本發(fā)明主要涉及植物性食品中有毒物質(zhì)檢測
技術(shù)領域：
，具體地說，本發(fā)明涉及植物油中游離棉酚脫毒情況檢測。
背景技術(shù)：
：棉籽油是從棉花屬植物種子中提煉的食用油，主要來源為陸地棉和草棉，棉花作為一種重要的生活資料，廣泛分布于我國各地，作為副產(chǎn)物之一的棉籽除少量作為種子之外，其余大部分用于榨油，成為食用油中重要一部分。根據(jù)美國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，2012中國棉籽油產(chǎn)量為144.7萬噸，是全球最大棉籽油生產(chǎn)國。棉籽油成為我國居民食用油中重要一部分，是我國傳統(tǒng)四大食用植物油之一。在棉籽油生產(chǎn)加工、食用過程中，棉籽中的內(nèi)源性物質(zhì)-棉酚成為各方關注的重點，棉酚是錦葵科植物陸地棉、草棉及樹棉的成熟種子、根皮及莖稈中色素腺體中的一種黃色多酚物質(zhì)，棉酚在棉花的進化及抵抗害蟲方面起著重要作用，目前在我國種植的棉花品種絕大部分為高酚棉品種。棉酚的化學結(jié)構(gòu)由Adams等于1937年闡明，系統(tǒng)命名為1,1′,6,6′,7,7′-六羥基-5,5′二異丙基-3,3′二甲基-2,2′聯(lián)二萘-8,8′二羥基醛,分子式C30H30O8，見結(jié)構(gòu)式(1)。棉酚按其存在方式可分為結(jié)合棉酚(UG)和游離棉酚(FG)，總棉酚是指兩者之和。棉酚在植物體內(nèi)主要以游離棉酚方式存在，在棉花的種子、根皮及莖葉的腺體中都含有游離棉酚，其中棉籽中棉酚含量最為豐富，由于游離棉酚具有明確的毒副作用，并且在棉籽中含量較大，因此棉籽油生產(chǎn)工藝中非常重要的環(huán)節(jié)就是棉酚的脫毒工藝，各種脫毒工藝已經(jīng)在棉籽油生產(chǎn)過程中實際應用。目前許多國家規(guī)定了植物性食品中游離棉酚的限量，我國也制定了棉籽油中游離棉酚的限量≤0.02％，并制定了植物性食品中游離棉酚檢測的國家標準(GB/T5009148-2003)，此標準可用于棉籽油、棉粕飼料等中游離棉酚的含量檢測,植物性食品中游離棉酚檢測標準的建立在一定程度上遏制了棉酚含量超標的棉籽油進入市場，維護了消費者的健康安全。但是，棉酚的化學結(jié)構(gòu)中含有較多的酚羥基及醛基，化學性質(zhì)不穩(wěn)定，文獻報道棉酚在光照條件下發(fā)生縮醛互變異構(gòu)體。棉酚在各種溶劑中均表現(xiàn)出不穩(wěn)定。不管是我國目前普遍使用的預榨浸出法還是廣泛使用的直接浸出法，未作脫毒處理的棉籽油中游離棉酚在室溫條件下，較短的時間內(nèi)(15天至30天)游離棉酚含量會降解80％以上，加之各企業(yè)技術(shù)水平差別很大，棉籽油中棉酚脫毒工藝監(jiān)管難度較大，在眾多的棉籽油生產(chǎn)企業(yè)中極有可能存在棉酚脫毒不完全的情況，而目前僅僅檢測已經(jīng)上市的棉籽油中游離棉酚含量，不足以完全反映棉籽油企業(yè)的棉酚脫毒情況。由于棉酚不穩(wěn)定，室溫下30天降解90％以上，亟需一種利用棉籽油中棉酚降解產(chǎn)物評價生產(chǎn)過程游離棉酚脫毒情況的評價方法，可以作為化學標記物檢驗和評價棉籽油樣品游離棉酚脫毒情況，這種方法更為實用和具有現(xiàn)實意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明通過大量科學實驗尋找了一種利用棉籽油中棉酚降解產(chǎn)物評價游離棉酚脫毒情況的評價方法，該方法簡單可行，科學有效，測試結(jié)果準確穩(wěn)定，可以制止游離棉酚及降解產(chǎn)物含量超標的棉籽油進入市場，同時可以監(jiān)管棉籽油生產(chǎn)企業(yè)的脫毒工藝，對社會穩(wěn)定、經(jīng)濟發(fā)展、保障人民身體健康等方面都將起到積極作用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種技術(shù)方案：本發(fā)明提供的棉籽油中棉酚酮的檢測方法，由以下步驟構(gòu)成：(1)棉籽油供試品溶液的制備：稱取油樣1000.00mg于離心試管中，加入5mL無水乙醇，劇烈振搖2-5min，靜置分層，取上清液濾紙過濾，2000-4000r/min離心10-30min，上清液過0.45μm濾膜，即為供試品溶液。(2)制備濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標準溶液。(3)棉酚酮標準曲線的繪制：將上述濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標準溶液注入高效液相色譜儀，對色譜圖中主峰進行積分，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行回歸，得棉酚酮標準曲線。(4)棉籽油供試溶液，注入高效液相色譜儀，棉籽油供試溶液中棉酚酮應與棉酚酮系列標準溶液中主峰保留時間一致；對其峰面積進行積分，峰面積帶入棉酚酮標準曲線方程，計算棉籽油中棉酚酮濃度。(5)通過棉酚酮含量評價生產(chǎn)過程殘留游離棉酚含量：采用游離棉酚和降解產(chǎn)物棉酚酮量變關系：y(游離棉酚含量)＝2.85*X(棉酚酮含量)計算游離棉酚的含量。本發(fā)明中，濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標準溶液的制備方法為：用精密天平稱取棉酚酮對照品10mg，置于25ml容量瓶中，無水乙醇定容，得濃度為400μg/ml的棉酚酮儲備液，精密量取1、5、10、15、20ml棉酚酮儲備液置于100ml容量瓶中，無水乙醇定容。本發(fā)明中，采用HPLC色譜條件為InertsilODS-3色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇：2％磷酸＝85：15，流速1.0ml/min，柱溫40℃，檢測波長235nm。本發(fā)明中更加優(yōu)選的棉籽油供試品溶液的制備方法為：稱取油樣1000.00mg于離心試管中，加入5mL無水乙醇，劇烈振搖2min，靜置分層，取上清液濾紙過濾，4000r/min離心10min，上清液過0.45μm濾膜。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用評價棉籽油中游離棉酚降解產(chǎn)物評價游離棉酚脫毒情況的方法，簡單可行，測試結(jié)果準確穩(wěn)定，可以制止游離棉酚及降解產(chǎn)物含量超標的棉籽油進入市場，同時可以監(jiān)管棉籽油生產(chǎn)企業(yè)的脫毒工藝，對社會穩(wěn)定、經(jīng)濟發(fā)展、保障人民身體健康等方面都將起到積極作用。本發(fā)明通過研究清楚游離棉酚降解產(chǎn)物含量增加與游離棉酚含量降低的量變關系，并對游離棉酚降解產(chǎn)物化學結(jié)構(gòu)進行解析，建立一種通過檢測游離棉酚降解產(chǎn)物含量來評價棉籽油生成過程中游離棉酚脫毒情況的新方法，并對市場上隨機抽檢棉籽油中降解產(chǎn)物含量進行測定，獲得可靠的效果，是一種技術(shù)效果顯著的利用棉籽油中游離棉酚降解產(chǎn)物評價游離棉酚脫毒情況的方法。附圖說明圖1顯示為棉籽油中游離棉酚降解情況色譜圖。圖2顯示為游離棉酚降解產(chǎn)物質(zhì)譜圖。圖3顯示為碎片離子質(zhì)譜及裂解途徑圖。圖4顯示為游離棉酚和降解產(chǎn)物線性關系圖。圖5顯示為不同放置時間棉籽油中游離棉酚降解情況HPLC圖。圖6顯示為市售棉籽油樣品色譜圖。圖7顯示為市售棉籽油與未脫毒棉籽油對比。圖中1、6、7中，1-游離棉酚、2-降解產(chǎn)物。具體實施方式下面對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述，但本發(fā)明的配方和方法不限于下述實施例。采用的主要儀器設備：Agilent1220LC二元泵高效液相色譜儀；ABSciexAPI4000+TM三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀；KQ-500DE數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BS110S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；EYELAOSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。采用的主要藥品與試藥：甲醇(色譜純，F(xiàn)isherScientific，美國)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isherScientific，美國)；磷酸(優(yōu)級純，成都市科龍化工試劑廠)；乙醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)；本實驗所使用的棉籽均來自市場常見。20批棉籽油樣品均來自新疆本地榨油廠。本發(fā)明中選用的所有原輔材料，以及選用的菌種培養(yǎng)方法都為本領域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的％都為質(zhì)量百分比，除非特別指出除外。實施例一：本發(fā)明中一種棉籽油中游離棉酚脫毒情況評價方法，由以下步驟構(gòu)成：(1)棉籽油供試品溶液的制備：稱取油樣1000.00mg于離心試管中，加入5mL無水乙醇，劇烈振搖2-5min，靜置分層，取上清液濾紙過濾，2000-4000r/min離心10-30min，上清液過0.45μm濾膜，即為供試品溶液。(2)制備濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標準溶液。(3)棉酚酮標準曲線的繪制：將上述濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標準溶液注入高效液相色譜儀，對色譜圖中主峰進行積分，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標進行回歸，得棉酚酮標準曲線。(4)棉籽油供試溶液，注入高效液相色譜儀，棉籽油供試溶液中棉酚酮應與棉酚酮系列標準溶液中主峰保留時間一致；對其峰面積進行積分，峰面積帶入棉酚酮標準曲線方程，計算棉籽油中棉酚酮濃度。(5)通過棉酚酮含量評價生產(chǎn)過程殘留游離棉酚含量：采用游離棉酚和降解產(chǎn)物棉酚酮量變關系：y(游離棉酚含量)＝2.85*X(棉酚酮含量)計算游離棉酚的含量(參見附圖4)。實施例二：本發(fā)明中，濃度分別為4、20、40、60、80μg/ml的棉酚酮系列標準溶液的制備方法為：用精密天平稱取棉酚酮對照品10mg，置于25ml容量瓶中，無水乙醇定容，得濃度為400μg/ml的棉酚酮儲備液，精密量取1、5、10、15、20ml棉酚酮儲備液置于100ml容量瓶中，無水乙醇定容。實施例三：本發(fā)明中棉籽油供試品溶液的制備方法為：稱取油樣1000.00mg于離心試管中，加入5mL無水乙醇，劇烈振搖2min，靜置分層，取上清液濾紙過濾，4000r/min離心10min，上清液過0.45μm濾膜。實施例四：自制未脫毒游離棉酚的棉籽油按目前棉籽油毛油生產(chǎn)工藝進行，過程包括：棉籽→剝殼→預炸→浸出→浸出毛油。將上述未脫毒的棉籽油樣品放置在25℃室溫下，不避光保存。分別在0、5、10、15、20、25天取樣，放置于-21℃冰箱中。高效液相色譜統(tǒng)一進行測定。隨著放置時間的增加，游離棉酚峰面積逐漸減小的同時，降解產(chǎn)物峰面積逐漸增加(參見附圖5)。取未脫毒棉籽油在常溫下放置1個月，HPLC檢測游離棉酚降解完全，采用制備型HPLC色譜儀對降解產(chǎn)物進行分離制備，制得產(chǎn)物經(jīng)HPLC法分析，保留時間與棉籽油中游離棉酚降解產(chǎn)物保留時間一致。取上述降解產(chǎn)物樣品適量，乙醇溶解，過0.22μm濾膜，進LC-MS/MS分析。LC-MS/MS條件：離子源TurboSpray；碰撞氣6psi：氣簾氣10psi；霧化氣60psi；輔助加熱氣30psi；離子噴霧電壓4000V；離子源溫度350℃；去簇電壓56V；Q0電壓10V；碰撞能量15V；碰撞池出口電位12V。負離子模式下檢測，MRM監(jiān)測。分子量的測定：經(jīng)飛行時間質(zhì)譜儀檢測，[M-H]-m/z545.1442的質(zhì)譜圖，可知氧化產(chǎn)物M得準確分子量為546.1520；而棉酚酮的分子式為C30H26O10，準確分子量理論值為546.1518，說明反應產(chǎn)物與棉酚酮分子量吻合很好(參見附圖2),棉酚酮見結(jié)構(gòu)式(2)。對氧化產(chǎn)物進行ESI正、負離子的一級質(zhì)譜全掃描，在正、負離子模式下均有特征離子峰，噴霧電壓3500V，鞘氣壓力20Arb，輔氣壓力10Arb，毛細管溫度350℃，反吹壓力1.0Arb，錐孔電壓12Arb。經(jīng)過優(yōu)化，得到3個響應較高的氧化產(chǎn)物的碎片離子，m/z分別為273.1、244.2、257.3，這3個特征離子的產(chǎn)生均可由棉酚酮裂解產(chǎn)生。由質(zhì)譜分析可知，棉籽油中游離棉酚降解產(chǎn)物為棉酚氧化產(chǎn)物棉酚酮(參見附圖3)。0、5、10、15、20、25天取樣，進行色譜分析(參見附圖5)，游離棉酚色譜峰面積和降解產(chǎn)物色譜峰面積見表1。表1：放置時間與游離棉酚色譜峰面積和降解產(chǎn)物色譜峰面積關系放置時間/天降解產(chǎn)物峰面積游離棉酚峰面積0868183951.818E+09348669276955108183556062523963831271957619115826282283554963658234119075953111645988763169255809以降解產(chǎn)物峰面積為X軸，游離棉酚峰面積為Y軸作圖，線性方程為Y＝-2.85X+2058258982，r2＝0.9902。從以上峰面積數(shù)據(jù)關系可以看出，游離棉酚下降峰面積/降解產(chǎn)物增加峰面積＝2.85/1，棉籽油中游離棉酚和降解產(chǎn)物量變關系：y(游離棉酚含量)＝2.85*X(棉酚酮含量)實施例五：采用HPLC色譜條件InertsilODS-3色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇：2％磷酸＝85：15，流速1.0ml/min，柱溫40℃，檢測波長235nm。對本發(fā)明所用評價方法可靠性評價：線性關系考察：精密稱取已基本降解完全的棉籽油樣品10g(精確至0.01g)于離心試管中，加入50mL無水乙醇，按照本發(fā)明方法進行制備。精密吸取上清液各2、4、6、8、10mL置10mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容。本發(fā)明色譜條件測定，記錄峰面積。游離棉酚降解產(chǎn)物在0.0125～0.0625mg/mL范圍內(nèi)線性良好。得線性回歸方程為：Y＝110520637.5X－582707.5，r＝0.9995。精密度試驗：精密稱取已基本降解完全的棉籽油樣品1g(精確至0.01g)于離心試管中，加入5mL無水乙醇，按本發(fā)明方法進行制備。按本發(fā)明色譜條件測定，日內(nèi)連續(xù)進樣5次，記錄峰面積。游離棉酚降解產(chǎn)物日內(nèi)峰面積RSD為0.22％。重復性試驗：精密稱取已基本降解完全的同一批棉籽油樣品5份，各1g(精確至0.01g)于離心試管中，分別加入5mL無水乙醇，按本發(fā)明方法進行制備。按本發(fā)明色譜條件測定，記錄峰面積。游離棉酚降解產(chǎn)物峰面積RSD為1.30％。穩(wěn)定性試驗：精密稱取已基本降解完全的同一批棉籽油樣品6份，各1g，分別在0、2、4、8、12、24h加入5mL無水乙醇，按本發(fā)明方法進行制備。按本發(fā)明色譜條件測定，記錄峰面積。游離棉酚降解產(chǎn)物峰面積RSD為0.75％。加標回收率試驗：將已基本降解完全的棉籽油樣品作為標品進行加標回收率試驗。精密稱取已知含量的棉籽油樣品9份，各0.5g,每3份為一組作為平行樣。分別加入已基本降解完全的棉籽油樣品各0.4、0.5、0.6g于離心管中，各加入5mL無水乙醇，按本發(fā)明方法進行制備。按發(fā)明色譜條件測定，記錄峰面積(參見附圖1)，游離棉酚降解產(chǎn)物的平均回收率為93.18％，RSD為3.94％。結(jié)果見表2。表2：游離棉酚降解產(chǎn)物回收率實驗結(jié)果根據(jù)上述可靠性評價結(jié)果可知，本發(fā)明評價游離棉酚脫毒情況的評價方法，簡單可行，測試結(jié)果較為準確穩(wěn)定，完全可以實現(xiàn)對市面棉籽產(chǎn)品中游離棉酚含量的測定。實施例六：將市售的24批棉籽油樣品按本發(fā)明方法進行制備，按本發(fā)明色譜條件測定，研究發(fā)現(xiàn)，24批樣品中均未出現(xiàn)游離棉酚的色譜峰，而其中有20批棉籽油樣品的色譜圖中出現(xiàn)明顯的降解產(chǎn)物峰，通過降解產(chǎn)物棉酚酮與游離棉酚的量變關系公式，計算生產(chǎn)過程殘留游離棉酚的含量(參見附圖6、7)。表3:24批棉籽油樣品中降解產(chǎn)物含量“—”代表未檢出。從降解產(chǎn)物的角度研究棉籽油中游離棉酚的危害，這種研究思路是建立在大量實驗及理論基礎之上，更為客觀、真實。將會對棉籽油中游離棉酚的二次污染提供更為科學的評判方法，同時可追溯榨油企業(yè)脫毒情況。如上所述，即可較好地實現(xiàn)本發(fā)明,上述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設計精神的前提下，本領域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進，均應落入本發(fā)明確定的保護范圍內(nèi)。當前第1頁1 2 3