本發(fā)明涉及到一種舒肝丸的含量測(cè)定方法，屬中藥技術(shù)領(lǐng)域。具體的，涉及一種舒肝丸中芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷四種成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

舒肝丸為理氣劑，具有舒肝和胃，理氣止痛之功效。主治肝郁氣滯，胸肋脹滿，胃脘疼痛，嘈雜嘔吐，噯氣泛酸。該藥物由川楝子、醋延胡索、片姜黃、白芍(酒炒)、沉香、枳殼(炒)、木香、砂仁、陳皮、豆蔻仁、茯苓、姜厚樸、朱砂組成，藥效明確。舒肝丸(大蜜丸)標(biāo)準(zhǔn)最早收錄在《中國(guó)藥典》1985年版，2000年版中增加水蜜丸規(guī)格，2005年版增加水丸規(guī)格，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，檢驗(yàn)內(nèi)容同現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，2010年版第二增補(bǔ)本中增加小蜜丸規(guī)格，檢驗(yàn)內(nèi)容同《中國(guó)藥典》2005年版，未作修定。該藥物現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2015年版，記載了該藥物的處方、制法及質(zhì)量控制方法。該藥物所含藥味多，《中國(guó)藥典》2015年版中的含量測(cè)定項(xiàng)中，樣品經(jīng)過(guò)復(fù)雜的處理過(guò)程后，僅對(duì)白芍中芍藥苷進(jìn)行了含量測(cè)定，舒肝丸處方中陳皮中橙皮苷、枳殼中柚皮苷、新橙皮苷等成分在藥材中含量較高，但并未進(jìn)行測(cè)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種同時(shí)測(cè)定舒肝丸中芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷四種成分含量的方法。

本發(fā)明含量測(cè)定方法采用高效液相色譜法，該方法如下：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，0.05％-0.10％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為0-40分鐘，流動(dòng)相A由15％漸變至25％；檢測(cè)波長(zhǎng)為210-240nm；流速為1ml/min，理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于8000-10000；

對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品、柚皮苷對(duì)照品、橙皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備 取舒肝丸，取樣量0.5-1.2g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流70-100分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5-10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

本發(fā)明含量測(cè)定方法中，流動(dòng)相B優(yōu)選為0.05％磷酸；檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)選為230nm；理論板數(shù)優(yōu)選為按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于8000；取樣量?jī)?yōu)選為0.8g；測(cè)定法中分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液的量?jī)?yōu)選為5μl，注入液相色譜儀。

為了驗(yàn)證測(cè)定含量方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性，對(duì)方法進(jìn)行了以下方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，以確保該含量測(cè)定方法可以作為舒肝丸的質(zhì)量控制。

1儀器與試藥

1.1儀器

高效液相色譜儀：Waters e2695；色譜柱：Thermo Accliam(5μm，4.6mm×250mm)；電子天平：Mettler AE163；Mettler AE240；超純水儀：Integral 10(Millipore)。

1.2試藥與試劑

對(duì)照品：芍藥苷(批號(hào)：110736-201035，含量96.4％)、柚皮苷(批號(hào)：110722-201111)、橙皮苷(批號(hào)：110721-201014，含量95.3％)、新橙皮苷(批號(hào)：111857-201102，含量99.6％)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；制備陰性對(duì)照用藥材：川楝子、醋延胡索、白芍(酒炒)、片姜黃、木香、沉香、豆蔻仁、砂仁、姜厚樸、陳皮、枳殼(炒)、茯苓、朱砂均購(gòu)自市場(chǎng)，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院主任藥師段吉平鑒定為正品。

試劑：甲醇、乙腈(色譜純，Merck公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2方法確定

2.1色譜條件的確定

2.1.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別稱取芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，用甲醇溶液配制成適宜濃度的對(duì)照品溶液，在200nm～400nm進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果表明，芍藥苷在232nm波長(zhǎng)附近有最大吸收，橙皮苷在213、282nm波長(zhǎng)附近有最大吸收，柚皮苷、新橙皮苷在225、282nm波長(zhǎng)附近有最大吸收。282nm波長(zhǎng)下，芍藥苷紫外吸收極低，在確保測(cè)定值的準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，為方便實(shí)驗(yàn)，選擇四個(gè)成分均有較大吸收的210-240nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，此波長(zhǎng)下各待測(cè)成分與雜質(zhì)峰分離良好，陰性無(wú)干擾，其中230nm測(cè)定更優(yōu)。采用芍藥苷最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定數(shù)據(jù)與按選定波長(zhǎng)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果兩者基本一致，見(jiàn)表1。

表1不同波長(zhǎng)處各待測(cè)成分的含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比

2.1.2流動(dòng)相的選擇

樣品處方中藥味多，成分復(fù)雜，雜質(zhì)多，性質(zhì)相近的成分多，流動(dòng)相以甲醇作有機(jī)相時(shí)，未能得到良好分離，結(jié)合提取方法考察及色譜條件的考察，最終選擇乙腈作為有機(jī)相，梯度洗脫，根據(jù)各待測(cè)成分的極性及出峰時(shí)間，將梯度初始比例設(shè)為乙腈-0.05％磷酸溶液(15∶85)，梯度洗脫表見(jiàn)表2，分離良好。

表2梯度洗脫表

2.2對(duì)照品溶液的制備

2.2.1配制對(duì)照品溶劑的選擇

供試品溶液的溶劑為甲醇溶液，故對(duì)照品溶液的稀釋選擇甲醇溶液。

2.3供試品溶液的制備方法確定

2.3.1提取方法的初選

供試品溶液的制備方法1(現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)方法) 取舒肝丸適量，剪碎，混勻，取1g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率260W，頻率40kHz)45分鐘，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精蜜量取續(xù)濾液5ml，蒸干，殘?jiān)铀?ml使溶解，通過(guò)GDX-201型大孔吸附樹(shù)脂柱(內(nèi)徑為0.9cm，柱高為12cm)，用30％甲醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

供試品溶液的制備方法2 取舒肝丸適量，剪碎，混勻，取1g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率260W，頻率40kHz)45分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

結(jié)果：方法1得到的供試品溶液色譜峰較少，難以選擇待測(cè)成分進(jìn)行多成分含量測(cè)定方法的探索。而且不同品牌GDX-201型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)樣品測(cè)定結(jié)果影響較大。方法2得到的供試品溶液色譜峰較多，且各色譜峰之間分離良好，因此初步選擇方法2。

2.3.2取樣量的考察

取同一批樣品(大蜜丸，批號(hào)：4015087)，分別精密稱取0.5g、0.8g、1.2g，按正文方法試驗(yàn)。結(jié)果表明三種取樣量所得含量基本無(wú)差別，在保證色譜峰面積合適的前提下并使提取充分，選擇取樣量為0.8g(見(jiàn)表3)。

表3取樣量考察結(jié)果

2.3.3提取方式的考察

取同一批樣品(大蜜丸，批號(hào)：4015087)適量，分別超聲處理(功率400W，頻率40kHz)90分鐘、加熱回流90分鐘，按擬定色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明加熱回流比超聲處理提取率略高，故選擇加熱回流的提取方式，見(jiàn)表4。

表4不同提取方式的含量測(cè)定結(jié)果

2.3.4提取時(shí)間的考察

取同一批樣品(大蜜丸，批號(hào)：4015087)適量，分別加熱回流30min、45min、60min、90min、120min，按擬定色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明基本無(wú)差別，為確保提取完全，選擇加熱回流90min，見(jiàn)表5。

表5不同提取時(shí)間的含量測(cè)定結(jié)果

2.3.5提取溶劑的考察

取同一批樣品(大蜜丸，批號(hào)：4015087)適量，分別以50％、70％的甲醇溶液、甲醇、稀乙醇為提取溶劑，按擬定色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明以甲醇為提取溶劑，所測(cè)得待測(cè)成分含量較高，因此選擇甲醇作為提取溶劑，見(jiàn)表6。

表6不同提取溶劑的含量測(cè)定結(jié)果

3方法學(xué)考察

3.1專屬性試驗(yàn)

按處方比例和制法分別制備不含白芍、陳皮、枳殼的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液，按正文方法測(cè)定，并在二極管陣列檢測(cè)器上分析色譜峰純度。結(jié)果表明，方中其他藥味不干擾芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1，峰純度見(jiàn)圖2。

3.2線性關(guān)系考察

精密量取混合對(duì)照品溶液(芍藥苷濃度0.03898mg/ml、柚皮苷濃度0.04520mg/ml、橙皮苷濃度0.04487mg/ml、新橙皮苷濃度0.04705mg/ml)2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品溶液II。精密量取混合對(duì)照品溶液II 5μl、10μl，混合對(duì)照品溶液5μl、10μl、25μl注入液相色譜儀，按擬定的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，對(duì)照品的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷線性方程分別為y＝1.269×106x+1727.45、y＝2.128×106x+5288.04、y＝1.99×106x+4370.25、y＝2.123×106x+5287.15；線性范圍分別為0.03898～0.9476μg、0.0452～1.13μg、0.04487～1.1217μg、0.04705～1.1763μg；相關(guān)系數(shù)均為0.9999，表明待測(cè)成分線性關(guān)系良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7各待測(cè)成分線性關(guān)系考察結(jié)果

3.3重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(大蜜丸，批號(hào)：4015087)，剪碎，分別稱取0.64g、0.8g、0.96g各三份，精密稱定，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按正文方法測(cè)定。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好(結(jié)果見(jiàn)表8)。

表8重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.4回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(大蜜丸，批號(hào)：4015087，含量見(jiàn)重復(fù)性結(jié)果)，剪碎，取9份，每份約0.4g，精密稱定，每三份為一組，分別精密加入用溶液配制的低、中、高三個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液25ml，低濃度(芍藥苷：0.01170mg·ml^-1；柚皮苷：0.01808mg·ml^-1；橙皮苷：0.01795mg·ml^-1；新橙皮苷：0.01882mg·ml^-1)；中等濃度(芍藥苷：0.01559mg·ml^-1；柚皮苷：0.0226mg·ml^-1；橙皮苷：0.02243mg·ml^-1；新橙皮苷：0.02353mg·ml^-1)；高濃度(芍藥苷：0.01949mg·ml^-1；柚皮苷：0.02712mg·ml^-1；橙皮苷：0.02692mg·ml^-1；新橙皮苷：0.02823mg·ml^-1)。按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按正文方法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明本方法回收率良好。見(jiàn)表9～12。

表9芍藥苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表10柚皮苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表11橙皮苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表12新橙皮苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，于0小時(shí)開(kāi)始測(cè)定，以后間隔一段時(shí)間測(cè)定一次，記錄峰面積。結(jié)果RSD分別為1.1％、1.3％、0.9％、1.0％，表明供試品溶液至少在20小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定(結(jié)果見(jiàn)表13)。

表13供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.6耐用性試驗(yàn)

參照《中國(guó)藥典》2010年版一部，對(duì)方法進(jìn)行了不同品牌的色譜柱、柱溫、流速的耐用性進(jìn)行考察，并計(jì)算含量。結(jié)果表明，采用三種品牌色譜柱及各項(xiàng)色譜條件的微小變化下色譜峰均分離較好，測(cè)定結(jié)果基本一致，方法的耐用性較好。(見(jiàn)表14)

表14耐用性考察

注：色譜柱I：Thermo Acclaim C18，4.6×250mm，5μm；

II：Shim-pack lnertsil ODS-3，4.6×250mm，5μm；

III：Boston Green ODS，4.6×250mm，5μm

4樣品測(cè)定與限度制定

取小蜜丸2批、大蜜丸25批，按正文方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表16、17。

表15樣品測(cè)定結(jié)果(小蜜丸)

表16樣品測(cè)定結(jié)果(大蜜丸)

附圖說(shuō)明

圖1方法專屬性試驗(yàn)色譜圖(A、混合對(duì)對(duì)照品；B、樣品；C、D、E分別為白芍、陳皮、枳殼陰性樣品)(各色譜峰1為芍藥苷，2為柚皮苷，3為橙皮苷，4為新橙皮苷)；

圖2各待測(cè)成分色譜峰純度(A為芍藥苷，B為柚皮苷，C為橙皮苷，D為新橙皮苷)；

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，0.05％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為0-40分鐘，流動(dòng)相A由15％漸變至25％；檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm；理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于8000；

對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品、柚皮苷對(duì)照品、橙皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備 取舒肝丸，取樣量0.8g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

實(shí)施例2

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，0.08％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為0-40分鐘，流動(dòng)相A由15％漸變至25％；檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm；理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于9000；

對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品、柚皮苷對(duì)照品、橙皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備 取舒肝丸，取樣量0.5g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

實(shí)施例3

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，0.10％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為0-40分鐘，流動(dòng)相A由15％漸變至25％；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于10000；

對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品、柚皮苷對(duì)照品、橙皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備 取舒肝丸，取樣量1.2g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

實(shí)施例4

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，0.05％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為0-40分鐘，流動(dòng)相A由15％漸變至25％；檢測(cè)波長(zhǎng)為232nm；理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于10000；

對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品、柚皮苷對(duì)照品、橙皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備 取舒肝丸，取樣量1.0g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

上述實(shí)施例均按照藥典要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示方法準(zhǔn)確可靠、靈敏、專屬，各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量控制的要求。