本發(fā)明屬于藥物的分析檢測(cè)，特別是指一種采用高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)復(fù)方金銀花顆粒中多種有效成分的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：復(fù)方中藥是中醫(yī)臨床用藥的主要形式，是中醫(yī)藥學(xué)的特色與精髓。中藥是由多成分、多因素構(gòu)成的復(fù)雜體系，其化學(xué)成分的多樣性與復(fù)雜性是其療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，建立符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的現(xiàn)代質(zhì)量控制體系，攻克中藥質(zhì)量分析與評(píng)價(jià)的難題，改進(jìn)中藥現(xiàn)有質(zhì)量控制方法已成為人們積極研究的課題。建立對(duì)中藥的質(zhì)量控制體系應(yīng)立足于中藥的特色。復(fù)方中藥的整體作用特點(diǎn)決定了中藥不同于西藥。中藥的質(zhì)量控制方法必須能對(duì)起效的全部成分(有機(jī)成分、無(wú)機(jī)成分和絡(luò)合物成分)進(jìn)行控制，只有這樣所建立的質(zhì)量控制體系才能真正達(dá)到控制中藥質(zhì)量、保證中藥用藥安全有效的目的。中藥質(zhì)量控制正從簡(jiǎn)單的單一成分含量測(cè)定轉(zhuǎn)向以先進(jìn)技術(shù)為手段，多組分、多指標(biāo)含量的測(cè)定。目前多數(shù)中藥標(biāo)準(zhǔn)還是采用光譜或色譜手段鑒別和測(cè)定某一種或幾種有效成分或指標(biāo)成分，以及藥典規(guī)定的常規(guī)檢查項(xiàng)目。對(duì)于化學(xué)藥品而言，其藥效成分為結(jié)構(gòu)明確的單一化合物，構(gòu)效關(guān)系明確，其含量和純度直接表達(dá)其有效性及安全性。然而，中醫(yī)用藥的特點(diǎn)是復(fù)方配伍，任何單一的有效或活性成分的含量高低均不能表達(dá)其整體的療效。因?yàn)橛行е笜?biāo)成份的含量高低，可以體現(xiàn)其從相應(yīng)藥材中的轉(zhuǎn)移率，通常情況下轉(zhuǎn)移率越高，說(shuō)明工藝提取和精制水平越高，有效指標(biāo)成分損失越少，相應(yīng)的療效越好?？梢?jiàn)藥物中有效指標(biāo)成分的含量測(cè)定，應(yīng)用在工作生產(chǎn)的質(zhì)量控制上，用于監(jiān)控工業(yè)生產(chǎn)水平高低具有非常有意義。因此測(cè)定的有效指標(biāo)成分越多，一是能夠直觀反映制劑中各類有效成份的含量水平高低；二是能夠體現(xiàn)工藝水平的高低；三是能夠有效判定制劑的質(zhì)量水平和療效高低。鑒于復(fù)方中藥制劑中藥效的發(fā)揮是多組分共同作用的結(jié)果，所以“多標(biāo)多測(cè)”更能夠全面評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量，也更加科學(xué)。復(fù)方金銀花顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第10冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為“WS3-B-1985-95”，處方藥材為金銀花、連翹、黃芩，功能主治為清熱解毒、涼血消腫的功效，用于風(fēng)熱感冒，咽炎，扁桃體炎，目痛，牙痛及癰腫瘡癤等癥。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅收載了顯色反應(yīng)鑒別和TLC鑒別，沒(méi)有含量測(cè)定，也就是說(shuō)原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)未有任何定量數(shù)據(jù)作為評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量的指標(biāo)。申請(qǐng)人查詢近年來(lái)的復(fù)方金銀花顆粒的相關(guān)含量檢測(cè)的文獻(xiàn)，基本為三味藥材的單一含量檢測(cè)。有的收載一味藥材的含量檢測(cè)，如《中國(guó)藥學(xué)雜志》(作者：汪洪武；劉艷清)的HPLC測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中綠原酸與黃芩苷含量；有的收載二味或者三味藥材的含量檢測(cè)，如《中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志》(作者：朱艷琴；殷勤紅)的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方金銀花顆粒中3種活性成分，基本上都是針對(duì)金銀花中的指標(biāo)成分綠原酸、連翹中的指標(biāo)成分連翹苷、黃芩中的指標(biāo)成分黃芩苷進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)三味藥材中每一味藥材的多指標(biāo)質(zhì)量控制的相關(guān)非專利文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。目前有關(guān)復(fù)方金銀花顆粒檢驗(yàn)方法的專利文獻(xiàn)報(bào)道較少，相關(guān)專利多集中在金銀花藥材的檢驗(yàn)上，如：公開(kāi)號(hào)CN104297374A的專利文獻(xiàn)中公告了一種金銀花的質(zhì)量檢測(cè)方法，其主要技術(shù)解決方案是：采用梯度洗脫程序?qū)ζ浠钚猿煞诌M(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明建立的金銀花檢測(cè)方法對(duì)其大部分藥理活性物質(zhì)進(jìn)行了有效表征，實(shí)現(xiàn)了對(duì)其化學(xué)成分的較全面表征，避免了只測(cè)定其中幾個(gè)化學(xué)成分就對(duì)金銀花整體質(zhì)量判斷的片面性，各有效成分的峰分離性好，主要活性成分的峰在35分鐘內(nèi)出峰，檢測(cè)時(shí)間合理，并且重復(fù)性和穩(wěn)定性好。公開(kāi)號(hào)CN103820530A的專利文獻(xiàn)中公告了一種金銀花的質(zhì)量檢測(cè)方法，其主要技術(shù)解決方案是：一種金銀花檢測(cè)用引物，能擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的特異堿基，所述目標(biāo)核酸序列為葉綠體序列trnL-trnF。所述引物與所述目標(biāo)核酸序列的582-661位核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。本發(fā)明通過(guò)提供一種對(duì)金銀花特定位點(diǎn)具有特異性的引物組，及其用含有上述引物組的試劑盒檢測(cè)樣本中是否存在金銀花特定位點(diǎn)，進(jìn)而確定樣本中是否存在正品金銀花。以上專利文獻(xiàn)資料多集中在金銀花藥材的檢驗(yàn)上，對(duì)于復(fù)方金銀花顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)現(xiàn)多是單組分的含量測(cè)定。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)方金銀花顆粒的檢測(cè)方法，該方法能夠較為全面地分析藥物活性組分及其含量，從而表征和控制其內(nèi)在質(zhì)量。本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是：復(fù)方金銀花顆粒的檢測(cè)方法，使用高效液相色譜法對(duì)復(fù)方金銀花顆粒中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、松脂素、黃芩苷、漢黃芩素同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)；包括如下工藝步驟：A、對(duì)照品溶液的制備取綠原酸、連翹苷、黃芩苷對(duì)照品，加質(zhì)量百分比為50％甲醇分別制成每1ml含綠原酸50μg、連翹苷20μg、黃芩苷0.25mg的溶液；B、供試品溶液的制備取復(fù)方金銀花顆粒2g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐瓶中，加入質(zhì)量百分比為50％甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用質(zhì)量百分比為50％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得；C、測(cè)定精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl注入高效液相色譜儀，根據(jù)以下色譜條件進(jìn)行測(cè)定；色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，0.4％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；所述梯度洗脫程序如下，其中流動(dòng)相比例均為體積百分比；0-10分鐘，流動(dòng)相A為8％，流動(dòng)相B為92％；10-25分鐘，流動(dòng)相A為8％-10％，流動(dòng)相B為92％-90％；25-40分鐘，流動(dòng)相A為10％-19％，流動(dòng)相B為90％-81％；40-55分鐘，流動(dòng)相A為19％-29％，流動(dòng)相B為81％-77％；55-60分鐘，流動(dòng)相A為29％，流動(dòng)相B為71％；60-65分鐘，流動(dòng)相A為29％-60％，流動(dòng)相B為71％-40％；65-75分鐘，流動(dòng)相A為60％，流動(dòng)相B為40％；75-80分鐘，流動(dòng)相A為60％-70％，流動(dòng)相B為40％-30％；80-85分鐘，流動(dòng)相A為70％-8％，流動(dòng)相B為30％-92％；所述高效液相色譜法的條件還包括：流速為1.0ml/min，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)為326nm，連翹酯苷A、連翹苷、松脂素、黃芩苷、漢黃芩素檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm，理論塔板數(shù)按黃芩苷計(jì)，不得低于60000。D、結(jié)果計(jì)算參照《中國(guó)藥典》2015年版四部(通則0512)高效液相色譜方法進(jìn)行。D1、金銀花中有效成分計(jì)算以綠原酸對(duì)照品為參照，以其相應(yīng)的峰為S1峰，計(jì)算新綠原酸、隱綠原酸的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5％范圍內(nèi)，相對(duì)保留時(shí)間及校正因子如下：新綠原酸：相對(duì)保留時(shí)間0.51，校正因子1.19；綠原酸：相對(duì)保留時(shí)間1，校正因子1；隱綠原酸：相對(duì)保留時(shí)間1.18，校正因子1.22；以綠原酸的峰面積為對(duì)照，分別乘以校正因子，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量；D2、連翹中有效成分計(jì)算以連翹苷對(duì)照品為參照，以其相應(yīng)的峰為S2峰，計(jì)算連翹酯苷A、松脂素的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5％范圍內(nèi)，相對(duì)保留時(shí)間及校正因子如下：連翹酯苷A：相對(duì)保留時(shí)間0.80，校正因子0.78；松脂素：相對(duì)保留時(shí)間0.84，校正因子1.02；連翹苷：相對(duì)保留時(shí)間1，校正因子1；以連翹苷的峰面積為對(duì)照，分別乘以校正因子，計(jì)算連翹酯苷A、松脂素、連翹苷的含量；D3、黃芩中有效成分計(jì)算以黃芩苷對(duì)照品為參照，以其相應(yīng)的峰為S3峰，計(jì)算漢黃芩素的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5％范圍內(nèi)，相對(duì)保留時(shí)間及校正因子如下：黃芩苷：相對(duì)保留時(shí)間1，校正因子1；漢黃芩素：相對(duì)保留時(shí)間1.28，校正因子0.59；以黃芩苷的峰面積為對(duì)照，分別乘以校正因子，計(jì)算黃芩苷、漢黃芩素的含量。測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液10μl與供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定。申請(qǐng)人需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中所涉及的校正因子概念來(lái)源于中國(guó)藥典，在《中國(guó)藥典》2015年版四部，校正因子收載在“通則0512高效液相色譜法”的測(cè)定法中，其實(shí)質(zhì)是同一色譜系統(tǒng)中的兩種不同物質(zhì)，其峰面積和質(zhì)量的比值是呈一定系數(shù)關(guān)系的，這個(gè)系數(shù)就是校正因子。本發(fā)明中引用的校正因子類似于測(cè)定法中的內(nèi)標(biāo)法中的校正因子。優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的步驟B中超聲處理的條件為功率250w，頻率35kHz。優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的步驟B中色譜柱型號(hào)為華譜unitaryC18，色譜柱柱長(zhǎng)為250mm，內(nèi)徑為4.6mm。本發(fā)明采用多指標(biāo)質(zhì)量控制的“多標(biāo)多測(cè)”方法對(duì)復(fù)方金銀花顆粒中金銀花的有機(jī)酸類、連翹的木脂素類、黃芩的黃酮類成份進(jìn)行全面的控制，通過(guò)對(duì)一個(gè)易得對(duì)照品成分的測(cè)定，實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步監(jiān)控，尤其是可以從根本上改善目前中國(guó)藥品生物制品檢定所尚無(wú)新綠原酸、隱綠原酸、松脂素等對(duì)照品供應(yīng)的現(xiàn)狀。金銀花中的有機(jī)酸類成份具有抗血小板聚集作用、對(duì)過(guò)氧化內(nèi)皮細(xì)胞具有抗損傷作用，其中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸是其中的典型代表成份；連翹的木脂素類成份具有抗菌抗病毒、降血脂、降氧化作用，其中連翹酯苷A、連翹苷、松脂素是此類別的典型代表成份；黃芩的黃酮類成份具有抗炎、抗病毒以及解熱和保肝作用，其中黃芩苷、漢黃芩素是此類別的典型代表成份；以上活性成份藥理作用顯著，研究比較充分，通過(guò)“多標(biāo)多測(cè)”方法對(duì)以上八種成份的定量測(cè)定，基本能夠全面評(píng)價(jià)復(fù)方金銀花的產(chǎn)品質(zhì)量。申請(qǐng)人通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)選擇本發(fā)明中工藝條件：1、提取方法的選擇取本品適量，研細(xì)、稱取2份，分別置具塞錐瓶中，精密加入50％甲醇25ml，稱定重量，一份超聲30分鐘、另一份回流30分鐘，樣品分別處理后按照上述提取方法檢測(cè)，綜合8個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果，兩種方法無(wú)明顯區(qū)別，故選取較簡(jiǎn)單的超聲提取作為本方案的提取方法。2、提取溶劑的選擇取本品適量，研細(xì)、稱取4份，分別置具塞錐瓶中，加入20％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、甲醇25ml，稱定重量，超聲提取30min處理該溶液后測(cè)定其含量，綜合8個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，50％甲醇含量較高，故選擇50％甲醇方便操作。3、提取時(shí)間的選擇取本品適量，研細(xì)、稱取3份，分別置具塞錐瓶中，精密加入50％甲醇25ml，稱定重量，分別超聲(功率250w，頻率35kHz)提取15min、30min、45min。相應(yīng)處理后，檢測(cè)結(jié)果為超聲30min含量較高，增加提取時(shí)間含量無(wú)明顯變化，超聲提取30min操作方便、提取完全，確定選擇提取時(shí)間為30min。4、校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的測(cè)定檢測(cè)方法中的“校正因子”的計(jì)算公式為：Fsi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)，式中Fsi為其它組分的校正因子，As為參照物峰面積，Ai為其他組分峰面積，Cs參照物濃度，Ci為其他組分濃度。校正因子的來(lái)源是用混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算而得。以精密度結(jié)果計(jì)算校正因子和相對(duì)保留時(shí)間，RSD均小于5.0％，說(shuō)明本方法校正因子穩(wěn)定。檢測(cè)方法中的“相對(duì)保留時(shí)間”的計(jì)算公式為：Tsi＝Ti/Ts，式中Tsi為其它組分的相對(duì)保留時(shí)間，Ts為參照物保留時(shí)間，Ti為其他組分保留時(shí)間。相對(duì)保留時(shí)間的來(lái)源同上述校正因子來(lái)源一致，是用混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算而得。以精密度結(jié)果計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，RSD均小于5.0％，說(shuō)明本方法相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定。5、不同流速對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的影響精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，以流速為0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算校正因子和相對(duì)保留時(shí)間，RSD均小于5.0％，檢測(cè)結(jié)果表明，流速對(duì)校正因子無(wú)明顯影響，流速對(duì)新綠原酸的相對(duì)保留時(shí)間有一定影響，故規(guī)定流速為1.0ml/min。6、不同柱溫對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的影響精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，以柱溫20℃、30℃、40℃分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算校正因子和相對(duì)保留時(shí)間，RSD均小于5.0％，檢測(cè)結(jié)果表明，不同柱溫對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間無(wú)影響。7、不同時(shí)間對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的影響精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，以不同時(shí)間分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算校正因子和相對(duì)保留時(shí)間，考察穩(wěn)定性，RSD均小于5.0％，檢測(cè)結(jié)果表明，不同時(shí)間對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間無(wú)影響。8、不同色譜柱對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的影響精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，使用不同色譜柱分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算校正因子和相對(duì)保留時(shí)間，RSD均小于5.0％，檢測(cè)結(jié)果表明，不同色譜柱對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間無(wú)影響。9、不同儀器對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的影響精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，使用不同儀器分別進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算校正因子和相對(duì)保留時(shí)間，RSD均小于5.0％，檢測(cè)結(jié)果表明，不同儀器對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間無(wú)影響。申請(qǐng)人采用如下方法對(duì)本申請(qǐng)中的檢測(cè)方法及結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證：一、線性關(guān)系及線性范圍的研究(一)對(duì)照品溶液的制備：混合對(duì)照①：新綠原酸對(duì)照品：8.065mg→25ml，取5ml→100ml；綠原酸對(duì)照品：5.270mg→100ml；隱綠原酸對(duì)照品：5.430mg→10ml，取5ml→100ml；連翹酯苷A對(duì)照品：3.566mg→10ml，取5ml→100ml；(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖對(duì)照品：3.292mg→100ml；連翹苷對(duì)照品：4.440mg→10ml，取5ml→100ml；漢黃芩素對(duì)照品：4.269mg→100ml，取3ml→100ml；混合對(duì)照②：取混合對(duì)照①1ml→10ml，即得；黃芩苷對(duì)照品①：3.177mg→10ml；黃芩苷對(duì)照品②：取黃芩苷對(duì)照品①1ml→10ml；(二)精密吸取上述對(duì)照品溶液，按下表進(jìn)樣量分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，得到綠原酸、連翹苷、黃芩苷的線性范圍，結(jié)果如下：表1綠原酸、連翹苷線性關(guān)系考察綠原酸：以峰面積A對(duì)質(zhì)量數(shù)(μg)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得線性回歸方程為：y＝21391.3282x+100.2784，r＝0.9996。結(jié)果見(jiàn)圖1，說(shuō)明綠原酸在0.0051μg-1.5209μg線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。連翹苷：以峰面積A對(duì)質(zhì)量數(shù)(μg)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得線性回歸方程為：y＝10697.8455x-12.2462，r＝0.9999。結(jié)果見(jiàn)圖2，說(shuō)明連翹苷在0.0021μg-0.6347μg線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。表2黃芩苷線性關(guān)系考察黃芩苷：以峰面積A對(duì)質(zhì)量數(shù)(μg)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得線性回歸方程為：y＝56340.1881x+1602.8809，r＝0.9998。結(jié)果見(jiàn)圖3，說(shuō)明黃芩苷在0.1077μg-8.0779μg線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。以綠原酸、連翹苷、黃芩苷為S峰，其余5個(gè)成分的實(shí)際保留時(shí)間均在以S峰與相對(duì)保留時(shí)間所計(jì)算的時(shí)間范圍內(nèi)，計(jì)算不同濃度時(shí)校正因子的偏差，應(yīng)在校正因子的±5％以內(nèi)。結(jié)果見(jiàn)表3-5不同濃度時(shí)校正因子的偏差。表3不同濃度時(shí)校正因子的偏差(金銀花)表4不同濃度時(shí)校正因子的偏差(連翹)進(jìn)樣量連翹酯苷A(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷連翹苷混和對(duì)照②1μl0.7511.0261混和對(duì)照②2μl0.7561.0691混和對(duì)照②5μl0.7791.0521混和對(duì)照②10μl0.7461.0391混和對(duì)照①2μl0.7421.0491混和對(duì)照①5μl0.7441.0451混和對(duì)照①10μl0.7451.0461混和對(duì)照①15μl0.7451.0481混和對(duì)照①20μl0.7451.0471混和對(duì)照①25μl0.7441.0471混和對(duì)照①30μl0.7461.0511校正因子±5％范圍0.741-0.8190.969-1.071-表5不同濃度時(shí)校正因子的偏差(黃芩)(三)結(jié)果表明：隱綠原酸、連翹酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和漢黃芩素在不同進(jìn)樣體積和不同濃度時(shí)所計(jì)算的校正因子均能達(dá)到要求，故可通過(guò)以確定的校正因子計(jì)算出隱綠原酸、連翹酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和漢黃芩素的線性范圍。通過(guò)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間計(jì)算可知：隱綠原酸在0.0027μg-0.7955μg線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。連翹酯苷A在0.0017μg-0.5247μg線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷在0.0032μg-0.9496μg線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。漢黃芩素在0.0005μg-0.0366μg線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。新綠原酸在進(jìn)樣體積為25μl和30μl時(shí)校正因子較高，超過(guò)了校正因子的±5％，故舍掉這兩個(gè)高濃度點(diǎn)后通過(guò)校正因子計(jì)算出新綠原酸的線性范圍。新綠原酸結(jié)果見(jiàn)下：新綠原酸在0.0017μg-0.3071μg線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。經(jīng)對(duì)照品驗(yàn)證，本發(fā)明公開(kāi)的檢測(cè)方法線性良好。二、重復(fù)性取第一條第(一)項(xiàng)下對(duì)照品溶液為對(duì)照品溶液，取復(fù)方金銀花顆粒樣品(規(guī)格：每袋裝10g(相當(dāng)于總藥材3.5g)，批號(hào)：3411132，河北國(guó)金藥業(yè)有限責(zé)任公司)，按擬定含量測(cè)定方法，重復(fù)測(cè)定6次，以綠原酸、連翹苷、黃芩苷為S峰，其余5個(gè)成分的實(shí)際保留時(shí)間均在以S峰與相對(duì)保留時(shí)間所計(jì)算的時(shí)間范圍內(nèi)，故可通過(guò)校正因子計(jì)算出新綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和漢黃芩素的含量，結(jié)果見(jiàn)表6。表6根據(jù)校正因子計(jì)算重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明：通過(guò)應(yīng)用該檢測(cè)方法，對(duì)復(fù)方金銀花顆粒的多組分的含量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn)，各檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2％，說(shuō)明該檢測(cè)方法重復(fù)性良好。三、準(zhǔn)確度采用加樣回收率試驗(yàn)法。取第一條第(一)項(xiàng)下對(duì)照品溶液為對(duì)照品溶液，取已知含量的樣品(批號(hào)：3411132，平均含量：含新綠原酸1.306mg/袋、綠原酸5.767mg/袋、隱綠原酸1.815mg/袋、連翹酯苷A1.292mg/袋、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷0.907mg/袋、連翹苷2.922mg/袋、黃芩苷42.360mg/袋、漢黃芩素0.126mg/袋)6份，每份1g，置具塞錐瓶中，精密加入1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備項(xiàng)下混合溶液10ml，再精密加入1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備項(xiàng)下黃芩對(duì)照品溶液15ml，稱定重量，自“超聲處理……”起按檢驗(yàn)方案(一)中制備供試品溶液。以綠原酸、連翹苷、黃芩苷為S峰，其余5個(gè)成分的實(shí)際保留時(shí)間均在以S峰與相對(duì)保留時(shí)間所計(jì)算的時(shí)間范圍內(nèi)，故可通過(guò)校正因子計(jì)算出新綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和漢黃芩素的回收率，并與實(shí)測(cè)值相比，結(jié)果見(jiàn)表7：表7根據(jù)校正因子計(jì)算回收率試驗(yàn)本發(fā)明所載的方法，校正因子經(jīng)過(guò)實(shí)測(cè)值和計(jì)算值的比較，和加樣回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)比，說(shuō)明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高。四、限度的確定按擬完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)本次樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，8個(gè)成分全部檢出，本發(fā)明擬定取中位數(shù)的80％作為含量測(cè)定的限度，每袋含金銀花以新綠原酸(C16H18O9)、綠原酸(C16H18O9)和隱綠原酸(C16H18O9)的總量計(jì)，不得少于5.0mg/袋；含連翹以連翹酯苷A(C29H36O15)、連翹苷(C27H34O11)和(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷計(jì)(C26H32O11)的總量計(jì)，不得少于4.0mg/袋；含黃芩以黃芩苷(C21H18O11)、漢黃芩素(C16H12O5)的總量計(jì)，不得少于9.0mg/袋。五、方法驗(yàn)證(一)樣品來(lái)源“多標(biāo)多測(cè)”方法學(xué)驗(yàn)證，測(cè)定樣品應(yīng)≥30批，把我公司樣品30批進(jìn)行多標(biāo)多測(cè)測(cè)定。(二)樣品測(cè)定以擬定方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，以綠原酸、連翹苷、黃芩苷為S峰，其余5個(gè)成分的實(shí)際保留時(shí)間均在以S峰與相對(duì)保留時(shí)間所計(jì)算的時(shí)間范圍內(nèi)，故可通過(guò)校正因子計(jì)算出新綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和漢黃芩素的含量，得到結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié)果作比較，RSD應(yīng)小于5.0％，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8-10。表830批樣品測(cè)定結(jié)果(金銀花)表930批樣品測(cè)定結(jié)果(連翹)表1030批樣品測(cè)定結(jié)果(黃芩)結(jié)果表明：30批樣品的實(shí)測(cè)結(jié)果與通過(guò)校正因子所計(jì)算的結(jié)果相差不大，偏差均在5.0％以內(nèi)，結(jié)果可信。典型圖譜見(jiàn)圖4-7，其中圖4、圖5為對(duì)照品溶液圖譜，圖6、圖7為供試品溶液圖譜。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的試驗(yàn)驗(yàn)證，證明該發(fā)明中的方法準(zhǔn)確、可靠，可以作為評(píng)價(jià)復(fù)方金銀花顆粒質(zhì)量情況的檢驗(yàn)方法，是一種準(zhǔn)確穩(wěn)定可靠的檢驗(yàn)途徑。本發(fā)明所取得的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的技術(shù)進(jìn)步在于：1、申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)大量科學(xué)實(shí)驗(yàn)后證實(shí)，只有采用本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)所得到的切實(shí)可行的、特定的色譜條件，才能得到復(fù)方金銀花顆粒中的有效成分的特征峰，從而實(shí)現(xiàn)了特征峰的有效分離。2、本發(fā)明能夠?qū)?fù)方金銀花顆粒中的主要有效成分新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、松脂素、連翹苷、黃芩苷、漢黃芩素進(jìn)行含量檢測(cè)，從而盡可能實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)方金銀花顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，便于定量評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量，有利于對(duì)其質(zhì)量的全方面監(jiān)控，以使復(fù)方金銀花顆粒的質(zhì)量控制方法更加完善。3、通過(guò)校正因子的科學(xué)校正，采用三個(gè)對(duì)照品就可以實(shí)現(xiàn)復(fù)方金銀花顆粒所含8種成分的測(cè)定，降低了中藥對(duì)照品的采購(gòu)成本。4、本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握的特點(diǎn)。在同一測(cè)試條件下，使用一種流動(dòng)相體系實(shí)現(xiàn)了對(duì)8種成分的分離和定量檢測(cè)，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間、流動(dòng)相，可以實(shí)現(xiàn)相對(duì)節(jié)約資源、綠色環(huán)保的良好效果，從根本上改善目前新綠原酸、隱綠原酸、松脂素等對(duì)照品缺乏的現(xiàn)狀。附圖說(shuō)明圖1是采用本發(fā)明的方法所得到的綠原酸線性圖。圖2是采用本發(fā)明的方法所得到的連翹苷線性圖。圖3是采用本發(fā)明的方法所得到的黃芩苷線性圖。圖4是波長(zhǎng)326nm檢測(cè)綠原酸、連翹苷、黃芩苷的混合對(duì)照?qǐng)D譜。圖5是波長(zhǎng)278nm檢測(cè)綠原酸、連翹苷、黃芩苷的混合對(duì)照?qǐng)D譜。圖6是申請(qǐng)人的樣品圖譜1。圖6中是波長(zhǎng)為326nm下檢測(cè)新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的圖譜。圖7是申請(qǐng)人的樣品圖譜2。圖7中是波長(zhǎng)278nm檢測(cè)連翹酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹苷、黃芩苷和漢黃芩素的圖譜。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)，任何依據(jù)說(shuō)明書所做出的等效技術(shù)手段替換，均不脫離本發(fā)明的保護(hù)范圍。復(fù)方金銀花顆粒的檢測(cè)方法，使用高效液相色譜法對(duì)復(fù)方金銀花顆粒中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、松脂素、黃芩苷、漢黃芩素同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)；包括如下工藝步驟：A、對(duì)照品溶液的制備取綠原酸、連翹苷、黃芩苷對(duì)照品，加質(zhì)量百分比為50％甲醇分別制成每1ml含綠原酸50μg、連翹苷20μg、黃芩苷0.25mg的溶液；B、供試品溶液的制備取復(fù)方金銀花顆粒2g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐瓶中，加入質(zhì)量百分比為50％甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用質(zhì)量百分比為50％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得；C、測(cè)定精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl注入高效液相色譜儀，根據(jù)以下色譜條件進(jìn)行測(cè)定；色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，0.4％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；所述梯度洗脫程序如下，其中流動(dòng)相比例均為體積百分比；0-10分鐘，流動(dòng)相A為8％，流動(dòng)相B為92％；10-25分鐘，流動(dòng)相A為8％-10％，流動(dòng)相B為92％-90％；25-40分鐘，流動(dòng)相A為10％-19％，流動(dòng)相B為90％-81％；40-55分鐘，流動(dòng)相A為19％-29％，流動(dòng)相B為81％-77％；55-60分鐘，流動(dòng)相A為29％，流動(dòng)相B為71％；60-65分鐘，流動(dòng)相A為29％-60％，流動(dòng)相B為71％-40％；65-75分鐘，流動(dòng)相A為60％，流動(dòng)相B為40％；75-80分鐘，流動(dòng)相A為60％-70％，流動(dòng)相B為40％-30％；80-85分鐘，流動(dòng)相A為70％-8％，流動(dòng)相B為30％-92％；所述高效液相色譜法的條件還包括：流速為1.0ml/min；新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)為326nm，連翹酯苷A、連翹苷、松脂素、黃芩苷、漢黃芩素檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm，理論塔板數(shù)按黃芩苷計(jì)，不得低于60000。D、結(jié)果計(jì)算參照《中國(guó)藥典》2015年版四部(通則0512)高效液相色譜方法進(jìn)行。D1、金銀花中有效成分計(jì)算以綠原酸對(duì)照品為參照，以其相應(yīng)的峰為S1峰，計(jì)算新綠原酸、隱綠原酸的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5％范圍內(nèi)，相對(duì)保留時(shí)間及校正因子如下：新綠原酸：相對(duì)保留時(shí)間0.51，校正因子1.19；綠原酸：相對(duì)保留時(shí)間1，校正因子1；隱綠原酸：相對(duì)保留時(shí)間1.18，校正因子1.22；以綠原酸的峰面積為對(duì)照，分別乘以校正因子，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量；D2、連翹中有效成分計(jì)算以連翹苷對(duì)照品為參照，以其相應(yīng)的峰為S2峰，計(jì)算連翹酯苷A、松脂素的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5％范圍內(nèi)，相對(duì)保留時(shí)間及校正因子如下：連翹酯苷A：相對(duì)保留時(shí)間0.80，校正因子0.78；松脂素：相對(duì)保留時(shí)間0.84，校正因子1.02；連翹苷：相對(duì)保留時(shí)間1，校正因子1；以連翹苷的峰面積為對(duì)照，分別乘以校正因子，計(jì)算連翹酯苷A、松脂素、連翹苷的含量。D3、黃芩中有效成分計(jì)算以黃芩苷對(duì)照品為參照，以其相應(yīng)的峰為S3峰，計(jì)算漢黃芩素的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5％范圍內(nèi)。相對(duì)保留時(shí)間及校正因子如下：黃芩苷：相對(duì)保留時(shí)間1，校正因子1；漢黃芩素：相對(duì)保留時(shí)間1.28，校正因子0.59；以黃芩苷的峰面積為對(duì)照，分別乘以校正因子，計(jì)算黃芩苷、漢黃芩素的含量。測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液10μl與供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定。本實(shí)施例中所涉及的校正因子概念來(lái)源于中國(guó)藥典，在《中國(guó)藥典》2015年版四部，校正因子收載在“通則0512高效液相色譜法”的測(cè)定法中，其實(shí)質(zhì)是同一色譜系統(tǒng)中的兩種不同物質(zhì)，其峰面積和質(zhì)量的比值是成一定系數(shù)關(guān)系的，這個(gè)系數(shù)就是校正因子。本實(shí)施例中引用的校正因子類似于測(cè)定法中的內(nèi)標(biāo)法中的校正因子。所述的步驟B中超聲處理的條件為功率250w，頻率35kHz。所述的步驟B中色譜柱型為華譜unitaryC18，色譜柱柱長(zhǎng)為250mm，內(nèi)徑為4.6mm。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3