本發(fā)明涉及一種香味物質的檢測方法，特別涉及一種簡化定量香稻香味特征物質2-乙酰-1-吡咯啉含量的氣相質譜聯(lián)用方法。

背景技術：

香稻，以其清香可口而深受國內外消費者喜愛，市場上優(yōu)質香米售價一般是普通稻米的2～3倍。香稻資源豐富、栽培歷史悠久，幾乎遍及世界各稻米生產國，印度、泰國、巴基斯坦、越南、日本和美國等都有自己的優(yōu)質香稻品種；如印度的巴斯馬蒂香稻(Basmati)，泰國的Khao Dawk Mail105，澳大利亞的Goolarah,美國的Della，伊朗Sadri，日本的祝賀，中國的萬年香米等均是著名的香稻品種類。對香稻研究已三十有余，迄今已報道的香稻中的香味揮發(fā)物有200余種，只確定少數(shù)幾種與米飯的香味或風味有關(Champage,2008；Cho等2014)。美國威斯頓地區(qū)研究中心(WRRC)Buttery等1982年首次分離和鑒定出水稻香味的主要成分：2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline，2AP)，并提出此物質是幾個亞洲水稻品種呈爆米花香味的緣由。Lin et al.,(1990),Ahmed et al.,(1995)和Tanchotikul and sieh(1991)也有與Buttery類似的報道。Jezussek et al.,(2002),Laguerre et al(2007),Ajarayasiri and Chaiseri(2008),Maraval et al(2008),Yang et al(2008),Mathure et al(2014)均確認2-乙酰-1-吡咯啉是香味重要特征物。國內外開展稻米氣味分析已有20余年，但絕大多數(shù)實驗室在稻米氣味的采收集步驟中采用同步蒸餾-萃取法和吸附劑捕集法。而同步蒸餾-萃取法和吸附劑捕集法均存在操作步驟繁雜、樣品和試劑消耗量大、費時費力、目標干擾物較多等缺點。其中同步蒸餾-萃取法是個加熱對流提取目標物的方法，因此，該法存在目標物分解、丟失和轉化的風險。而固相微萃取技術是一種直接從樣品基體中提取目標物，集萃取、分離、濃縮、進樣于一體，無需加熱，無有機試劑消耗的技術，具有操作簡便、樣品用量少、省時省力、干擾物共提少、重現(xiàn)性好、精度高等優(yōu)點。如，國內應興華等(分析測試學報,2011,27,69-71)報道用手動固相微萃取后轉移至氣相進樣口,轉移過程易出現(xiàn)損失；且采用樣品的量是8g,提取時間是0.2h,易造成提取不充分等。如，國外1991Tanchotikul and Hsien(J.Agric.Food Chem,1991,39,944-947)報道用氣相-質譜聯(lián)用儀定量2-AP，但前處理用的蒸餾和試劑萃取提取方法，內標TMP直接加入樣品一起進行前處理，這不僅容易造成目標物分解等損失，且樣品用量還是需量是1g。2001年Mahatheeranont(J.Agric.Food Chem,2001,49,773-779)等報道用減壓間接蒸餾和試劑萃取法，此前處理可以降低試劑沸騰造成目標物的損失，但并非完全阻止目標物的其它非高溫造成的分解等損失；且樣品量和內標物TMP加量分別達到0.5g和0.008mg,加量高，且定量是沒有考慮到TMP的轉化因子(即直接進樣與前處理后進樣的出峰效率之比)。2001年Grimm等(J.Agric.Food Chem,2001,49,245-249)報道用自動固相微萃取，但樣品的量還是高達0.75g,且此定量方法中TMP的回收率小于0.3％。Sriseadka等2006年(J.Agric.Food Chem,2006,54，8183-8189)和Maraval等2010(Analytical Chinica Acta,675,148-155)均報道用固相微萃取前處理。前者用的2,6-Dimethylpyridine作為內標，后者用2AP-d₂作為內標；均用2-AP作為定量標準曲線；由于2-AP不穩(wěn)定，容易分解，且此純品不易得到，在實際一般實驗室操作中有一定的難度。Sriseadka等2006為避免2-AP的分解，樣品的萃取溫度只有27℃，而此溫度對米粉中的2-AP萃取效率并不高。Maraval定量標準曲線用的2-AP(用的是0.5g磨碎水稻葉片作為基質)來定量米粉的2-AP濃度，一則兩基質效應是不完全等同，二是樣品的稱樣量為0.5g。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種簡化定量香稻香味特征物質2-乙酰-1-吡咯啉含量的氣相質譜聯(lián)用方法，該方法直接用TMP做標準曲線，可以對2-乙酰-1-吡咯啉含量進行定量分析,重復性好,檢出限低。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種簡化定量香稻香味特征物質2-乙酰-1-吡咯啉含量的氣相質譜聯(lián)用方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

步驟1：稻米粉的前處理，糙米磨成過0.42mm或0.59mm細度篩的米粉；

步驟2：樣品稱樣量為50mg-100mg,加2,4,6三甲基吡啶(TMP)為內標,加量為5-20ng,入頂空樣品瓶；

步驟3:進行自動固相微萃取階段，萃取分為三階段：

第一階段：80℃保持預加熱5-10min；

第二階段：采用萃取頭以80℃,轉速250rpm/min,搖20S,停5S的間隔步驟，萃取頭入進樣瓶的距離為22mm，此萃取階段持續(xù)30min；

第三階段：萃取物直接入氣質聯(lián)用儀的進樣口,進樣時間為1min,進樣溫度為260℃，萃取頭入自動固相微萃取進樣烘烤位置以高溫260℃凈化萃取頭5min；

步驟4:進入氣質聯(lián)用儀進行分析，

步驟5:內標物TMP定標曲線，

步驟6：相對回收因子(relative recovery factor,RRF)建立

采用與步驟5相應的TMP濃度直接進樣，得到的出峰面積與相應步驟5中得到峰面積之比的平均值，1/平均值＝RRF；

步驟7：樣品2-AP含量計算

C＝R/RRF/((W(1-M％))

其中R為根據(jù)步驟5中計算得到的質量μg；

RRF為步驟6得到值；

W為樣品稱量，g；

M為樣品水分含量；其中C單位為mg/kg(ppm)。

本發(fā)明的方法，采用同一根萃取頭(一般一根萃取頭是用100次左右)，樣品的重復性標準差小于2.0％，樣品的再現(xiàn)性標準差小于10.0％。樣品的檢出濃度為0.035mg/kg-3.50mg/kg。此方法的檢出限(S/N＝3)為0.001mg/kg。

作為優(yōu)選，步驟3的第二階段中，萃取頭型號為fiber carboxen/divinybenzene/polydimethylsiloxane,CAR/DVB/PDMS；50/30μm,1cm長。

作為優(yōu)選，步驟4中儀器設置參數(shù)如下:氣質接口溫度為250℃,離子源溫度為200℃，分離柱子采用Rxi-5Sil毛細柱，參數(shù)為30m×0.25mm×0.25μm，氣相程序升溫為50℃保持1min,然后以5℃/min升至120℃，后以20℃/min升至260℃,保持5min；質譜采用全掃描(scan)結合選擇離子監(jiān)測(SIM,selected ion monitoring)模式,掃描速度為10000,m/z范圍為40to 450，掃描間隔為0.05，離子監(jiān)測選擇離子通道為m/z 83，111和68，間隔為0.3，定量以出峰離子面積作為基礎，TMP的m/z 106離子作為定量的參考離子；2-AP的目標離子m/z 83作為定量離子,111和68作為定性離子；載氣為純度99.999％以上的氦,流速為36.3cm/sec；電子轟擊(EI)離子源,離子化能量為70eV；電子轟擊(EI)離子源,離子化能量為70eV。2-乙酰-1-吡咯啉物質的判定經NIST庫檢索，要與2-AP標準質譜圖匹配。

作為優(yōu)選，步驟5具體是，選擇三至五個濃度梯度的TMP量分別加入內有50mg不香糙米粉樣的頂空瓶內，并以106特征離子碎片作為參考離子。以加入的TMP濃度為縱坐標，相應的參考離子的出峰面積為橫坐標，建立標準曲線和線性方程，r≥0.9965。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明獨到之處是不僅是采用自動固相微萃取前處理，且減少了樣品的稱量樣，調整固相微萃取條件；且由于TMP性質與2-AP類似，穩(wěn)定不易分解；出峰保留時間與2-AP接近但不重疊且沒有干擾，因此直接利用TMP作標準曲線來定量2-AP。這樣，不僅在一般實驗室均可以操作，且定量2-AP數(shù)據(jù)重復性好，精確度高，檢測限低。

為了利用自動固相微萃取進樣器,簡化定量香稻特征香味物資2--乙酰-1-吡咯啉含量,克服以往手工固相微萃取后再轉移進樣的步驟繁瑣和易損失的問題,和2-AP物質的合成純度不高，不穩(wěn)定性以及一般實驗室不易自己合成和純度、穩(wěn)定性的解決。本發(fā)明提供了自動固相微萃取的提取條件和氣質儀器參數(shù),直接用TMP做標準曲線，可以對2-乙酰-1-吡咯啉含量進行定量分析,重復性好,檢出限低,在水稻品質改良，香味遺傳研究以及食品香味工藝等均有很好的應用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明香稻樣品的總離子流色譜圖；

圖2是本發(fā)明香稻、空白和TMP出峰出峰圖；

圖3為2-AP的質譜圖；

圖4為5個濃度梯度的TMP的標準曲線；

圖5是香稻樣品的總離子流色譜圖；

圖6為2-AP的質譜圖；

圖7是4個濃度梯度的TMP的標準曲線。

具體實施方式

下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設備和原料等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。

實施例1

一種簡化定量香稻特征香味物資2--乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量的氣相質譜聯(lián)用方法，包括如下步驟：

步驟1:稻米粉的前處理，糙米磨成過0.42mm細度篩的米粉；

步驟2：樣品稱樣量為50mg,加2,4,6三甲基吡啶(TMP)為內標,加量為20ng,入20毫升螺紋口頂空樣品瓶，用含PTFE/藍色硅膠隔墊的磁性金屬蓋擰緊。

步驟3:進行自動固相微萃取階段，萃取分為三階段：

第一階段：80℃保持預加熱10min；

第二階段：采用萃取頭型號為fiber(carboxen/divinybenzene/polydimethylsiloxane,CAR/DVB/PDMS；50/30μm,1cm長)以80℃,轉速250rpm/min,搖20S,停5S的間隔步驟。萃取頭入進樣瓶的深度距離為22mm。此萃取階段持續(xù)20min-30min。

第三階段：萃取物直接入氣質聯(lián)用儀的進樣口,進樣時間為1min,進樣溫度為260℃。萃取頭入自動固相微萃取進樣烘烤位置以高溫260℃凈化萃取頭5min。

步驟4:進入氣質聯(lián)用儀進行分析,儀器設置參數(shù)如下:

氣質接口溫度為250℃,離子源溫度為200℃。分離柱子采用Rxi-5Sil毛細柱(30m×0.25mm×0.25μm)。氣相程序升溫為50℃保持1min,然后以5℃/min升至120℃,后以20℃/min升至260℃,保持5min。質譜采用全掃描(scan)結合選擇離子監(jiān)測(SIM,selected ion monitoring)模式,掃描速度為10000,m/z范圍為40to 450，掃描間隔0.05。離子監(jiān)測選擇離子通道為m/z68，83，111，間隔為0.3。載氣為高氦(99.999％),流速為36.3cm/sec。電子轟擊(EI)離子源,離子化能量為70eV。定量以出峰離子面積作為基礎。TMP的106離子作為定量的參考離子；2-AP的目標離子83作為定量離子,111和68作為定性離子。

步驟5:內標物TMP定標曲線

選擇5ng,8ng,10ng,15ng,20ng五個梯度的TMP量加入20毫升頂空瓶(內有50mg不香糙米粉樣)，按步驟3，4操作，并以106參考離子出峰面積與含量作系列標準曲線，r＝0.9912,y＝63972*X+65633,其中x為含量ng,y為2-AP的83目標離子出峰面積，經計算為5.44ng,5.29ng,5.64ng三個重復值,平均值為5.46ng。

步驟6：相對回收因子(relative recovery factor,RRF)建立

采用5，8，10，15，20ng量的TMP直接進樣，得到的出峰面積與相應步驟5中得到峰面積之比的平均值，1/平均值＝0.526。

步驟7：樣品2-AP含量計算

C＝R/RRF/((W(1-M％))

＝5.46*0.001/0.526/0.05/0.86＝0.24mg/kg,

其中R為根據(jù)步驟5中計算得到的質量樣品中2AP的量，μg；RRF為步驟6得到的相對回收因子；，W為重量；M為水分含量；其中C單位為mg/kg(ppm)

SD＝0.77％。

圖1為香稻樣品的總離子流色譜圖,由圖可見2-AP出峰保留時間在6.12min，TMP的出峰時間為8.30min(箭頭處為2-AP)。圖2為香稻、空白和TMP出峰出峰圖，圖中1為空白(即空瓶)，2為空瓶加TMP，3為香稻加TMP。圖3為2-AP的質譜圖，分子離子峰為m/z 111，特征離子碎片為m/z 68和83，圖4為5個濃度梯度的TMP的標準曲線,計算公式為y＝63972*x+65633,其中x為TMP含量，y為出峰面積。

實施例2

一種簡化定量香稻特征香味物資2--乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量的氣相質譜聯(lián)用方法，包括如下步驟：

步驟1：稻米粉的前處理，糙米磨成過0.59mm細度篩的米粉；

步驟2：樣品稱樣量為100mg,加2,4,6三甲基吡啶(TMP)為內標,加量為5ng,入20毫升螺紋口頂空樣品瓶，用含PTFE/藍色硅膠隔墊的磁性金屬蓋擰緊。

步驟3:進行自動固相微萃取階段，萃取分為三階段：

第一階段：80℃保持預加熱10min；

第二階段：采用萃取頭型號為fiber(carboxen/divinybenzene/polydimethylsiloxane,CAR/DVB/PDMS；50/30μm,1cm長)以80℃,轉速250rpm/min,搖20S,停5S的間隔步驟。萃取頭入進樣瓶的距離為22mm。此萃取階段持續(xù)30min。

第三階段：萃取物直接入氣質聯(lián)用儀的進樣口,進樣時間為1min,進樣溫度為260℃。萃取頭入自動固相微萃取進樣烘烤位置以高溫260℃凈化萃取頭5min。

步驟4:進入氣質聯(lián)用儀進行分析,儀器設置參數(shù)如下:

氣質接口溫度為250℃,離子源溫度為200℃。分離柱子采用Rxi-5Sil毛細柱(30m×0.25mm×0.25μm)。氣相程序升溫為50℃保持1min,然后以5℃/min升至120℃,后以20℃/min升至260℃,保持5min。質譜采用全掃描(scan)結合選擇離子監(jiān)測(SIM,selected ion monitoring)模式,掃描速度為10000,m/z范圍為40to 450，掃描間隔為0.05。離子監(jiān)測選擇離子通道為m/z 83，111和68，間隔為0.3。定量以出峰離子面積作為基礎。TMP的m/z 106離子作為定量的參考離子；2-AP的目標離子m/z 83作為定量離子,111和68作為定性離子。載氣為高氦(99.999％),流速為36.3cm/sec。電子轟擊(EI)離子源,離子化能量為70eV。電子轟擊(EI)離子源,離子化能量為70eV。2-乙酰-1-吡咯啉物質的判定經NIST庫檢索，要與2-AP標準質譜圖匹配。

步驟5:內標物TMP定標曲線

選擇5ng,10ng,16ng,20ng五個梯度的TMP量加入20毫升頂空瓶(內有50mg不香糙米粉樣)，按步驟3，4操作，并以106參考離子出峰面積與含量作系列標準曲線，r＝0.999,y＝24712*X+14107,其中x為含量ng,y為2-AP的83目標離子出峰面積，經計算為2.41ng,2.33ng,2.28ng三個重復值,平均值為2.34ng。

步驟6：相對回收因子(relative recovery factor,RRF)建立

采用5，10，16，20ng量的TMP直接進樣，得到的出峰面積與相應步驟5中得到峰面積之比的平均值，1/平均值＝0.478。

步驟7：樣品2-AP含量計算

C＝R/RRF/((W(1-M％))

＝2.34*0.001/0.478/0.05/0.86＝0.114mg/kg,

其中R為根據(jù)步驟5中計算得到的質量樣品中2AP的量，μg；RRF為步驟6得到的相對回收因子；，W為重量；M為水分含量；其中C單位為mg/kg(ppm)

SD＝0.30％。

圖5是香稻樣品的總離子流色譜圖,由圖可見2-AP出峰保留時間在6.32min，TMP的出峰時間為8.34min。箭頭處為2-AP。圖6為2-AP的質譜圖，分子離子峰為m/z 111，特征離子碎片為m/z 68和83。圖7是4個濃度梯度的TMP的標準曲線,計算公式為y＝24712*x+14107,其中x為含量，y為出峰面積。

以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。