本發(fā)明屬于免疫檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及檢測血清中C-反應(yīng)蛋白(CRP)含量的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

C-反應(yīng)蛋白(C-reactiveprotein，CRP)由肝細(xì)胞合成，在胎兒期產(chǎn)生，非母體胎盤傳遞。其產(chǎn)生機(jī)理是：當(dāng)機(jī)體受感染或組織受損傷時巨噬細(xì)胞和其他白細(xì)胞等被激活，產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子TNF-a等細(xì)胞因子及其他介導(dǎo)物，這些細(xì)胞因子和介導(dǎo)物到達(dá)肝臟，刺激肝細(xì)胞和上皮細(xì)胞合成CRP。在結(jié)構(gòu)上，CRP含5個多肽鏈亞單位，非共價地結(jié)合為盤形多聚體，分子量為11.5萬～14萬，CRP是一種典型的急性時相蛋白。

常規(guī)CRP測定包括定性、半定量和定量分析，可用于評價感染，組織損傷和炎癥性疾病。對于常規(guī)的CRP測定，參考值通常被認(rèn)為是臨床上含量高于10毫克/升。在健康人群血液中CRP水平低于5毫克/升，而在各種條件下，急性炎癥4～8小時內(nèi)，CRP值達(dá)到約20至500毫克/升。常規(guī)CRP作為急性炎癥評估指標(biāo)比紅細(xì)胞沉降率(ESR)和白細(xì)胞計數(shù)更敏感、更可靠。

超敏C反應(yīng)蛋白常見的用途可作為心血管疾病風(fēng)險識別的輔助手段。配合傳統(tǒng)的急性冠脈綜合征臨床診斷使用，可作為冠狀動脈疾病或急性冠脈綜合征復(fù)發(fā)的預(yù)警指示物。

人類在組織損傷的急性期，肝臟合成的一些血漿蛋白顯著增加，這些蛋白質(zhì)通稱為急性時相蛋白，C反應(yīng)蛋白(CRP)是急性時相蛋白中變化最顯著的一種。

CRP在正常人血清中其含量極微；在組織受到損傷、炎癥、感染或腫瘤破壞時CRP可以在數(shù)小時內(nèi)急劇上升，CRP被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的早期診斷及鑒別診斷，其升高可見于：1、組織損傷、感染、腫瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎癥性疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性血管炎、多肌痛風(fēng)濕?。?、術(shù)后感染及并發(fā)癥的指標(biāo)：手術(shù)后病人CRP升高，術(shù)后7-10天CRP水平應(yīng)下降，如CRP不降低或再次升高，提示可能并發(fā)感染或血栓栓塞；3、可作為細(xì)菌性感染和病毒性感染的鑒別診斷：大多數(shù)細(xì)菌性感染會引起患者血清CRP升高，而病毒性感染則多數(shù)不升高。近年來研究發(fā)CRP水平還同未來發(fā)生心血管疾病密切相關(guān)，大量研究資料表明，動脈粥樣化也是一個慢性炎癥過程，CRP輕度升高與冠狀動脈事件、中風(fēng)及周圍血管病相關(guān)，是一項獨(dú)立的危險因素；高敏CRP(Hs-CRP)水平升高者發(fā)生急性腦卒中的幾率是正常健康人的2倍，發(fā)生心肌梗死的幾率是正常者的3倍。2003年歐洲高血壓防治指南(ESH/ESC)正式推薦，高血壓患者需檢測hs-CRP水平。

超敏C反應(yīng)蛋白線性范圍低端低于常規(guī)CRP，這種較低的范圍可擴(kuò)大使用適應(yīng)癥，C反應(yīng)蛋白是非特異性的，必須結(jié)合臨床癥狀綜合評估，不能作為特定的疾病或疾病的風(fēng)險的確診依據(jù)。

現(xiàn)有技術(shù)中，C-反應(yīng)蛋白的檢測時間長、操作復(fù)雜、重復(fù)性差、不適于急診和臨床病人及時診斷的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中，C-反應(yīng)蛋白的檢測時間長、操作復(fù)雜、重復(fù)性差、不適于急診和臨床病人及時診斷的需要的問題，提供一種準(zhǔn)確度高的采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法測定人血清中骨鈣素(BGP)含量的試劑盒。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種全程C-反應(yīng)蛋白的測試試劑盒，包括主試劑包、標(biāo)準(zhǔn)曲線卡、和質(zhì)控品質(zhì)控單組成；

主試劑包包括以下組分：

校準(zhǔn)品，所述校準(zhǔn)品為添加了不同量CRP抗原的含BSA的緩沖液的校準(zhǔn)品、

CRP抗試劑A，所述CRP抗試劑A為異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CRP抗體連結(jié)物，含BSA的緩沖液；

CRP抗試劑B，所述CRP抗試劑B為堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的CRP抗體連結(jié)物，含BSA的緩沖液；

磁微粒試劑，所述磁微粒試劑為磁微粒與羊抗FITC抗體連接物、含BSA的緩沖液；

質(zhì)控品，所述質(zhì)控品為分別添加了不同量的CRP抗原的含BSA的緩沖液；

分別配制校準(zhǔn)品、CRP抗試劑A、CRP抗試劑B、磁微粒試劑，獨(dú)立地置于包裝容器內(nèi)，得到全程C-反應(yīng)蛋白的測試試劑盒；

主曲線卡為含6個濃度梯度校準(zhǔn)點(diǎn)及對應(yīng)發(fā)光值，用于擬合生成主曲線；

質(zhì)控品質(zhì)控單提供質(zhì)控品質(zhì)控范圍。

進(jìn)一步的，該試劑盒還包括樣本稀釋液，所述樣本稀釋液為BSA的溶液。

進(jìn)一步的，該試劑盒還包括濃縮清洗液，所述濃縮清洗液是含有Tris、NaCl和表面活性劑的緩沖液。

進(jìn)一步的，該試劑盒還包括發(fā)光底物溶液，所述發(fā)光底物溶液是含LumigenAPS-5發(fā)光液的緩沖液。

本發(fā)明所提供的試劑盒檢測時需要對待測樣品進(jìn)行前處理，處理方法包括以下步驟：

1、樣品前處理

對臨床血清，3000rpm離心5分鐘，取上層液即可進(jìn)行分析測定。待測樣品2-8℃存放不得超過48小時，若48小時未檢測，應(yīng)于-20℃以下保存，但不應(yīng)超過30天。

2、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)前需將所有試劑放置至室溫；準(zhǔn)備好一次性平底試管和磁分離器及溫育時用于覆蓋磁分離器的塑料膜；調(diào)節(jié)水浴箱溫度為37℃；準(zhǔn)備化學(xué)發(fā)光測定儀，并仔細(xì)閱讀儀器使用說明書。

3、試劑準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)前將試劑盒中各試劑置混勻儀上充分混勻；磁微粒試劑混勻后應(yīng)為均勻懸濁液，無明顯凝集。

4、利用上述檢測CRP的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒檢測樣品。本發(fā)明的檢測方法如下：

該全程C-反應(yīng)蛋白的測試試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

(1)加樣與免疫反應(yīng)：取三支試管分別加入15μL校準(zhǔn)品、15μL質(zhì)控品和15μL待測樣本；

(2)、每支試管中加入30μL抗試劑A和30ul抗試劑B,用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，混勻后，置于37℃下水浴15min；

(3)、每支試管中加入30μL磁微粒試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，置37℃下水浴5min；

(4)洗滌：將試管在磁分離器上靜置2分鐘，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干；

(5)、每管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，混勻后，將平底試管在磁分離器上靜置2分鐘，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干；重復(fù)3次；

(6)每個試管加入200μL發(fā)光底物，振蕩混勻3s，用化學(xué)發(fā)光儀檢測發(fā)光強(qiáng)度。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、使用磁珠為固相，使免疫反應(yīng)更接近液相，反應(yīng)更充分和迅速，而且使結(jié)合的免疫復(fù)合物更加容易分離，降低了非特異性吸附。

2、使用的抗試劑為單克隆抗體混合物，使免疫反應(yīng)的親和力更高，而且單抗的生產(chǎn)批間差異相對小，更容易保證產(chǎn)品的批間穩(wěn)定。

3、使用化學(xué)發(fā)光底物溶液，使檢測的靈敏度得到了提高，而且線性范圍更寬。

4、本方法的建立可以為其他試劑盒的開發(fā)提供一種方便、高靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的免疫檢測方法。

本發(fā)明的主要創(chuàng)新之處在于：

1、本發(fā)明試劑盒將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達(dá)到了較佳的性能參數(shù)。

2、試劑盒中的磁微粒試劑、抗試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、清洗濃縮液、發(fā)光底物溶液及樣本稀釋液是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。

本發(fā)明的檢測CRP的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒主要采用直接夾心法定量檢測人血清等樣品中CRP的含量；對樣品的前處理要求低，前處理過程簡單，能快速、高通量檢測大批樣品；采用了高特異的單克隆抗體和超順磁、高分散、比表面積大的磁微粒子，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便利。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下：

1、臨床上常規(guī)CRP檢測試劑盒，其最低檢測限一般為3～5mg/L，靈敏度較低。本發(fā)明所述試劑盒靈敏度比較高，線性范圍比較寬，可同時對感染性疾病、心腦血管疾病等進(jìn)行診斷。

2、本發(fā)明試劑盒將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有更高的特異性，靈敏度，獲得檢測結(jié)果的時間短，操作方式簡便。

3、本發(fā)明與其他常規(guī)檢測方法相比，具有穩(wěn)定性好、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)勢。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例

一、磁珠緩沖液配制操作規(guī)程：以配制1L為例：

1、根據(jù)配制量，選擇合適容器，加入0.7kg700ml的純水；

2、稱取Tris 6.02g，NaN3 0.99g于容器中，混勻，室溫攪拌2小時；

3、檢測溶液pH，應(yīng)在10左右；

4、調(diào)制pH值為8.0；

5、量取Tween-20 2.76ml；稱取硫酸新霉素0.99g；四環(huán)素0.03g；BSA 4.97g于容器中，攪拌1小時，調(diào)pH值至8.0±0.05；

6、定容至1L，調(diào)pH值至8.0±0.05；

7、用0.22um濾器過濾，貯存于4℃。

二、磁微粒試劑的制備過程

將直徑為0.1微米的四氧化三鐵微球用戊二醛進(jìn)行活化，室溫混勻4小時后，用0.01mol/L PBS pH7.4緩沖液清洗三次，并用該溶液進(jìn)行懸浮，濃度為50-100mg/ml；然后，每毫升懸液中加入羊抗FITC抗體100μg，于37℃混勻溫育3-8小時；用等體積的0.01mol/L PBS 5％BSA pH7.4緩沖液于37℃封閉40分鐘；最后，用0.5％BSA 0.02mol/L Tris-HCl pH8.0緩沖液清洗三次，并用上述磁珠緩沖液配制一定濃度的工作液。

二、堿性磷酸酶AP與抗CRP單克隆抗體的偶聯(lián)

抗體為免疫球蛋白，含有氨基(-NH2)，使用SMCC活化劑進(jìn)行活化，生成馬來酰亞胺-免疫球蛋白；馬來酰亞胺-免疫球蛋白含有可以與-SH基團(tuán)反應(yīng)的馬來酰亞胺基團(tuán)，加入含有-SH的堿性磷酸酶，可以將抗體與堿性磷酸酶連接在一起。

三、異硫氰酸熒光素FITC與抗AFP單克隆抗體的偶聯(lián)

FITC分子與CRP單克隆抗體的偶聯(lián)物是以常見的堿性液標(biāo)記法對抗體進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時，蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一般最多能結(jié)合15-20個，一個IgG分子可結(jié)合2-8個分子的FITC，其反應(yīng)式如下FITC-N＝C＝S+-NH2-蛋白質(zhì)→FITC-NS-C-NH2-蛋白質(zhì)

四、校準(zhǔn)品/質(zhì)控品的配制：

1、最高點(diǎn)：最高濃度點(diǎn)為X，目標(biāo)點(diǎn)濃度為A，B，C，D，E，F(xiàn)，配制V體積溶液時，需加入原料的體積分別如表1所示；

表1校準(zhǔn)品的配制

2、全程C-反應(yīng)蛋白(CRP)測定試劑盒CRP校準(zhǔn)品原料(濃度為100ug/ml)用樣本稀釋液(具體配方見實(shí)施例6)配制成濃度點(diǎn)為6個濃度點(diǎn)。

3、完全溶解后，貼好標(biāo)簽于2-8℃保存，有效期為12個月。

五、清洗濃縮液配制操作規(guī)程：以配制1L為例：

1、根據(jù)配制量，選擇合適的容器，加入出水700ml，稱取Tris 12.11g；NaCl 312.43g；Tween-20 27.74g；Bronidox 1g；Triton X-1001g；

2、放置18小時，調(diào)pH至8.6±0.05；加純水至1L，過濾。

3、使用時進(jìn)行15倍稀釋。

六、發(fā)光底物溶液配制操作規(guī)程：以配制1L為例：

1、根據(jù)配制量，選擇合適的容器，稱取Tris 36.36g；Na2SO3 10mg；SDS 1.0g；光澤精3.27mg；Tween-20 0.31ml調(diào)pH至9.35；加純水至1L，過濾。

2、測試發(fā)光值

七、樣本稀釋液配制操作規(guī)程：以配制1L為例：

1、加入500ml純水于容器中，稱取三羥基氨基甲烷6g；NaCl 8.8g；BSA 60g；Proclin 300 1ml，調(diào)pH至7.5±0.05。

2、純水定容至1L，過濾。

檢測結(jié)果：

檢測曲線見圖1。

對零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行20次重復(fù)測試，取零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)測定的平均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差，即為其靈敏度。本方法的靈敏度為≤1ug/ml。

臨床試驗(yàn)

一、檢測結(jié)果分析

1.由于方法學(xué)或抗體特異性等原因，使用不同生產(chǎn)商的試劑對同一份樣本進(jìn)行檢測可能會得到不同的檢測結(jié)果，因此，用不同試劑檢測所得結(jié)果不應(yīng)直接相互比較，以免造成錯誤的醫(yī)學(xué)解釋。

2.質(zhì)控品可作為當(dāng)次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度的參考依據(jù)，其測定值應(yīng)在本批產(chǎn)品的質(zhì)控單允許的范圍之內(nèi)。當(dāng)檢測結(jié)果靠近參考值范圍的上限值時，可考慮對樣本進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。

3.本試劑的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

4.CRP是一種急性時相性反應(yīng)蛋白，在炎癥、組織損傷時常迅速升高。由于它具有活化補(bǔ)體和促進(jìn)吞噬的功能，因此在非特異的抗感染方面可起重要作用。血清中CRP含量升高可見于多種病理情況：

感染：手術(shù)后感染，SLE或白血病并發(fā)感染，新生兒或嬰兒敗血癥，細(xì)菌性腦膜炎，兒童有癥狀的尿路感染，各種細(xì)菌、病毒、支原體感染。

炎癥、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫病、風(fēng)濕熱、心肌梗塞、肺梗塞、惡性腫瘤、燒傷等疾病均可引起血清CRP水平增高。

二、本發(fā)明試劑盒性能指標(biāo)

1.線性

線性范圍(0.6～175.0)ng/mL，相關(guān)系數(shù)r≥0.9900。

2.準(zhǔn)確度

偏差≤±10％。

3.最低檢測限

最低檢測限≤0.5ng/mL。

4.重復(fù)性

變異系數(shù)CV≤8％。

5.批間差變異系數(shù)CV≤15％。

6.單位換算

mg/L＝1000ng/mL。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。