)十通閥切換，被第二維液相色譜的流動(dòng)相沖入第二維反相色譜柱進(jìn)行分離。通過這種每隔2分鐘切換一次十通閥流路的方法，達(dá)到將第一維共流出的代謝物不停注入十通閥上的兩個(gè)定量環(huán)中，從而在每隔2分鐘的閥切換中依次進(jìn)入第二維液相色譜進(jìn)行反向色譜分析的目的。

質(zhì)譜條件為：采用電噴霧離子源正離子模式檢測(cè)；脫溶劑氣為高純氮?dú)?，流量氣?00L/h；脫溶劑氣溫度均為300℃；毛細(xì)管電壓和裂解電壓分別為3500V和130V，霧化器壓力為25psi；質(zhì)量掃描范圍為80～1200m/z；每0.97秒采集一次數(shù)據(jù)以獲得全二維代謝輪廓譜。

6)由于安捷倫Masshunter采集軟件采集得到的數(shù)據(jù)不能直觀體現(xiàn)全二維代謝輪廓譜的分離情況，因此數(shù)據(jù)需經(jīng)GC Image LCxLC Edition Software軟件轉(zhuǎn)化為直觀可視的二維圖像。

本發(fā)明方法具有的效果是：樣本的采集、儲(chǔ)存采用了標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，避免引入人為誤差；預(yù)處理過程簡單，分析過程采用高溫高速的全自動(dòng)化在線全二維液相色譜質(zhì)譜法。此方法不僅提高了對(duì)被分析物的分離分辯能力，而且大大縮短了分析時(shí)間；相比于傳統(tǒng)的液相色譜質(zhì)譜(HPLC-MS)方法，具有方法安全可靠，分析快速、高靈敏度、高峰容量以及高分辨率等特點(diǎn)，適于多種生物樣本的全二維代謝輪廓譜分析。

附圖說明

圖1閥切換流程：A-切閥前；B-切閥后。。

圖2銀杏葉全二維代謝輪廓譜。

圖3非轉(zhuǎn)基因大豆全二維代謝輪廓譜。

圖4轉(zhuǎn)基因大豆全二維代謝輪廓譜。

圖5茶葉全二維代謝輪廓譜。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、茶葉以及銀杏葉樣本收集

購買非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、花茶茶葉若干、采集新鮮銀杏樹葉若干，立即儲(chǔ)存于超低溫-80℃冰箱中，備用。

2、分析方法

2.1樣本預(yù)處理

非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、茶葉以及銀杏葉樣本從超低溫冰箱中取出后，室溫條件下解凍。液氮攪拌研磨成粉，并凍干稱量，精確稱量60mg樣品于2mL離心管中，加入1.5mL 70％甲醇水超聲1小時(shí)，12000轉(zhuǎn)離心15分鐘后，用0.22μm有機(jī)濾膜過濾后直接上樣分析。

2.2全二維超高效液相色譜質(zhì)譜高溫高速全二維代謝輪廓分析

第一維液相條件為：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC^TMBEH Amide親和色譜柱，流動(dòng)相A為含10mM甲酸氨的40％乙腈水溶液，B為含10mM甲酸氨的95％乙腈水溶液；梯度洗脫條件為：0～5min為100％B相，5～200min線性變化至0％B相，保持10min，210～210.01min升至100％B相并保持39.99min；流速0.01mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。

第二維液相條件為：色譜柱為Agi lent C₁₈反向色譜柱，流動(dòng)相A為0.1％甲酸水溶液，B為乙腈；其液相分析條件分為三個(gè)階段，第一階段為0-75min，梯度洗脫條件為：初始流動(dòng)相為80％A相，0～1.5min為30％A相，1.5～1.51min升至80％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱溫60℃；第二階段為75-165min，梯度洗脫條件為：初始流動(dòng)相為95％A相，0～1.5min為60％A相，1.5～1.51min升至95％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱溫60℃；第三階段為165-200min，梯度洗脫條件為：初始流動(dòng)相為99％A相，0～1.5min為90％A相，1.5～1.51min升至99％A相并保持0.49min；流速0.7mL/min，柱溫60℃；柱后流出液經(jīng)分流后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。

每隔2分鐘進(jìn)行一次閥切換，閥切換流程：經(jīng)第一維親和色譜柱分離后與流動(dòng)相共流出的代謝物直接流入十通閥的20微升定量環(huán)中，隨后在2分鐘后經(jīng)十通閥切換，被第二維液相色譜的流動(dòng)相沖入第二維反相色譜柱進(jìn)行分離，色譜流出物通過分流后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。于此同時(shí)，在第二維液相色譜進(jìn)行分析時(shí)，第一維在2分鐘后共流出的代謝物進(jìn)行十通閥的另一個(gè)20微升定量環(huán)中，隨后在下一個(gè)2分鐘后經(jīng)十通閥切換，被第二維液相色譜的流動(dòng)相沖入第二維反相色譜柱進(jìn)行分離。通過這種每隔2分鐘切換一次十通閥流路的方法，達(dá)到將第一維共流出的代謝物不停注入十通閥上的兩個(gè)定量環(huán)中，從而在每隔2分鐘的閥切換中依次進(jìn)入第二維液相色譜進(jìn)行反向色譜分析的目的。

質(zhì)譜條件為：采用電噴霧離子源正離子模式檢測(cè)；脫溶劑氣為高純氮?dú)?，流量氣?00L/h；脫溶劑氣溫度均為300℃；毛細(xì)管電壓和裂解電壓分別為3500V和130V，霧化器壓力為25psi；質(zhì)量掃描范圍為80～1200m/z；每0.97秒采集一次數(shù)據(jù)以獲得全二維代謝輪廓譜。

3、可視數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換

由于安捷倫Masshunter采集軟件采集得到的數(shù)據(jù)不能直觀體現(xiàn)全二維代謝輪廓譜的分離情況，因此數(shù)據(jù)需經(jīng)GC Image LCxLC Edition Software軟件轉(zhuǎn)化為直觀可視的二維圖像(圖2-5)。

本發(fā)明是基于全二維超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立的高溫高速檢測(cè)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆、茶葉以及銀杏葉全二維代謝輪廓譜的方法，本方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，具有高靈敏度、高分辨率、高通量以及高峰容量的特點(diǎn)。同時(shí)，本發(fā)明公開的檢測(cè)試劑盒，是一種對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因大豆等多種生物類樣品中的代謝物進(jìn)行全二維代謝輪廓譜分析的新技術(shù)。從圖3和4中可以看出，非轉(zhuǎn)基因大豆與轉(zhuǎn)基因大豆的全二維代謝輪廓譜具有顯著性差異。說明本發(fā)明在研究轉(zhuǎn)基因大豆方法具有一定潛力。