本發(fā)明屬于生物診斷領(lǐng)域，具有的涉及一種用于腎臟損傷檢測(cè)用試劑盒。

背景技術(shù)：

視黃醇結(jié)合蛋白(Retinol Binding Protein,RBP)為血液中視黃醇(維生素A)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。1961年Berggard在免疫電泳中發(fā)現(xiàn)在α2-球蛋白區(qū)域能形成一條長(zhǎng)沉淀線的蛋白質(zhì)，曾稱為長(zhǎng)α2-球蛋白。在以后幾十年中，人們對(duì)這種蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性等進(jìn)行了全面研究，發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)廣泛地分布于正常人體液中，屬α1-球蛋白，具有從肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)視黃醇至周圍組織的功能。目前，認(rèn)為血液中RBP主要以視黃醇、前白蛋白結(jié)合的復(fù)合物形式存在，當(dāng)復(fù)合物中視黃醇與靶細(xì)胞結(jié)合后，RBP便與前白蛋白分離，自腎小球?yàn)V出，由近端腎小管上皮細(xì)胞吸收、降解。因此正常人尿液中幾乎不含有RBP(含量低于300ng/ml)，若腎小管病變，則重吸收功能下降，會(huì)導(dǎo)致尿液中的RBP大量上升。因此，在腎小管操作病人尿液中RBP含量大于300ng/ml，一般可達(dá)到正常人的5倍以上，嚴(yán)重者其尿液中的RBP含量甚至可以達(dá)到100000ng/ml以上。近年來的研究表明，RBP含量改變能夠敏感地反映近端腎小管功能、肝功能損害程度，是反映腎臟、肝臟及營(yíng)養(yǎng)性疾病發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的敏感指標(biāo)。

血液中游離的RBP可以從腎小球?yàn)V過，其中99.9％經(jīng)近曲小管上皮細(xì)胞重吸收、降解。正常情況下，尿液中RBP排泄量甚微(低于300ng/mL)。若腎小管病變，則重吸收功能下降，會(huì)導(dǎo)致尿液中的RBP大量上升。在腎小管損傷病人尿液中，RBP含量大于300ng/mL，一般可以達(dá)到正常人的5倍以上，嚴(yán)重者其尿液中的RBP含量甚至可以達(dá)到10000ng/mL。故尿液中RBP增高具有早期診斷意義，被認(rèn)為是腎小管損傷的一個(gè)良好早期標(biāo)志物，對(duì)RBP的檢測(cè)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床上對(duì)腎臟損傷的診斷中。

RBP的臨床檢測(cè)意義還包括急性腎小球腎炎、慢性腎小球腎炎、糖尿病性腎病和慢性腎功能衰竭疾病等，其血清RBP的濃度水平均升高。同時(shí)RBP與肝臟病也有關(guān)系，RBP與血清膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活力均顯著負(fù)相關(guān)，壞死性肝硬化、膽汁性肝硬化及急、慢性肝炎患者的血清RBP水平均顯著低于正常對(duì)照組。

傳統(tǒng)的RBP的測(cè)定方法主要有酶聯(lián)免疫法、放射免疫法及乳膠免疫比濁法。免疫比濁法因其試劑穩(wěn)定，容易實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高通量及操作自動(dòng)化，且檢測(cè)結(jié)果快速、準(zhǔn)確、可靠，因此成為臨床實(shí)驗(yàn)室最具前景的測(cè)定方法。

對(duì)于RBP的測(cè)定，現(xiàn)廣泛采用ELISA法；此法簡(jiǎn)便快速，而這種檢測(cè)方法是基于將視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)免疫綿羊獲得的抗體來實(shí)現(xiàn)的。但是這種傳統(tǒng)意義上的抗體穩(wěn)定性差、靈敏度低、生產(chǎn)成本高，所有因素均限制了對(duì)于視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的檢測(cè)。1993年比利時(shí)科學(xué)家首次在Nature報(bào)道:在駱駝血液中的抗體，有一半沒有輕鏈，而且更讓人驚喜的是，這些缺失輕鏈的"重鏈抗體"能像正常抗體一樣與抗原等靶標(biāo)緊密結(jié)合，另外不像scFv那樣互相沾粘，甚至聚集成塊。這種抗體只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，更重要的是單獨(dú)克隆并表達(dá)出來的VHH區(qū)具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與抗原結(jié)合活性，分子量只是普通抗體的1/10,所以VHH也稱Nanobody(單域抗體)；與此同時(shí)單域抗體化學(xué)性質(zhì)也更加靈活，穩(wěn)定性好，可溶性高，表達(dá)容易且利用微生物即可大量地獲得，容易偶聯(lián)其他分子，因此應(yīng)用單域抗體為研發(fā)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)檢測(cè)試劑具有廣闊的前景。

CN103864927A中公開了視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體編碼序列及其應(yīng)用，但是該抗體仍然存在一定的缺陷，效價(jià)仍然存在一定的提高空間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供針對(duì)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)具有更高結(jié)合特性的的突變的單域抗體，同時(shí)提供該單域抗體在制備檢測(cè)的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種抗體突變的方法，包括結(jié)合抗體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析，針對(duì)CDR區(qū)結(jié)構(gòu)的殘基進(jìn)行計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)模擬，通過改變CDR結(jié)構(gòu)域的殘基是否突變以及突變的方向，將以往需要多輪突變篩選或是通過噬菌體庫篩選突變的方式大大簡(jiǎn)化，將所有突變選擇集中在一起進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析及其可行性，直接一步獲得最終的突變方案。因此相比以往方法，本方法更加簡(jiǎn)捷明確。

本發(fā)明提供一種原始的單域抗體，其VHH鏈序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明針對(duì)所述的單域抗體，發(fā)現(xiàn)其VHH鏈氨基酸中的第26位、第28位、第32位、第51位、55位、57位、100位、106位、110位、115位是抗體中提高抗體性能的決定性位點(diǎn)。

本發(fā)明另外提供一種改造后的抗體，所述抗體的VHH鏈分別是在SEQ ID NO：1所示序列的基礎(chǔ)上，分別在Lys26Gly、Pro28Cys、Ser32Met、Met51Gly、Thr55Val、Ser57Gln、Leu100Thr、Arg106Asp、Tyr110Leu、Tyr115Met進(jìn)行了突變。

本發(fā)明另外提供一種具體的突變組合為：Lys26Gly和Leu100Thr、Pro28Cys和Arg106Asp、Ser32Met和Met51Gly、Lys26Gly和Thr55Val、Pro28Cys和Ser57Gln、Ser32Met和Thr55Val、Ser32Met和Leu100Thr、Ser32Met和Arg106Asp、Met51Gly和Leu100Thr、Met51Gly和Arg106Asp、Met51Gly和Tyr110Leu、Met51Gly和Tyr115Met、Thr55Val和Leu100Thr、Thr55Val和Arg106Asp、Thr55Val和Tyr110Leu、Thr55Val和Tyr115Met、Ser57Gln和Leu100Thr、Ser57Gln和Arg106Asp、Ser57Gln和Tyr110Leu、Ser57Gln和Tyr115Met。

本發(fā)明另外一方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì)：本發(fā)明所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的突變的單域抗體的VHH鏈，或本發(fā)明所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)突變單域抗體。

本發(fā)明的另外一方面，提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有表達(dá)上述VHH鏈的編碼鏈。

本發(fā)明的另外一方面，提供了本發(fā)明所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)突變單域抗體用于檢測(cè)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的用途。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：本發(fā)明將視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體通過三維建模尋找到了最優(yōu)的對(duì)抗體結(jié)合起到最大功能的位點(diǎn)，通過特定位點(diǎn)的點(diǎn)突變獲得了一系列的突變抗體，所述的抗體相對(duì)于原始的抗體，具有更好的結(jié)合結(jié)合特性以及結(jié)合的準(zhǔn)確性，具有不可以預(yù)料的效果。同時(shí)將突變后的抗體去制備用于檢測(cè)視黃醇結(jié)合蛋白的試劑盒，具有更好的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1抗體突變位點(diǎn)的選定

首先，針對(duì)SEQ ID NO：1的VHH鏈進(jìn)行抗體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析，針對(duì)CDR區(qū)結(jié)構(gòu)的殘基進(jìn)行計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)模擬，發(fā)現(xiàn)，VHH鏈氨基酸中的第26位、第28位、第32位、第51位、55位、57位、100位、106位、110位、115位是抗體中提高抗體性能的決定性位點(diǎn)。

通過建模，發(fā)現(xiàn)，在以上位點(diǎn)進(jìn)行特定氨基酸的突變，可以提高與視黃醇結(jié)合蛋白的結(jié)合能力，這些具體的突變形式分別為：Lys26Gly(表示在SEQ ID NO：1的第26位的Lys替換為Gly)、Pro28Cys、Ser32Met、Met51Gly、Thr55Val、Ser57Gln、Leu100Thr、Arg106Asp、Tyr110Leu、Tyr115Met、Lys26Gly和Leu100Thr、Pro28Cys和Arg106Asp、Ser32Met和Met51Gly、Lys26Gly和Thr55Val、Pro28Cys和Ser57Gln、Ser32Met和Thr55Val、Ser32Met和Leu100Thr、Ser32Met和Arg106Asp、Met51Gly和Leu100Thr、Met51Gly和Arg106Asp、Met51Gly和Tyr110Leu、Met51Gly和Tyr115Met、Thr55Val和Leu100Thr、Thr55Val和Arg106Asp、Thr55Val和Tyr110Leu、Thr55Val和Tyr115Met、Ser57Gln和Leu100Thr、Ser57Gln和Arg106Asp、Ser57Gln和Tyr110Leu、Ser57Gln和Tyr115Met任一一種形式。

實(shí)施例2突變抗體的制備

通過全序列合成的方式，獲得了編碼SEQ ID NO：1氨基酸序列的編碼核苷酸序列，在生物工程公司合成。采用定點(diǎn)突變法分三段擴(kuò)增帶有上述突變位點(diǎn)的序列，然后用搭橋PCR法，擴(kuò)增得到突變抗體RBP的編碼基因序列。將前面所獲得30種不同的單域抗體亞克隆至表達(dá)性的載體PET32a中，并將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)型宿主菌DE3中，其涂布在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基的板上，37℃過夜。(2)挑選單個(gè)菌落接種在10mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。(3)接種1mL的過夜菌種至300mL LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)到OD值達(dá)到0.9時(shí)，加入IPTG，28℃搖床培養(yǎng)過夜，(4)第二天，離心收菌。(5)將菌體破碎以獲得抗體粗提液。(6)經(jīng)鎳柱離子親和層析純化抗體蛋白，為獲得高純度的抗體，采用咪唑梯度洗脫法，低濃度咪唑洗脫液(50mmol)用于洗去雜帶，高濃度咪唑洗脫液(250mmol，500mmol)最終可制備純度達(dá)95％以上的蛋白。將蛋白濃度調(diào)整為100mg/ml。

實(shí)施例3抗體性質(zhì)分析

1、表面胞質(zhì)團(tuán)共振法測(cè)突變體抗體的結(jié)合常數(shù)Kd

抗原人血液中提取的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)(購(gòu)自南京匯標(biāo)生物科技有限公司)。利用Biacore 3000測(cè)突變后的抗體與抗原的絕對(duì)親和力。選用CM-5傳感片，表面吸附羧甲基葡聚糖。兩個(gè)流通池(pathway)均以20μ1/min的流速活化6min,將5μg抗原RBP溶于50mM pH7.0的磷酸溶液，以15μl/min的流速注入芯片流通池1，其表面密度約為10KRu，抗原標(biāo)記后再用1M乙醇胺將芯片表面封閉。結(jié)合條件：各檢測(cè)抗體原液濃度為1Omg/ml,依次稀釋成200μg/ml,100μg/ml,50μg/ml,25μg/ml,12μg/ml,0μg/ml,以10μl/min的速度注入芯片的兩個(gè)流通池,上樣3min；解離條件：流速10μl/min,解離3min。芯片再生條件：10mM NaOH,1M NaCl。用Biacore evaluation軟件分析抗體親和常數(shù)KD。結(jié)果如下：

從以上結(jié)果可以看出，經(jīng)過突變后的抗體其親和常數(shù)得到大大的提高，對(duì)于抗原的結(jié)合能力也提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。但是針對(duì)位點(diǎn)的突變，也不是任一的突變都具有提高抗體親和力的效果，比如Tyr27Ser、Ser57Met、Arg106Leu均導(dǎo)致抗體的親和力大幅度的降低，其它的位點(diǎn)突變也不能提高抗體的親和力，在此不一一列舉。

實(shí)施例4：視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)突變的單域抗體檢測(cè)特異性分析：

(1)將視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)前白蛋白包被在酶標(biāo)板上，同時(shí)做空白孔對(duì)照，各包被兩個(gè)孔，將相應(yīng)的突變的單域抗體及對(duì)照抗體前白蛋白單域抗體分別轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗原包被的ELISA板中，在室溫下放置1小時(shí)。(2)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入一抗mouse anti-HA tag antibody(抗鼠抗HA抗體，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，在室溫下放置1小時(shí)。(3)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate(山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，購(gòu)自艾美捷科技有限公司)，在室溫下放置1小時(shí)。(4)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，于ELISA儀上，在405nm波長(zhǎng)，讀取吸收值。結(jié)果顯示視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)突變的單域抗體能特異性的識(shí)別RBP，而對(duì)照不能結(jié)合RBP。說明本發(fā)明的制備的到的突變抗體，能夠特異性的用于檢測(cè)RBP。

以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

〈110〉查文娟

〈120〉一種用于腎臟損傷檢測(cè)用試劑盒

〈160〉1

<210> 1

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Lys Tyr Pro Tyr Ser Gly Ser

20 25 30

Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Met Phe Thr Gly Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asn Val Ala Lys Asn Thr Leu Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Asp Leu Leu Pro Arg Ser Thr Arg Cys Leu Asp Tyr Gly Leu

100 105 110

Arg Thr Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125