本發(fā)明涉及分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種褐藻及制品含用高效液相色譜法對海藻酸含量的檢測方法。

背景技術(shù)：

海藻酸是從褐藻類植物中提取出來的碳水化合物，其為褐藻類植物的細(xì)胞壁填充物。組成上，海藻酸是以D-甘露糖醛酸和L-古羅糖醛酸兩種糖醛酸聚合而成的非均勻長鏈高分子聚合物。一般而言，生物合成的海藻酸在結(jié)構(gòu)上基本相似，但是海藻酸的D-甘露糖醛酸和L-古羅糖醛酸會依海藻種類、生態(tài)環(huán)境和季節(jié)有明顯的不同，最終引起海藻酸的性質(zhì)差異。

根據(jù)相關(guān)資料報道，海藻酸在制作冰激凌、冰牛奶、果醬、果凍和色拉等食品工業(yè)中可用作穩(wěn)定劑和增稠劑；在紡織工業(yè)中可用作印花色漿，具有上色量高的特點(diǎn)，還可用作紡出人造纖維和止血紗布；在醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)中可用作抗凝血劑和防治心血管藥物，具有降低膽固醇含量、疏通血管、降低血液粘度、軟化血管等作用，此外還可用作代血漿、止血劑等；在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可用于處理種子以及用于制作殺蟲藥分散劑、抗病毒噴灑劑等。因此，由于海藻酸廣泛而顯著的用途性，其生產(chǎn)及應(yīng)用都引起了廣泛關(guān)注。

目前，關(guān)于褐藻中海藻酸含量的測定方法主要有重量法、容量法、比色法和分光光度法，其中，比色法應(yīng)用較廣泛而分光光度法設(shè)備簡單、費(fèi)用低，但是上述方法均干擾多、精度不高。

為了克服現(xiàn)有褐藻中海藻酸含量的測定方法中的不足，實(shí)現(xiàn)方便、準(zhǔn)確的檢測目標(biāo)分析物的目的，對生產(chǎn)中海藻酸含量進(jìn)行有效監(jiān)控，有必要研究一種應(yīng)用高效液相色譜新的檢測海藻及制品海藻酸含量的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種褐藻及其制品中海藻酸含量的檢測方法。該檢測方法是通過高效液相色譜法來實(shí)現(xiàn)對海藻酸含量的檢測，具有高效快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，有效地解決了糖類物質(zhì)沒有紫外吸收的問題，可以準(zhǔn)確地對海藻酸提取液進(jìn)行定性和定量分析，且分離效果好，線性范圍寬，具有針對性強(qiáng)、準(zhǔn)確性、分離度高、分析快速、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，利于廣泛應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是采用如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明提供一種褐藻及其制品中海藻酸含量的檢測方法，該檢測方法包括采用高效液相色譜法測定所述褐藻中海藻酸的含量，其中，所述高效液相色譜條件包括：

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C18色譜柱；

流動相：乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液。

優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的條件包括：

所述C18色譜柱柱長為150mm，柱內(nèi)徑為4.6mm；

優(yōu)選地，所述填充劑的粒徑為5-10μm，優(yōu)選為5μm；

所述流動相中所述磷酸二氫鉀緩沖液的濃度為50mmol/L；優(yōu)選地，所述乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液pH6.9；優(yōu)選地，所述乙腈和磷酸二氫鉀緩沖液體積比為10-25：75-90，優(yōu)選為15：85。

優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的條件還包括：

色譜柱柱溫：30-70℃，優(yōu)選為40℃；

流動相流速：0.5-2.5mL/min，優(yōu)選為0.5-1mL/min，進(jìn)一步優(yōu)選為1mL/min；

檢測波長：250-300nm，優(yōu)選為250nm。

優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的供試品溶液按照以下步驟來制備：

(1)取褐藻，經(jīng)90-98％的濃硫酸于75-90℃下進(jìn)行水解；

(2)在步驟(1)所得水解產(chǎn)物中加入氫氧化鈉和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，置于50-80℃下水浴中30-90min；

(3)在步驟(2)所得的溶液中加入三氯甲烷進(jìn)行萃取，取上層清液，濾過；

優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述水解時間為0.5-3h；

優(yōu)選地，所述步驟(2)中加入氫氧化鈉是指加入濃度為0.2-2mol/L的氫氧化鈉溶液；

優(yōu)選地，所述步驟(2)中加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮是指加入濃度為0.5-2mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液；

優(yōu)選地，所述步驟(3)中所述萃取次數(shù)為2-4次；

優(yōu)選地，所述每次萃取時間為20-60min；

優(yōu)選地，所述步驟(3)中所述濾過是指使用0.20-0.60μm水系膜過濾，優(yōu)選0.45μm水系膜；

優(yōu)選地，所述步驟(3)在冰水浴中進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的供試品溶液按照以下步驟來制備：

(1)取褐藻1.25g，置于25ml容量瓶，加水溶解，定容，后移取1ml于20ml容量瓶中，加入0.5-5ml的90-98％的濃硫酸于75-90℃下進(jìn)行水解0.5-3h，后冷卻至室溫，加入5ml水稀釋后于82-90℃下水解30-90min；

(2)將步驟(1)所得水解產(chǎn)物置于冰水浴中冷卻，經(jīng)8mol/L的氫氧化鈉溶液中和至pH值中性，后移置25ml容量瓶，定容，移取1ml于10ml容量瓶中，加入0.2-2mol/L氫氧化鈉溶液0.5-5ml和0.5-2mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液0.5-5ml，混合均勻，置于50-80℃下水浴中30-90min，后經(jīng)0.3mol/L醋酸中和至pH值中性，再加水定容至10ml；

(3)冰水浴條件下，取步驟(2)所得溶液2ml置于20ml容量瓶，加入4ml三氯甲烷以萃取剩余的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，萃取時間20-60min，棄去三氯甲烷層，反復(fù)萃取2-4次，取上層清液，經(jīng)0.45μm水系膜過濾。

優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的對照品溶液按照以下步驟來制備：

(1)取海藻酸鈉，經(jīng)90-98％的濃硫酸于75-90℃下進(jìn)行水解；

(2)在步驟(1)所得水解產(chǎn)物中加入氫氧化鈉和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，置于50-80℃下水浴中30-90min；

(3)在步驟(2)所得溶液中加入三氯甲烷進(jìn)行萃取，取上層清液，濾過；

優(yōu)選地，所述步驟(1)中所述水解時間為0.5-3h；

優(yōu)選地，所述步驟(2)中加入氫氧化鈉是指加入濃度為0.2-2mol/L的氫氧化鈉溶液；

優(yōu)選地，所述步驟(2)中加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮是指加入濃度為0.5-2mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液；

優(yōu)選地，所述步驟(3)中所述萃取次數(shù)為2-4次；優(yōu)選地，所述每次萃取時間為20-60min；

優(yōu)選地，所述步驟(3)中所述濾過是指使用0.20-0.60μm水系膜過濾，優(yōu)選0.45μm水系膜；

優(yōu)選地，所述步驟(3)在冰水浴中進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的對照品溶液按照以下步驟來制備：

(1)分別取海藻酸鈉5mg、10mg、15mg、20mg、25mg，再分別加1ml水溶解，定容，后分別移取1ml于20ml容量瓶中，加入0.5-5ml的90-98％的濃硫酸于75-90℃下進(jìn)行水解0.5-3h，后冷卻至室溫，加入5ml水稀釋后于82-90℃下水解30-90min；

(2)分別將步驟(1)所得水解產(chǎn)物置于冰水浴中冷卻，經(jīng)8mol/L的氫氧化鈉溶液中和至pH值中性，后分別移置25ml容量瓶，定容，分別移取1ml于10ml容量瓶中，加入0.2-2mol/L氫氧化鈉溶液0.5-5ml和0.5-2mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液0.5-5ml，混合均勻，置于50-80℃下水浴中30-90min，后經(jīng)0.3mol/L醋酸中和至pH值中性，再加水定容至10ml；

(3)冰水浴條件下，分別取步驟(2)所得溶液2ml置于20ml容量瓶，分別加入4ml三氯甲烷以分別萃取剩余的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，萃取時間20-60min，棄去三氯甲烷層，反復(fù)2-4次，取上層清液，經(jīng)0.45μm水系膜過濾，分別得到濃度為20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的對照品溶液。

優(yōu)選地，所述褐藻中海藻酸含量的檢測方法包括以下步驟：

(a)制備供試品溶液：

(a-1)取褐藻1.25g，置于25ml容量瓶，加水溶解，定容，后移取1ml于20ml容量瓶中，加入0.5-5ml的90-98％的濃硫酸于75-90℃下進(jìn)行水解0.5-3h，后冷卻至室溫，加入5ml水稀釋后于82-90℃下水解30-90min；

(a-2)將步驟(a-1)獲得的水解產(chǎn)物置于冰水浴中冷卻，經(jīng)8mol/L的氫氧化鈉溶液中和至pH值中性，后移置25ml容量瓶，定容，移取1ml于10ml容量瓶中，加入0.2-2mol/L氫氧化鈉溶液0.5-5ml和0.5-2mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液0.5-5ml，混合均勻，置于50-80℃下水浴中30-90min，后經(jīng)0.3mol/L醋酸中和至pH值中性，再加水定容至10ml；

(a-3)冰水浴條件下，取步驟(a-2)獲得的溶液2ml置于20ml容量瓶，加入4ml三氯甲烷以萃取剩余的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，萃取時間20-60min，棄去三氯甲烷層，反復(fù)萃取2-4次，取上層清液，經(jīng)0.45μm水系膜過濾。

(b)制備對照品溶液：

(b-1)分別取海藻酸鈉5mg、10mg、15mg、20mg、25mg，再分別加1ml水溶解，定容，后分別移取1ml于20ml容量瓶中，加入0.5-5ml的90-98％的濃硫酸于75-90℃下進(jìn)行水解0.5-3h，后冷卻至室溫，加入5ml水稀釋后于82-90℃下水解30-90min；

(b-2)分別將步驟(b-1)所得的水解產(chǎn)物置于冰水浴中冷卻，經(jīng)8mol/L的氫氧化鈉溶液中和至pH值中性，后分別移置25ml容量瓶，定容，分別移取1ml于10ml容量瓶中，加入0.2-2mol/L氫氧化鈉溶液0.5-5ml和0.5-2mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液0.5-5ml，混合均勻，置于50-80℃下水浴中30-90min，后經(jīng)0.3mol/L醋酸中和至pH值中性，再加水定容至10ml；

(b-3)冰水浴條件下，分別取步驟(b-2)所得的溶液2ml置于20ml容量瓶，分別加入4ml三氯甲烷以分別萃取剩余的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，萃取時間20-60min，棄去三氯甲烷層，反復(fù)2-4次，取上層清液，經(jīng)0.45μm水系膜過濾，分別得到濃度為20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的對照品溶液。

(c)采用高效液相色譜法測定所述海藻酸的含量：

取對照品溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，所述高效液相色譜包括：

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C18色譜柱，優(yōu)選地，所述色譜柱柱長為150mm，柱內(nèi)徑為4.6mm；優(yōu)選地，所述色譜柱中填充劑的粒徑為5-10μm，優(yōu)選5μm；

色譜柱柱溫：30-70℃，優(yōu)選為40℃；

流動相流速：0.5-2.5mL/min，優(yōu)選為0.5-1mL/min，進(jìn)一步優(yōu)選為1mL/min；

檢測波長：250-300nm，優(yōu)選為250nm；

所述流動相中所述磷酸二氫鉀緩沖液的濃度為50mmol/L；優(yōu)選地，所述乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液pH6.9；優(yōu)選地，所述乙腈和磷酸二氫鉀緩沖液體積比為10-25：75-90，優(yōu)選15：85。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的檢測海藻酸含量的方法具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明將海藻酸含量測定的指標(biāo)選定為D-甘露糖醛酸和L-古羅糖醛酸，此二者為海藻酸中有代表性的主要成分，含量高、性質(zhì)穩(wěn)定，作為標(biāo)示性成分用于控制海藻酸含量具有較好的專屬性和質(zhì)量相關(guān)性；

(2)相對于紫外分光光度法、薄層掃描法等而言，本發(fā)明的高效液相色譜法具有分辨率高、靈敏性高、重現(xiàn)性好、選擇性好、結(jié)果誤差小等優(yōu)點(diǎn)；

(3)本發(fā)明的檢測方法對供試品和對照品的處理快速、方便、易操作；

(4)本發(fā)明的檢測方法實(shí)現(xiàn)了對海藻酸進(jìn)行定性和定量分析，且分離效果好，線性范圍寬，具有針對性強(qiáng)、準(zhǔn)確性、分離度高、分析快速、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，利于廣泛應(yīng)用，填補(bǔ)了海藻酸含量分析方面的研究空白；

(5)不同的色譜條件、不同的供試品和對照品的處理方法對于海藻酸含量的檢測結(jié)果會有很大影響，本發(fā)明經(jīng)篩選優(yōu)選獲得的高效液相色譜法檢測條件和步驟可以準(zhǔn)確、簡便地測定海藻酸的含量。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：

圖1為海藻酸鈉對照品的色譜圖，其中1號峰為L-古羅糖醛酸，2號峰為D-甘露糖醛酸；

圖2為實(shí)施例1液相檢測樣品中海藻酸的色譜圖；

圖3為實(shí)施例4液相檢測樣品中海藻酸的色譜圖；

圖4為實(shí)施例5液相檢測樣品中海藻酸的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。

以下各實(shí)施例中所使用的供試品來源于北京雷力海洋生物新產(chǎn)業(yè)股份有限公司自制，對照品海藻酸鈉采購于SIGMA公司。

高效液相色譜儀及檢測器采購于美國SSI公司；C18色譜柱采購于島津公司。

實(shí)施例1

1、制備供試品溶液：

(1)褐藻水解：

準(zhǔn)確稱取褐藻1.25g(精確到0.0001g)，置于25ml容量瓶中，加水充分溶解，定容，然后精密移取1ml置于20ml水解瓶中(液體直接精密分取1ml)，加1.0ml濃度為98％的濃硫酸，然后于82℃水浴中水解30min取出后冷卻至室溫，加5ml水稀釋后再置于82℃水浴中繼續(xù)水解30min；

(2)供試品的衍生：

取出步驟(1)水解產(chǎn)物放置冰水浴中冷卻，然后用8mol/L的氫氧化鈉溶液中和，調(diào)pH值至中性，然后轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶定容，取1ml溶液于10ml容量瓶中加入0.3mol/L的氫氧化鈉溶液1ml和0.5mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)溶液1ml，混勻后于70℃水浴中衍生70min，后放至室溫，用0.3mol/L的醋酸中和，然后用水定容至10ml，備用；

(3)供試品的預(yù)處理：

在冰水浴中，取步驟(2)所得溶液2ml置于20ml水解瓶中，加入4ml三氯甲烷渦旋混勻，放置30min萃取多余的PMP，然后棄去三氯甲烷層，反復(fù)萃取兩次，取上層清液經(jīng)0.45μm水系膜過濾。

2、制備對照品溶液：

(1)海藻酸鈉水解：

分別準(zhǔn)確稱取海藻酸鈉5mg、10mg、15mg、20mg、25mg于水解瓶中，再分別加1ml蒸餾水溫?zé)岢浞秩芙?，定容，后分別移取1ml于20ml容量瓶中，加入1ml濃度為98％的濃硫酸，然后于82℃水浴中水解30min取出后冷卻至室溫，加5ml水稀釋后再置于82℃水浴中繼續(xù)水解30min；

(2)對照品的衍生：

分別將步驟(1)獲得的各水解產(chǎn)物置于冰水浴中冷卻，然后用8mol/L的氫氧化鈉溶液中和，調(diào)pH值至中性，然后分別轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶定容，取1ml溶液于10ml容量瓶中加入0.3mol/L的氫氧化鈉溶液1ml和0.5mol/L的PMP溶液1ml，混勻后于70℃水浴中衍生70min，后放至室溫，用0.3mol/L的醋酸中和，然后用水定容至10ml，備用；

(3)對照品的預(yù)處理：

在冰水浴中，分別取步驟(2)所得的各溶液2ml置于20ml水解瓶中，分別加入4ml三氯甲烷渦旋混勻，放置30min萃取多余的PMP，然后棄去三氯甲烷層，反復(fù)萃取2次，取上層清液經(jīng)0.45μm水系膜過濾；分別得到濃度為20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的對照品溶液。

3、高效液相色譜儀測定：

測定對照品溶液和供試品溶液的紫外吸收響應(yīng)值，根據(jù)峰保留時間定性，并根據(jù)峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量；

色譜條件：C18色譜柱，150mm×4.6mm，5μm；

柱溫：40℃；

流速：1.0mL/min；

紫外檢測器波長：250nm；

進(jìn)樣體積：20μL；

流動相：乙腈與50mmol/L的磷酸二氫鉀緩沖液的體積比為15：85。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：

采用外標(biāo)法對海藻酸鈉不同濃度(即20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL)的對照品溶液從低濃度到高濃度依次進(jìn)液相色譜分析，得到相應(yīng)譜圖，采用峰面積定量，以峰面積(積分值)對質(zhì)量濃度(mg/L)求得線性回歸方程，驗證標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)，確定線性范圍為0.02-0.16mg/mL，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y＝35135x-29814和r＝0.9994。

5、本發(fā)明海藻酸含量的檢測方法的方法學(xué)考察

通過檢測褐藻中海藻酸供試品溶液進(jìn)行方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率考察，對于海藻酸供試品溶液的加標(biāo)水平分別為25mg/g、100mg/g、300mg/g，進(jìn)行3次加標(biāo)測定分析，結(jié)果如表1和表2所示，三次平行測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.38-3.39之間，回收率在80％至110％之間，變異系數(shù)在2％至15％之間，結(jié)果重復(fù)性好，添加回收率高，方法的準(zhǔn)確度和精密度可以滿足海藻酸供試品溶液含量測定的要求。采用空白樣品標(biāo)準(zhǔn)添加的方法確定方法的檢出限為10mg/g，定量限為20mg/g。

表1：方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差考察

表2：加標(biāo)回收率考察

6、計算方法：

褐藻中海藻酸含量為古羅糖醛酸含量和甘露糖醛酸含量之和。

式中：

X1：褐藻中古羅糖醛酸百分含量；

X2：褐藻中甘露糖醛酸百分含量；

C1：Sigma海藻酸鈉中古羅糖醛酸百分含量；

C2：Sigma海藻酸鈉中甘露糖醛酸百分含量；

S1：海藻酸鈉對照品溶液中古羅糖醛酸峰面積；

S2：海藻酸鈉對照品溶液中甘露糖醛酸峰面積；

S3：褐藻中古羅糖醛酸峰面積；

S4：褐藻中甘露糖醛酸峰面積；

M1：海藻酸鈉質(zhì)量單位為克(g)；

M3：褐藻質(zhì)量單位為克(g)；

V1：對照品海藻酸鈉定容體積，單位為毫升(mL)；

V2：供試品褐藻溶液定容體積，單位為毫升(mL)。

實(shí)施例2

1、制備供試品溶液：

(1)褐藻水解：

準(zhǔn)確稱取褐藻1.25g(精確到0.0001g)，置于25ml容量瓶中，加水充分溶解，定容，然后精密移取1ml置于20ml水解瓶中(液體直接精密分取1ml)，加0.5ml濃度為90％的濃硫酸，然后于75℃水浴中水解60min取出后冷卻至室溫，加5ml水稀釋后再置于75℃水浴中繼續(xù)水解60min；

(2)供試品的衍生：

取出步驟(1)水解產(chǎn)物放置冰水浴中冷卻，然后用8mol/L的氫氧化鈉溶液中和，調(diào)pH值至中性，然后轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶定容，取1ml溶液于10ml容量瓶中加入0.2mol/L的氫氧化鈉溶液0.5ml和1mol/L的PMP溶液0.5ml，混勻后于50℃水浴中衍生30min，后放至室溫，用0.3mol/L的醋酸中和，然后用水定容至10ml，備用；

(3)供試品的預(yù)處理：

在冰水浴中，取步驟(2)所得溶液2ml置于20ml水解瓶中，加入4ml三氯甲烷渦旋混勻，放置20min萃取多余的PMP，然后棄去三氯甲烷層，反復(fù)萃取2次，取上層清液經(jīng)0.2μm水系膜過濾。

2、制備對照品溶液：

(1)海藻酸鈉水解：

分別準(zhǔn)確稱取海藻酸鈉5mg、10mg、15mg、20mg、25mg于水解瓶中，再分別加1ml蒸餾水溫?zé)岢浞秩芙猓ㄈ?，后分別移取1ml于20ml容量瓶中，加入0.5ml濃度為90％的濃硫酸，然后于75℃水浴中水解60min取出后冷卻至室溫，加5ml水稀釋后再置于75℃水浴中繼續(xù)水解60min；

(2)對照品的衍生：

分別將步驟(1)獲得的各水解產(chǎn)物置于冰水浴中冷卻，然后用8mol/L的氫氧化鈉溶液中和，調(diào)pH值至中性，然后分別轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶定容，取1ml溶液于10ml容量瓶中加入0.2mol/L的氫氧化鈉溶液0.5ml和1mol/L的PMP溶液0.5ml，混勻后于50℃水浴中衍生30min，后放至室溫，用0.3mol/L的醋酸中和，然后用水定容至10ml，備用；

(3)對照品的預(yù)處理：

在冰水浴中，分別取步驟(2)所得的各溶液2ml置于20ml水解瓶中，分別加入4ml三氯甲烷渦旋混勻，放置20min萃取多余的PMP，然后棄去三氯甲烷層，反復(fù)萃取2次，取上層清液經(jīng)0.20μm水系膜過濾；分別得到濃度為20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的對照品溶液。

3、高效液相色譜儀測定：

測定對照品溶液和供試品溶液的紫外吸收響應(yīng)值，根據(jù)峰保留時間定性，并根據(jù)峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量；

色譜條件：C18色譜柱，150mm×4.6mm，5μm；

柱溫：30℃；

流速：0.5mL/min；

紫外檢測器波長：280nm；

進(jìn)樣體積：20μL；

流動相：乙腈與50mmol/L的磷酸二氫鉀緩沖液的體積比為10：90。

實(shí)施例3

1、制備供試品溶液：

(1)褐藻水解：

準(zhǔn)確稱取褐藻1.25g(精確到0.0001g)，置于25ml容量瓶中，加水充分溶解，定容，然后精密移取1ml置于20ml水解瓶中(液體直接精密分取1ml)，加1.0ml濃度為95％的濃硫酸，然后于90℃水浴中水解90min取出后冷卻至室溫，加5ml水稀釋后再置于90℃水浴中繼續(xù)水解90min；

(2)供試品的衍生：

取出步驟(1)水解產(chǎn)物放置冰水浴中冷卻，然后用8mol/L的氫氧化鈉溶液中和，調(diào)pH值至中性，然后轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶定容，取1ml溶液于10ml容量瓶中加入2mol/L的氫氧化鈉溶液5ml和2mol/L的PMP溶液5ml，混勻后于80℃水浴中衍生90min，后放至室溫，用0.3mol/L的醋酸中和，然后用水定容至10ml，備用；

(3)供試品的預(yù)處理：

在冰水浴中，取步驟(2)所得溶液2ml置于20ml水解瓶中，加入4ml三氯甲烷渦旋混勻，放置60min萃取多余的PMP，然后棄去三氯甲烷層，反復(fù)萃取4次，取上層清液經(jīng)0.60μm水系膜過濾；

2、制備對照品溶液：

(1)海藻酸鈉水解：

分別準(zhǔn)確稱取海藻酸鈉5mg、10mg、15mg、20mg、25mg于水解瓶中，再分別加1ml蒸餾水溫?zé)岢浞秩芙猓ㄈ?，后分別移取1ml于20ml容量瓶中，加入5ml濃度為95％的濃硫酸，然后于90℃水浴中水解90min取出后冷卻至室溫，加5ml水稀釋后再置于90℃水浴中繼續(xù)水解90min；

(2)對照品的衍生：

分別將步驟(1)獲得的各水解產(chǎn)物置于冰水浴中冷卻，然后用8mol/L的氫氧化鈉溶液中和，調(diào)pH值至中性，然后分別轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶定容，取1ml溶液于10ml容量瓶中加入2mol/L的氫氧化鈉溶液5ml和2mol/L的PMP溶液5ml，混勻后于80℃水浴中衍生90min，后放至室溫，用0.3mol/L的醋酸中和，然后用水定容至10ml，備用；

(3)對照品的預(yù)處理：

在冰水浴中，分別取步驟(2)所得的各溶液2ml置于20ml水解瓶中，分別加入4ml三氯甲烷渦旋混勻，放置60min萃取多余的PMP，然后棄去三氯甲烷層，反復(fù)萃取4次，取上層清液經(jīng)0.60μm水系膜過濾；分別得到濃度為20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的對照品溶液。

3、高效液相色譜儀測定：

測定對照品溶液和供試品溶液的紫外吸收響應(yīng)值，根據(jù)峰保留時間定性，并根據(jù)峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量；

色譜條件：C18色譜柱，150mm×4.6mm，5μm；

柱溫：70℃；

流速：0.5mL/min；

紫外檢測器波長：300nm；

進(jìn)樣體積：20μL；

流動相：乙腈與50mmol/L的磷酸二氫鉀緩沖液的體積比為25：75。

實(shí)施例4

1、制備供試品溶液：

(1)褐藻水解：

準(zhǔn)確稱取褐藻1.25g(精確到0.0001g)，置于25ml容量瓶中，加水充分溶解，定容，然后精密移取1ml置于20ml水解瓶中(液體直接精密分取1ml)，加1.0ml濃度為95％的濃硫酸，然后于90℃水浴中水解90min取出后冷卻至室溫，加5ml水稀釋后再置于90℃水浴中繼續(xù)水解90min；

(2)供試品不進(jìn)行衍生。

2、制備對照品溶液：

(1)海藻酸鈉水解：

分別準(zhǔn)確稱取海藻酸鈉5mg、10mg、15mg、20mg、25mg于水解瓶中，再分別加1ml蒸餾水溫?zé)岢浞秩芙?，定容，后分別移取1ml于20ml容量瓶中，加入5ml濃度為95％的濃硫酸，然后于90℃水浴中水解90min取出后冷卻至室溫，加5ml水稀釋后再置于90℃水浴中繼續(xù)水解90min；

(2)對照品不進(jìn)行衍生：

3、高效液相色譜儀測定：

測定對照品溶液和供試品溶液的紫外吸收響應(yīng)值，根據(jù)峰保留時間定性，并根據(jù)峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量；

色譜條件：C18色譜柱，150mm×4.6mm，5μm；

柱溫：70℃；

流速：0.5mL/min；

紫外檢測器波長：300nm；

進(jìn)樣體積：20μL；

流動相：乙腈與50mmol/L的磷酸二氫鉀緩沖液的體積比為25：75；

4、數(shù)據(jù)結(jié)果：

見圖3，供試品和對照品都未出現(xiàn)相應(yīng)峰，因此供試品和對照品不衍生，紫外檢測器幾乎無吸收，因此不衍生的結(jié)論是不可行的。

實(shí)施例5

1、制備供試品溶液：

(1)褐藻水解：

準(zhǔn)確稱取褐藻1.25g(精確到0.0001g)，置于25ml容量瓶中，加水充分溶解，定容，然后精密移取1ml置于20ml水解瓶中(液體直接精密分取1ml)，加1.0ml濃度為95％的濃硫酸，然后于90℃水浴中水解90min取出后冷卻至室溫，加5ml水稀釋后再置于90℃水浴中繼續(xù)水解90min；

(2)供試品的衍生：

取出步驟(1)水解產(chǎn)物放置冰水浴中冷卻，然后用8mol/L的氫氧化鈉溶液中和，調(diào)pH值至中性，然后轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶定容，取1ml溶液于10ml容量瓶中加入2mol/L的氫氧化鈉溶液5ml和2mol/L的對氨基苯甲酸(p-AMBA)溶液5ml，混勻后于80℃水浴中衍生90min，后放至室溫，用0.3mol/L的醋酸中和，然后用水定容至10ml，備用；

(3)供試品的預(yù)處理：

在冰水浴中，取步驟(2)所得溶液2ml置于20ml水解瓶中，加入4ml三氯甲烷渦旋混勻，放置60min萃取多余的p-AMBA，然后棄去三氯甲烷層，反復(fù)萃取4次，取上層清液經(jīng)0.60μm水系膜過濾。

2、制備對照品溶液：

(1)海藻酸鈉水解：

分別準(zhǔn)確稱取海藻酸鈉5mg、10mg、15mg、20mg、25mg于水解瓶中，再分別加1ml蒸餾水溫?zé)岢浞秩芙猓ㄈ?，后分別移取1ml于20ml容量瓶中，加入5ml濃度為95％的濃硫酸，然后于90℃水浴中水解90min取出后冷卻至室溫，加5ml水稀釋后再置于90℃水浴中繼續(xù)水解90min；

(2)對照品的衍生：

分別將步驟(1)獲得的各水解產(chǎn)物置于冰水浴中冷卻，然后用8mol/L的氫氧化鈉溶液中和，調(diào)pH值至中性，然后分別轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶定容，取1ml溶液于10ml容量瓶中加入2mol/L的氫氧化鈉溶液5ml和2mol/L的對氨基苯甲酸(p-AMBA)溶液5ml，混勻后于80℃水浴中衍生90min，后放至室溫，用0.3mol/L的醋酸中和，然后用水定容至10ml，備用；

(3)對照品的預(yù)處理：

在冰水浴中，分別取步驟(2)所得的各溶液2ml置于20ml水解瓶中，分別加入4ml三氯甲烷渦旋混勻，放置60min萃取多余的p-AMBA，然后棄去三氯甲烷層，反復(fù)萃取4次，取上層清液經(jīng)0.60μm水系膜過濾；分別得到濃度為20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的對照品溶液。

3、高效液相色譜儀測定：

測定對照品溶液和供試品溶液的紫外吸收響應(yīng)值，根據(jù)峰保留時間定性，并根據(jù)峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量；

色譜條件：C18色譜柱，150mm×4.6mm，5μm；

柱溫：70℃；

流速：0.5mL/min；

紫外檢測器波長：300nm；

進(jìn)樣體積：20μL；

流動相：乙腈與50mmol/L的磷酸二氫鉀緩沖液的體積比為25：75。

4、數(shù)據(jù)結(jié)果：

由圖4可以看出，供試品和對照品出現(xiàn)的峰高較低，峰不對稱，因此供試品和對照品用p-AMBA衍生分離效果不好。