本發(fā)明涉及一種用菁染料可視化識別轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，Tf)是一種單鏈糖基化β-球蛋白，是細(xì)胞生長和增殖所必需的血清糖蛋白，由670-700個氨基酸組成，分子量約80kDa。轉(zhuǎn)鐵蛋白的C端及N端分別含有一個鐵結(jié)合位點，F(xiàn)e³⁺的吸收和釋放的過程等同于蛋白構(gòu)象開放與閉合的過程。按含鐵數(shù)目，轉(zhuǎn)鐵蛋白包括：單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白和雙鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白的構(gòu)象是發(fā)揮其生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其特定構(gòu)象的識別研究對于探究轉(zhuǎn)鐵蛋白的功能具有非常重要的研究價值。轉(zhuǎn)鐵蛋白及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在藥物運輸和臨床上已得到越來越多的應(yīng)用，并引起廣泛的關(guān)注，由于富集于腫瘤細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體只能識別閉合構(gòu)象的含鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白的特異性識別問題則成為其在藥物靶向治療方面的重要因素。目前文獻報道的研究轉(zhuǎn)鐵蛋白構(gòu)象問題的方法主要以研究轉(zhuǎn)鐵蛋白本身的核磁共振、熒光光譜、圓二色譜和吸收光譜的變化為主。然而這些方法并不能簡便直觀地分辨某種構(gòu)象的轉(zhuǎn)鐵蛋白，所以開發(fā)一種操作簡單、可視化的檢測特定轉(zhuǎn)鐵蛋白的新方法十分具有意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是如何利用菁染料的顏色變化及吸收光譜的變化，實現(xiàn)對不同構(gòu)象轉(zhuǎn)鐵蛋白的識別。

根據(jù)本發(fā)明所述的用菁染料可視化識別轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，其中所述的菁染料為式I的化合物：

菁染料在無金屬離子存在下其聚集形式受溫度和pH的影響，但在一定溫度和pH范圍內(nèi)特定生物大分子對菁染料聚集體的誘導(dǎo)調(diào)控方式不會出現(xiàn)太大改變，能夠通過菁染料的聚集狀態(tài)反映生物大分子的結(jié)構(gòu)特征。單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的特殊構(gòu)象(只有一端結(jié)構(gòu)域處于開放狀態(tài))對菁染料超分子具有誘導(dǎo)調(diào)控作用，當(dāng)菁染料中加入一定濃度的單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白，菁染料J-聚集體(藍(lán)色)隨著蛋白濃度增加逐漸轉(zhuǎn)化為H-聚集體(粉色)，J-聚集體的解聚及H-聚集體的形成可作為菁染料可視化識別具有特殊構(gòu)象的單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的特征信號；具有完全開放構(gòu)象的脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白僅誘導(dǎo)菁染料形成J-聚集體(藍(lán)色)且不易解聚，這一點可作為菁染料識別脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的特征信號；具有完全閉合構(gòu)象的雙鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白可以誘導(dǎo)菁染料H-聚集體(粉色)與J聚集體同時存在(粉藍(lán)色)，并且在樣品表觀顏色上用裸眼不易區(qū)分，因此通過溶液樣品比色可直接判斷識別轉(zhuǎn)鐵蛋白的種類及構(gòu)象。

通過吸收光譜表征了菁染料在不同轉(zhuǎn)鐵蛋白存在下的響應(yīng)信號，吸收光譜轉(zhuǎn)化信號與樣品溶液的聚集狀態(tài)顏色變化相一致，見附圖1，2和3，并且轉(zhuǎn)鐵蛋白在菁染料出現(xiàn)吸收峰的波段沒有吸收信號不會對聚集體的吸收峰造成干擾，說明通過比色方法可以直接實現(xiàn)可視化識別不同構(gòu)象的轉(zhuǎn)鐵蛋白。

具體技術(shù)方案如下：

一種用菁染料可視化識別轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，其特征在于菁染料與不同構(gòu)象的轉(zhuǎn)鐵蛋白在溶液中相互作用，導(dǎo)致菁染料形成不同的超分子聚集體，能夠在吸收光譜中表現(xiàn)出不同的特征信號，從而通過吸收光譜中特征峰對應(yīng)的波長范圍以及菁染料與不同種類的轉(zhuǎn)鐵蛋白相互作用的溶液的顏色變化，直觀地判斷轉(zhuǎn)鐵蛋白的種類及構(gòu)象。

轉(zhuǎn)鐵蛋白自身的構(gòu)象不同，對菁染料的聚集狀態(tài)的影響不同，構(gòu)象開放的脫鐵型轉(zhuǎn)鐵蛋白引起一種菁染料超分子聚集體，而構(gòu)象為閉合狀態(tài)的含鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白會引發(fā)另一種菁染料超分子聚集體。

所述構(gòu)象完全開放的脫鐵型轉(zhuǎn)鐵蛋白引起的菁染料超分子聚集體為J-聚集體，且不易解聚。

所述J-聚集體呈藍(lán)色。

所述含鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白包括構(gòu)象呈部分閉合的單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白和構(gòu)象呈完全閉合的雙鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白。

隨著所述構(gòu)象呈部分閉合的單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度增加，引起的菁染料超分子聚集體的狀態(tài)由J-聚集體逐漸轉(zhuǎn)化為H-聚集體。

所述H-聚集體呈粉紅色。

隨著所述構(gòu)象呈部分閉合的單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度增加，溶液顏色由藍(lán)色逐漸轉(zhuǎn)化為粉紅色，標(biāo)志著J-聚集體的解聚及H-聚集體的形成，這種顏色的變化可作為菁染料可視化識別單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的標(biāo)志。

所述構(gòu)象呈完全閉合的雙鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白可以誘導(dǎo)菁染料的兩種超分子聚集體，即：H-聚集體與J聚集體同時存在，但H-聚集體占主要比例，隨著雙鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度增加，樣品的顏色沒有明顯變化，這可作為菁染料可視化識別雙鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的標(biāo)志。

所述用菁染料可視化識別轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法包括如下具體的步驟：

(1)用緩沖溶液溶解待測轉(zhuǎn)鐵蛋白，配制成轉(zhuǎn)鐵蛋白母液，置于4℃冰箱中備用；采用有機溶劑將菁染料配制成菁染料溶液。

(2)將轉(zhuǎn)鐵蛋白母液按不同摩爾比加入到相同體積的菁染料中，所述在溶液樣本中待測轉(zhuǎn)鐵蛋白與菁染料的摩爾比為0.0005-6∶1，漩渦混勻，避光反應(yīng)0.1小時，最后用緩沖溶液定容至所需體積在20-40℃下避光反應(yīng)0.5-5小時，得到一系列待測溶液；

(3)待測樣品比色直觀監(jiān)測；

(4)測量待測樣品的吸收光譜，利用比色法分析菁染料對所測轉(zhuǎn)鐵蛋白的特征信號，從而判斷轉(zhuǎn)鐵蛋白的種類及構(gòu)象。

所述緩沖溶液選自不含金屬離子的緩沖溶液。

所述有機溶劑選自甲醇或二甲基亞砜中的一種。

所述緩沖溶液為Tris-HCl緩沖溶液，濃度范圍為5-100mmol/L，優(yōu)選濃度為10mmol/L，所述pH值為6.5-7.4，優(yōu)選pH值為6.85，所述菁染料溶液的濃度范圍為2-10μmol/L，優(yōu)選5μmol/L。

所述在溶液樣本中待測轉(zhuǎn)鐵蛋白與菁染料的摩爾比為0.0005-6∶1，優(yōu)選0.01-5∶1；所述反應(yīng)溫度為20-40℃，優(yōu)選25-37℃；所述反應(yīng)時間為0.5-5小時，優(yōu)選2-3小時。

本申請的有益效果：

(1)通過轉(zhuǎn)鐵蛋白自身構(gòu)象為模板對菁染料進行調(diào)控，在吸收光譜上菁染料對轉(zhuǎn)鐵蛋白的不同構(gòu)象產(chǎn)生不同響應(yīng)信號直接反映與轉(zhuǎn)鐵蛋白的反應(yīng)特征。

(2)本申請利用菁染料聚集體作為探針，對轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)十分敏感，并伴有聚集狀態(tài)的變化，從而可實現(xiàn)對轉(zhuǎn)鐵蛋白構(gòu)象的可視化檢測，同時在紫外吸收光譜上表現(xiàn)出明顯的聚集體變化信號。

(3)本申請所使用試劑組成成分簡單，只需按比例配制即可檢測，操作簡捷且成本低廉，該體系為環(huán)境友好型的液體環(huán)境，體系無需引發(fā)劑、催化劑，反應(yīng)簡單易行。

附圖說明

圖1為菁染料在單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白存在下的吸收光譜變化圖

圖2為菁染料在脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白存在下的吸收光譜變化圖

圖3為菁染料在雙鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白存在下的吸收光譜變化圖

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本申請做進一步說明，但本申請并不限于以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原材料如無特別說明均可從商業(yè)途徑而得。

實施例1：

將不同構(gòu)象的轉(zhuǎn)鐵蛋白分別溶解在Tris-HCl緩沖溶液(10mmol/L，pH值為6.85)中得到蛋白母液，菁染料用甲醇溶解，形成染料溶液。菁染料中分別按比例加入不同構(gòu)象的轉(zhuǎn)鐵蛋白，在溶液樣本中待測轉(zhuǎn)鐵蛋白與菁染料的摩爾比為0.0005-5∶1，其中菁染料溶液濃度為5μmol/L，漩渦混勻，避光反應(yīng)0.1小時后用緩沖溶液定容，在35℃下避光反應(yīng)2小時，監(jiān)測溶液樣品的顏色變化并進行吸收光譜測試。

(1)在菁染料中逐漸加入單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白，樣品溶液顏色由粉紅色→藍(lán)色→粉色，吸收結(jié)果表明菁染料在535nm和660nm處表現(xiàn)出特征峰，當(dāng)加入單鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白時，菁染料二聚體(535nm)逐漸消失，J-聚集體(660nm)吸收逐漸增加，當(dāng)J-聚集體達到最大吸收時，繼續(xù)增加蛋白濃度J-聚集體逐漸解聚并在480nm處逐漸形成H-聚集體。

(2)在菁染料中逐漸加入脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白，樣品溶液顏色由粉紅色→藍(lán)色，吸收結(jié)果表明當(dāng)加入脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白時，菁染料二聚體消失，J-聚集體形成且不易轉(zhuǎn)化成其他聚集狀態(tài)。

(3)在菁染料中逐漸加入雙鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白，樣品溶液顏色由粉紅色→粉藍(lán)色，吸收結(jié)果表明當(dāng)加入雙鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白時菁染料二聚體吸收基本保持不變且占主要比例，J-聚集體隨著蛋白濃度的增加吸收強度有所增加。

實施例2：

將不同構(gòu)象的轉(zhuǎn)鐵蛋白分別溶解在Tris-HCl緩沖溶液(5mmol/L，pH值為6.5)中得到蛋白母液，菁染料用甲醇溶解，形成染料溶液。菁染料中分別按不同比例加入不同構(gòu)象的轉(zhuǎn)鐵蛋白，在溶液樣本中待測轉(zhuǎn)鐵蛋白與菁染料的摩爾比為0.01-6∶1，其中菁染料溶液濃度為2μmol/L，漩渦混勻，避光反應(yīng)0.1小時后用緩沖溶液定容，在20℃下避光反應(yīng)5小時，監(jiān)測溶液樣品的顏色變化并進行吸收光譜測試。

測試部分的結(jié)論與實施例1中的結(jié)論相同。

實施例3：

將不同構(gòu)象的轉(zhuǎn)鐵蛋白分別溶解在Tris-HCl緩沖溶液100mmol/L，pH值為7.4)中得到蛋白母液，菁染料用甲醇溶解，形成菁染料溶液。菁染料中分別按不同比例加入不同構(gòu)象的轉(zhuǎn)鐵蛋白，在溶液樣本中待測轉(zhuǎn)鐵蛋白與菁染料的摩爾比為0.5-3∶1，其中菁染料濃度為10μmol/L，漩渦混勻，避光反應(yīng)0.1h后用緩沖溶液定容，在40℃下避光反應(yīng)0.5小時，監(jiān)測溶液樣品的顏色變化并進行吸收光譜測試。

測試部分的結(jié)論與實施例1中的結(jié)論也相同。

實施例4：

將脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白和雙鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白分別溶解到Tris-HCl緩沖溶液(10mmol/L，pH 7.0)中得到蛋白母液，菁染料用甲醇溶解，然后將兩種蛋白分別按不同摩爾比混合(保證總蛋白濃度為1μmol/L)加入到4μmol/L菁染料溶液中，在溶液樣本中待測轉(zhuǎn)鐵蛋白與菁染料的摩爾比為0.25∶1，漩渦混勻后避光反應(yīng)0.1小時，然后用緩沖溶液定容，在37℃避光反應(yīng)2小時，監(jiān)測溶液樣品的顏色變化并進行吸收光譜測試。吸收結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的比例逐漸增加，雙鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白比例逐漸減少，菁染料逐漸從二聚體轉(zhuǎn)化成J-聚集體，相應(yīng)溶液顏色變化與吸收結(jié)果表現(xiàn)一致，說明在混合轉(zhuǎn)鐵蛋白中菁染料能夠可視化監(jiān)控呈開放構(gòu)象的脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量。

以上描述是對本發(fā)明申請的解釋，不是對發(fā)明申請的限定，本發(fā)明所限定的范圍參見權(quán)利要求，在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，可以作任何形式的修改。