本發(fā)明涉及一種等重多重標(biāo)記定量方法，可實(shí)現(xiàn)最多六重蛋白質(zhì)樣品的同時(shí)大規(guī)模定量。該方法具有標(biāo)記效率高，標(biāo)記選擇性好，定量準(zhǔn)確度、精密度、覆蓋率高，動(dòng)態(tài)范圍寬，蛋白質(zhì)組定量分析的通量高等優(yōu)點(diǎn)?？梢杂糜诖髽悠妨可飿悠?、生物體動(dòng)態(tài)過程的蛋白質(zhì)組定量分析。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)含量的變化可以反映生命過程、揭示疾病狀態(tài)，探究該變化可以為尋找藥物靶點(diǎn)和潛在疾病標(biāo)志物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。針對蛋白質(zhì)組樣品數(shù)量大、含量會(huì)隨時(shí)間和空間發(fā)生變化等特點(diǎn)，在保證定量準(zhǔn)確度、精密度、動(dòng)態(tài)范圍的前提下，亟需發(fā)展能夠?qū)崿F(xiàn)多重蛋白質(zhì)組樣品同時(shí)分析的定量方法。

目前多重蛋白質(zhì)組定量方法常使用基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的穩(wěn)定同位素標(biāo)記策略，按照質(zhì)譜中定量信息所在位置可以分為基于一級譜的定量方法和基于二級譜的定量方法?；谝患壸V的定量方法通過比較多重標(biāo)記樣品在質(zhì)譜一級譜中的峰強(qiáng)度或者譜峰面積實(shí)現(xiàn)。目前可以實(shí)現(xiàn)SILAC三重標(biāo)記(Nat.Protoc.2011,6,147.)、SILAC結(jié)合二甲基化六重標(biāo)記(Scientific Reports 2013,3,1827.)、二甲基化五重標(biāo)記(Chem.Commun.2014,50,1708.)等。但這些方法不能避免一級譜噪音大、靈敏度低、數(shù)據(jù)解析困難、多重標(biāo)記一級譜圖復(fù)雜度成倍增加等不足。

相比上述方法，基于二級譜的定量方法由于多重標(biāo)記一級譜質(zhì)荷比相同，因此降低了一級譜圖復(fù)雜度，有利于定量的深度覆蓋；且二級譜信噪比明顯提高，有利于提高定量準(zhǔn)確度和動(dòng)態(tài)范圍?；诙壸V的定量方法中，基于報(bào)告離子的定量方法可以完成iTRAQ八重標(biāo)記(Proteomics,2007，7,3651.)、TMT六重標(biāo)記(Anal Chem,2008,80,2921.)，但存在低估效應(yīng)，影響定量準(zhǔn)確度。近來基于碎片離子的定量方法越來越受到關(guān)注，目前已有IPTL三重標(biāo)記(Anal.Chem.2013,85,2478.)、質(zhì)量虧損四重標(biāo)記(Anal.Chem.2013,85,10658.),該種方法定量準(zhǔn)確度高、精密度好，動(dòng)態(tài)范圍更寬，但目前通量較小。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明發(fā)展了一種基于等重二甲基化標(biāo)記的多重蛋白質(zhì)定量方法，結(jié)合IPTL和基于質(zhì)量虧損的標(biāo)記方法，對Lys-C酶解的肽段進(jìn)行不同pH條件下兩端的二甲基化標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)等重六重標(biāo)記，利用二級譜碎片離子進(jìn)行定量。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

1、蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過變性還原烷基化后，按照一定的酶/蛋白比例加入Lys-C酶，孵育過夜。

2、根據(jù)肽段的N末端氨基和C末端賴氨酸側(cè)鏈氨基在酸性條件下反應(yīng)速度不同的性質(zhì)，將一份酶解后的蛋白樣品首先在酸性條件下選擇性二甲基化標(biāo)記 肽段末端的氨基；然后在堿性條件下相應(yīng)的二甲基化標(biāo)記肽段賴氨酸上的氨基。酸性條件控制在pH值為2.0～5.0，標(biāo)記時(shí)間5～120min；堿性條件控制pH值為7.5～12，標(biāo)記時(shí)間5～120min。

3、重復(fù)上述步驟，進(jìn)行兩重、三重、四重、五重、六重樣品標(biāo)記。

4、上述多重標(biāo)記方法中，六重標(biāo)記試劑選擇為：

肽段N末端：¹³CH₂O+NaBH₃CN——肽段C末端：CD₂O+NaBD₃CN；

肽段N末端：CD₂O+NaBH₃CN——肽段C末端：¹³CH₂O+NaBD₃CN；

肽段N末端：¹³CD₂O+NaBH₃CN——肽段C末端：CH₂O+NaBD₃CN；

肽段N末端：CH₂O+NaBD₃CN——肽段C末端：¹³CD₂O+NaBH₃CN；

肽段N末端：¹³CH₂O+NaBD₃CN——肽段C末端：CD₂O+NaBH₃CN；

肽段N末端：CD₂O+NaBD₃CN——肽段C末端：¹³CH₂O+NaBH₃CN。

5、將多重標(biāo)記樣品混合，進(jìn)行后續(xù)的液質(zhì)分析。液質(zhì)聯(lián)用中的質(zhì)譜儀包括靜電場軌道阱(Orbitrap)、飛行時(shí)間管(TOF)以及傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)量分析器(FT-ICR)。

6、采集到的肽段在質(zhì)譜儀中得到的一級譜具有相同的質(zhì)荷比，而二級譜每種碎片離子都存在質(zhì)荷比差異，利用多重標(biāo)記在每張二級譜上都同時(shí)出現(xiàn)，提取每種標(biāo)記肽段在二級譜上六重標(biāo)記都同時(shí)出現(xiàn)的a、b、y碎片離子強(qiáng)度并加和，作為該種標(biāo)記肽段的強(qiáng)度。將每重強(qiáng)度相比作為相對定量結(jié)果，實(shí)現(xiàn)基于二級譜碎片離子強(qiáng)度的多重定量分析。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、標(biāo)記效率高，標(biāo)記選擇性好：使用優(yōu)化的標(biāo)記條件，其肽段標(biāo)記效率和標(biāo)記選擇性均在95％以上，且標(biāo)記試劑價(jià)格低廉。

2、多重標(biāo)記之間引入的同位素原子相同，不會(huì)因引入不同數(shù)目的氘原子而使多重肽段在反相色譜保留時(shí)間上存在差異。

3、定量通量大，可以實(shí)現(xiàn)六重樣品的同時(shí)分析，大大縮短了樣品分析的時(shí)間，提高了定量準(zhǔn)確性。

4、標(biāo)記方法中引入質(zhì)量虧損的標(biāo)記思路，有效地降低了二級譜圖復(fù)雜程度，利于二級譜鑒定。

5、定量覆蓋率、準(zhǔn)確度、精密度高。

6、定量動(dòng)態(tài)范圍寬。

附圖說明

圖1等重二甲基化標(biāo)記原理示意圖；

圖2六重標(biāo)記樣品混合理論質(zhì)譜圖示意圖；

圖3六重樣品等量混合定量結(jié)果圖，圖為六重樣品按1:1:1:1:1:1混合后定量比值取log2后所得。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.蛋白質(zhì)酶解

蛋白樣品溶于8M尿素溶液中，加入二硫蘇糖醇至終濃度為10mM，56℃變 性還原1小時(shí)，加入碘乙酰胺至終濃度為20mM，避光反應(yīng)30min，再將尿素稀釋至1M，按照1:50(酶/蛋白，w/w)加入Lys-C，37℃酶解過夜。用C18捕集柱除鹽蒸干，用水復(fù)溶。

2.肽段二甲基化標(biāo)記

對肽段分別進(jìn)行六重二甲基化標(biāo)記，如表3所示，具體標(biāo)記方法如下：

第一重標(biāo)記：將酶解后的肽段上樣至C18捕集柱上，首先用酸性溶液體積濃度1.5％醋酸水溶液平衡捕集柱。在酸性條件下選擇性二甲基化標(biāo)記肽段末端的氨基，標(biāo)記溶液為在1mL體積濃度1.5％醋酸的水溶液中加入50μL體積濃度4％¹³CH₂O、50μL質(zhì)量濃度0.6M NaBH₃CN，流速50μL/min，標(biāo)記20min。再依次使用酸性溶液體積濃度1.5％醋酸的水溶液、水沖洗捕集柱后用堿性溶液pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液平衡捕集柱。在堿性條件下二甲基化標(biāo)記肽段賴氨酸上的氨基，標(biāo)記溶液為在1mL pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液中加入50μL體積濃度4％CD₂O、50μL質(zhì)量濃度0.6M NaBD₃CN,流速50μL/min，標(biāo)記10min。用堿性溶液pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液、水依次沖洗捕集柱；最后用體積濃度80％ACN將樣品從捕集柱上洗脫。

第二重標(biāo)記：與第一重相同的標(biāo)記方法，酸性條件下標(biāo)記溶液替換為在1mL體積濃度1.5％醋酸的水溶液中加入50μL體積濃度4％CD₂O、50μL質(zhì)量濃度0.6M NaBH₃CN，堿性條件下標(biāo)記溶液替換為在1mL pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液中加入50μL體積濃度4％¹³CH₂O、50μL質(zhì)量濃度0.6M NaBD₃CN。

第三重標(biāo)記：與第一重相同的標(biāo)記方法，酸性條件下標(biāo)記溶液替換為在1mL體積濃度1.5％醋酸的水溶液中加入50μL體積濃度4％¹³CD₂O、50μL質(zhì)量濃度0.6M NaBH₃CN，堿性條件下標(biāo)記溶液替換為在1mL pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液中加入50μL體積濃度4％CH₂O、50μL質(zhì)量濃度0.6M NaBD₃CN。

第四重標(biāo)記：與第一重相似的標(biāo)記方法，將酶解后的肽段上樣至C18捕集柱上，首先用酸性溶液體積濃度1.5％醋酸的D₂O溶液平衡捕集柱。在酸性條件下選擇性二甲基化標(biāo)記肽段末端的氨基，標(biāo)記溶液為在1mL體積濃度1.5％醋酸的D₂O溶液中加入50μL體積濃度4％CH₂O、50μL質(zhì)量濃度0.6M NaBD₃CN，流速25μL/min，標(biāo)記30min。再依次使用酸性溶液體積濃度1.5％醋酸的水溶液、水沖洗捕集柱后用堿性溶液pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液平衡捕集柱。在堿性條件下二甲基化標(biāo)記肽段賴氨酸上的氨基，標(biāo)記溶液為在1mL pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液中加入50μL體積濃度4％¹³CD₂O、50μL質(zhì)量濃度0.6M NaBH₃CN,流速50μL/min，標(biāo)記10min。用堿性溶液pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液、水依次沖洗捕集柱；最后用80％ACN將樣品從捕集柱上洗脫。

第五重標(biāo)記：與第四重相同的標(biāo)記方法，酸性條件下標(biāo)記溶液替換為1mL體積濃度1.5％醋酸的D₂O溶液中加入50μL體積濃度4％¹³CH₂O、50μL質(zhì)量濃度0.6M NaBD₃CN，堿性條件下標(biāo)記溶液替換為在1mL pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液中加入50μL體積濃度4％CD₂O、50μL質(zhì)量濃度0.6M NaBH₃CN。

第六重標(biāo)記：與第四重相同的標(biāo)記方法，酸性條件下標(biāo)記溶液替換為1mL體積濃度1.5％醋酸的D₂O溶液中加入50μL體積濃度4％CD₂O、50μL質(zhì)量濃 度0.6M NaBD₃CN，堿性條件下標(biāo)記溶液替換為在1mL pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液中加入50μL體積濃度4％¹³CH₂O、50μL質(zhì)量濃度0.6M NaBH₃CN。

用冷凍蒸干儀干燥每重樣品后用A相(含體積濃度2％ACN和體積濃度0.1％FA的水溶液)復(fù)溶至質(zhì)量濃度0.5mg/mL。將樣品按比例混合，待質(zhì)譜分析。

3.LC-MS分析

液相色譜條件：流動(dòng)相，緩沖液A相(含體積濃度2％ACN和體積濃度0.1％FA的水溶液)，緩沖液B相(含體積濃度98％ACN和體積濃度0.1％FA的水溶液),樣品分離梯度為0到10min，為0％B，然后進(jìn)行125min從5％B到25％B的線性梯度分離，再進(jìn)行10min從25％到35％B的線性梯度分離，流速為300nL/min。

質(zhì)譜條件：使用Q Exactive，采用DDA模式，F(xiàn)ull MS分辨率為70000(m/z＝200)，質(zhì)量范圍350-1800m/z；MS/MS選擇最強(qiáng)的10個(gè)離子進(jìn)行碎裂，動(dòng)態(tài)排除20.0s，碎裂模式為HCD,歸一化碰撞能量為28％，分離窗口2.0Da，MS2起始分子量為50.0Da。MS/MS分辨率為35000(m/z＝200)。上述每個(gè)樣品平行進(jìn)樣三次。

4.數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜采集的原始文件使用MaxQuant(v1.2.2.5)軟件包，并使用Andromeda作為搜庫引擎進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。固定修飾：C為Carbamidomethyl,可變修飾：Acetyl(Protein N-term)；Oxidation(M)，N-term和K分別選擇相應(yīng)的二甲基化標(biāo)記修飾。人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下載于ftp.uniprot.org(2013年7月)。一級譜質(zhì)量容差6ppm,二級譜質(zhì)量容差20ppm，蛋白質(zhì)酶為Lys-C，允許兩個(gè)漏切位點(diǎn)，肽段和蛋白質(zhì)的FDR<0.1％。定量分析時(shí)，對鑒定到的肽段進(jìn)行理論碎裂并與對應(yīng)的mgf文件進(jìn)行匹配，提取所有符合的碎片離子。然后進(jìn)行離子對匹配，保留每重都出現(xiàn)的碎片離子，再將所有該標(biāo)記的多種碎片離子強(qiáng)度加和作為該肽段的離子強(qiáng)度，多重標(biāo)記肽段的離子強(qiáng)度再兩兩相比，作為該譜圖鑒定到肽段的多重相對定量比值。相同的肽段取中位數(shù)作為該肽段的定量結(jié)果，相同的蛋白取所有鑒定到的肽段的中位數(shù)作為該蛋白的定量結(jié)果。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將所有結(jié)果合并到一起，相同的蛋白質(zhì)取平均數(shù)，作為蛋白質(zhì)的最終定量結(jié)果。所有的分析由SPSS(v20)和Excel(v2010)完成。

方法評價(jià)：

1、六重樣品按1:1:1:1:1:1混合，定量覆蓋率大于95％，實(shí)現(xiàn)了六重樣品同時(shí)定量分析，定量準(zhǔn)確度和精密度見表1、圖3，可見該方法定量結(jié)果與理論值相符，精密度高。

2、定量動(dòng)態(tài)范圍寬：將樣品按照1:2:5:10:20:50混合，結(jié)果如表2所示，本方法可以實(shí)現(xiàn)50倍的動(dòng)態(tài)范圍，定量準(zhǔn)確度依然很好，不存在基于報(bào)告離子定量方法的低估效應(yīng)。這得益于本方法是基于二級譜多種碎片離子進(jìn)行定量的，可以有效降低共洗脫組分對定量的干擾。

實(shí)施例2

標(biāo)記過程在離心管中進(jìn)行，酸性標(biāo)記后經(jīng)過捕集柱進(jìn)行溶劑交換，洗脫后進(jìn)行堿性標(biāo)記，其他過程同實(shí)施例1。

實(shí)施例3

酸性標(biāo)記過程在離心管中進(jìn)行，然后經(jīng)過捕集柱進(jìn)行溶劑交換，在捕集柱上進(jìn)行堿性標(biāo)記，其他過程同實(shí)施例1。

實(shí)施例4

在酸性條件下對肽段的N端氨基進(jìn)行選擇性二甲基化標(biāo)記的標(biāo)記溶液組成為濃度1％醋酸水溶液、4％甲醛水溶液及其同位素形式、0.6M氰基硼氫化鈉溶液及其同位素形式，標(biāo)記時(shí)間為10min，其他過程同實(shí)施例1。

實(shí)施例5

實(shí)施例1中選擇前四種標(biāo)記方法，即實(shí)現(xiàn)四重標(biāo)記，其他過程同實(shí)施例1.

表1 六重等量混合定量準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果

表2 動(dòng)態(tài)范圍定量結(jié)果

表3 六重標(biāo)記方法表

該方法的優(yōu)勢在于：定量準(zhǔn)確度高，精密度好，動(dòng)態(tài)范圍寬，可以同時(shí)實(shí) 現(xiàn)六重蛋白質(zhì)樣品的同時(shí)定量分析，大大提高蛋白質(zhì)定量分析的通量，節(jié)約分析時(shí)間。