本發(fā)明涉及疾病檢測
技術領域：
，更具體地，涉及非抗體結合蛋白在制備瘧疾檢測試劑中的應用。
背景技術：
：感染人類的主要瘧原蟲(Plasmodium)有5種：惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、三日瘧原蟲(P.malariae)、卵形瘧原蟲(P.ovale)以及諾氏瘧原蟲(P.Knowlesi)，其中惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲在疫區(qū)的感染病率幾乎各占一半，而惡性瘧原蟲感染是最致命的一種。在貧窮落后的國家和偏遠地區(qū)，由于設備有限，瘧疾的診斷往往依循臨床癥狀的表現(xiàn)。然而，瘧疾的癥狀與其他感染癥不易區(qū)分，造成診斷上很大的困難。馬拉威一項研究報告顯示，以發(fā)燒、脾腫大及蒼白的指甲三項作為瘧疾診斷的依據(jù)只有85％敏感度與41％特異性，因此，以癥狀為導向的診療經常導致誤診。顯微鏡檢查，至今仍是瘧疾診斷的金標準。血液厚涂片用于篩檢診斷與估算瘧原蟲的密度，薄片血涂片是目前鑒定瘧原蟲種類的標準方式。厚薄血涂片鏡檢法檢測效率較低，要求技術熟練的鏡檢員，而且當原蟲血癥較低的時候容易造成漏診和誤診。瘧疾藥物越來越昂貴，誤診是一個主要的費用負擔，因此準確和敏感的診斷變得越來越重要。抗原快速檢驗是一種基于抗原-抗體特異性結合的原理建立的免疫學檢測方法，因有著簡單快速的優(yōu)點，在各類感染性疾病的診斷上受到越來越多的關注并展示了廣闊的應用前景。目前臨床上免疫學檢測方法中大量使用的多克隆抗體或單克隆抗體多為免疫球蛋白IgG形式，完整天然抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，分子量約150kDa。由于分子量較大，組織穿透性較低，無法與某些小裂隙中的分子表面結合，在某些方面的應用受到限制。這些抗體或來源于免疫動物、或通過雜交瘤細胞制備，部分來源于基因工程重組法生產，生產方法及其抗體本身的結構特點不僅使得其生產成本很難降低，而且存在不同批次之間的變異性以及抗體純度的問題。為使得抗體選擇可以根據(jù)人類的需要并賦予天然狀態(tài)下不可能具備的新功能，越來越多的展示技術被用于研究構建各種基因工程抗體庫和抗體替代物庫。目前抗體替代物庫從結構上分為兩類，框架蛋白(scaffoldprotein)和RNA/DNA適配分子(Aptamer)。其中，框架蛋白是指這些非免疫球蛋白的抗體替代物在一級結構上與抗體分子完全不同，但在框架結構上與抗體可變區(qū)有相似結構特點。過計算機設計，在保證框架結構不變的基礎上，對某一特定的蛋白分子表面區(qū)域的氨基酸組成進行隨機化組合，從而構建類似于抗體庫的框架蛋白文庫，將其展示在噬菌體、細菌、酵母、細胞器或其他生物大分子表面，可用于篩選特異性識別各種抗原的非抗體結合蛋白(non-antibodybindingproteins，nABPs)。在歐美國家，幾十種框架蛋白文庫已被成功構建。一些特異識別癌細胞的框架蛋白也從框架蛋白文庫中得到了成功地分離，并通過了臨床實驗，應用于癌癥的診斷和藥物靶向輸送，有的已經實現(xiàn)了商品化。但在中國，新型框架蛋白文庫的構建幾乎為零。采用抗原快速檢驗，又稱“dipsticks”或“malariarapiddiagnosticdevices(MRDDs)”來檢測瘧疾，一般是檢測瘧原蟲內的HRP2或pLDH兩種抗原，現(xiàn)有技術中還沒有用于檢測瘧疾的非抗體結合蛋白。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷，提供非抗體結合蛋白在制備瘧疾檢測試劑中的應用。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的：非抗體結合蛋白在制備檢測瘧疾的試劑中的應用，所述非抗體結合蛋白為與惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶反應的LDH9-5和/或LDH9及與惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II反應的HRP2-9和/或HRP2-9-1，其氨基酸序列如SEQIDNO：1～4所示。首先通過計算機設計和噬菌體表面展示技術構建了類似于抗體庫的框架蛋白(scaffoldproteins)文庫，框架蛋白文庫中的非抗體結合蛋白(non-antibodybindingproteins，nABPs)在一級結構上與抗體分子完全不同，但在框架結構上與抗體可變區(qū)有相似的結構特點，因此可作為抗體替代物特異性識別、結合各種抗原。申請人通過在框架蛋白文庫中篩選出了能夠配對惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶(LDH)和惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II(HRP2)的非抗體結合蛋白，因此可用于檢測瘧疾。其中，LDH主要是存在于間日瘧中，HRP2主要存在于惡性瘧，因此，優(yōu)選地，所述瘧疾為間日瘧或/和惡性瘧。具體的，可以將本發(fā)明所篩選出來的LDH9和HRP2-9固定于載體上作為包被抗體，以LDH9-5和HRP2-9-1作為檢測抗體，然后通過常規(guī)的免疫反應(LDH9和LDH9-5配對，HRP2-9與HRP2-9-1配對)，即可用來檢測待測樣品中是否存在LDH和HRP2，更具體地，若免疫反應結果顯示，LDH9作為包被抗體時的反應孔為陽性，HRP2-9作為包被抗體時的反應孔為陰性，則待測樣品為間日瘧；若LDH9作為包被抗體時的反應孔為陽性，HRP2-9作為包被抗體時的反應孔同樣為陽性，那則待測樣品為惡性瘧。因此，本發(fā)明還提供非抗體結合蛋白在制備同時鑒別間日瘧和惡性瘧的試劑中的應用，所述非抗體結合蛋白為與惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶反應的LDH9-5和/或LDH9及與惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II反應的HRP2-9和/或HRP2-9-1，其氨基酸序列如SEQIDNO：1～4所示。上述應用中，是將LDH9-5和HRP2-9-1作為檢測抗體，將LDH9和HRP2-9作為包被抗體，其中LDH9-5和LDH9配對，HRP2-9-1和HRP2-9配對，所述LDH9和HRP2-9作為包被抗體的包被濃度為2～4μg/mL。作為一種具體的實施方式，本發(fā)明利用上述LDH9-5和HRP2-9-1檢測瘧疾的過程如下：S1.包被LDH9和HRP2-9于固相載體上，經封閉后干燥備用；S2.將處理過的待測樣品加入包被有LDH9和HRP2-9的固相載體上，經室溫反應后，再分別對應的加入標有生物素的LDH9-5和HRP2-9-1，反應后加入辣根過氧化物沒標記的親和素，最后加入TMB和稀硫酸終止反應，并檢測450nm處的吸光值。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明從框架蛋白(scaffoldproteins)文庫中篩選獲得能夠與惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶(LDH)配對的LDH9-5和LDH9，和能夠與惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白II(HRP2)配對的HRP2-9和HRP2-9-1，能夠特異性檢測瘧疾，并可同時鑒別間日瘧和惡性瘧，利用該配對的蛋白和非抗體結合蛋白，可用于制備瘧疾檢測試劑盒，解決了當前瘧疾診斷推廣普及時抗體生產和試劑盒的價格問題，可成為具有發(fā)展?jié)摿Φ脑\斷工具，具有廣泛的應用價值。附圖說明圖1為不同非抗體結合蛋白配對的反應的吸光值。圖2為不同包被濃度下反應的吸光值。圖3為不同瘧原蟲濃度下反應的吸光值。具體實施方式下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1雙抗夾心法檢測CRP蛋白的實驗平臺驗證1、實驗器材的準備，其中主要包括了酶標儀(酶標儀使用前已經進行校正)、加樣器等。2、CRP抗體的生物素標記：按照Sulfo-NHS-LC-Biotin(購自Thermo21335)產品說明書進行操作，將編號6402SPTN-5的CRP抗體(濃度4.3mg/ml)透析，取適量加入預先計算的NHS-LC-Biotin試劑，反應標記后透析并計算其濃度為：1.673mg/ml。3、包被板的制備：將編號為6403SPTN-5的CRP抗體(濃度為5mg/ml)透析后，取適量用pH9.6的碳酸鹽(CB)包被緩沖液稀釋至濃度3ug/ml，隨后按100ul/孔加入到高吸附力的96微孔板中(購自深圳金燦華)進行包被。4℃下孵育18～24h，棄去包被液，加入含3％的BSA的封閉液150ul/孔，37℃封閉3h后干燥備用。4、雙抗夾心法測試臨床血清樣本，與其他現(xiàn)成方法比對測試：(1)將待測血清樣本(來自暨南大學附屬第一醫(yī)院-廣州華僑醫(yī)院)放置于室溫平衡30min，待樣本于室溫平衡后，取適量樣本按照1∶1000稀釋后，取100ul/孔，按表1如下方案加入待測血清樣本。表1123456789101112AStd1Std1S1S9S17S25S33S41S49S57S65S73BStd2Std2S2S10S18S26S34S42S50S58S66S74CStd3Std3S3S11S19S27S35S43S51S59S67BDStd4Std4S4S12S20S28S36S44S52S60S68BEStd5Std5S5S13S21S29S37S45S53S61S69BFStd6Std6S6S14S22S30S38S46S54S62S70BGStd7Std7S7S15S23S31S39S47S55S63S71BHStd8Std8S8S16S24S32S40S48S56S64S72B注：其中Std1～Std8為校準品編號，S1～S74為血清樣本；B為空白對照孔。測試結果如表2所示。表2經校準計算S1～S74樣本的濃度值，后將所得濃度值與華僑醫(yī)院臨床檢測所提供濃度值比對，擬合R2＝0.9469，表明了該對抗體測試臨床樣本性能和目前醫(yī)院所用的相關測試有比較好的相關性。進一步表明已建立的ELISA平臺可以實現(xiàn)瘧疾相關蛋白及抗體類似物之間特異性反應的檢測。實施例2ELISA測試惡性瘧HRP2及LDH相關蛋白性能1、抗體類似物蛋白(下簡稱nABPs)的生物素標記：將編號LDH9-5、LDH9-8兩個惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶(下簡稱LDH)抗體類似物(nABPs)及HRP2-9-7、HRP2-9-1、HRP2-9-9三個惡性瘧原蟲富組氨酸蛋白Ⅱ(下簡稱HRP2)抗體類似物(nABPs)在pH7.4的10mMPBS緩沖液下進行透析過夜(換液3次)處理，隨后嚴格按照Sulfo-NHS-LC-Biotin標記的操作規(guī)程進行生物素標記操作，最后置于2～8℃冰箱保存?zhèn)溆?。將標記好生物素的LDH及HRP2的nABPs稀釋成5ug/ml并按100ul/孔包被于96微孔板中，4℃過夜，然后加入3％的BSA封閉液150ul/孔，封閉3h。同時空白對照孔用包被稀釋液直接包被后封閉3h。將封閉好的包被板用PBST洗滌5次后，加入1∶5000的辣根過氧化物酶標記的親和素100ul/孔，室溫反應1h。隨后再用PBST洗滌5次，然后再加入單組份TMB底物顯色液100ul/孔，室溫反應15min后加入2mol/L的稀硫酸50ul/孔終止反應，置于450nm波長下檢測吸光度值(OD值)。判斷結果要求：測試標記抗體的包被孔OD值不低于1.5。空白對照孔OD值不高于0.1，檢測結果如表3。表312A3.040.074B3.0410.066C2.9930.058D3.0040.053E3.5910.071測試標記抗體孔最小OD值為2.993＞1.5，空白對照孔的最大OD值為0.074＜0.1，可進行下一步測試工作。實施例3nABPs蛋白的性能調試與測試(1)雙抗夾心法的nABPs配對性測試：取適量的編號為LDH9的LDHnABPs及HRP2-9、HRP2-26的HRP2nABPs分別用pH9.6的CB緩沖液稀釋至8ug/ml，按100ul/孔包被于96微孔板中，置于2～8℃過夜后棄去包被液，加入封閉液150ul/孔，封閉3h后，棄去封閉液，加入1∶1稀釋的惡性瘧原蟲上清培養(yǎng)液(培養(yǎng)液的蟲濃度為100個)100ul/孔，室溫反應1h后用PBST洗滌5次，再分別對應包被LDH9及HRP2的nABPs中加入制備好的濃度5ug/ml的生物素標記LDH9-5、LDH9-8及HRP2-9-7、HRP2-9-1、HRP2-9-9的nABPs100ul/孔，室溫反應1h后用PBST洗滌5次，隨后加入1∶5000的辣根過氧化物酶標記親和素100ul/孔，再置于室溫反應1h后PBST洗滌5次，最后加入TMB底物顯色液，室溫反應15min后，加入2mol/L的稀硫酸50ul/孔終止反應，于波長450nm下檢測吸光度值，實驗方案如表4。表4包被→LDH9HRP2-9HRP2-26ABiotin-LDH9-5Biotin-HRP2-9-7Biotin-HRP2-9-7BBiotin-LDH9-5Biotin-HRP2-9-7Biotin-HRP2-9-7CBiotin-LDH9-8Biotin-HRP2-9-1Biotin-HRP2-9-1DBiotin-LDH9-8Biotin-HRP2-9-1Biotin-HRP2-9-1EBiotin-HRP2-9-9Biotin-HRP2-9-9FBiotin-HRP2-9-9Biotin-HRP2-9-9試驗結果如圖1，結果表明選擇編號LDH9作為包被與生物素標記LDH9-5配對，編號HRP2-9作為包被與生物素標記HRP2-9-1配對，編號HRP2-26與生物素標記HRP2-9-7配對，選擇好配對后進行下一步的濃度選擇測試。(2)包被的nABPs濃度選擇測試：取適量的編號LDH9的LDHnABPs及HRP2-9、HRP2-26的HRP2nABPs稀釋成8ug/ml進行測試，隨后再進一步稀釋成以下幾個梯度：4ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml，0.25ug/ml，并按100ul/孔包被于96微孔板中，置于2～8℃過夜后棄去包被液，加入封閉液150ul/孔，封閉3h后，棄去封閉液，加入1∶1稀釋的惡性瘧原蟲上清培養(yǎng)液100ul/孔(100個寄生蟲/ul)，室溫反應1h后用PBST洗滌5次，再分別對應加入制備好的濃度5ug/ml的生物素標記LDH9-5及HRP2-9-1、HRP2-9-7100ul/孔，每組兩個重復，室溫反應1h后用PBST洗滌5次，隨后加入1∶5000的辣根過氧化物酶標記親和素100ul/孔，再置于室溫反應1h后PBST洗滌5次，最后加入TMB底物顯色液，室溫反應15min后，加入2mol/L的稀硫酸50ul/孔終止反應，于波長450nm下檢測吸光度值，結果如表5(判斷結果要求：選擇飽和的包被反應的濃度，即選取反應曲線中趨向平臺反應區(qū)的濃度作為包被濃度)，作圖如圖2，LDH的nABPs包被編號為LDH9的濃度選擇2ug/ml進行包被，HRP2的nABPs包被編號為HRP2-9及HRP2-26的濃度分別選擇2ug/ml及4ug/ml進行包被。表5包被→LDH9LDH9HRP2-9HRP2-9HRP2-26HRP2-26A3.343.333.0223.1213.0753.072B3.1413.2112.9943.0683.063.018C2.9992.9933.053.0022.6522.686D2.582.62.9462.8931.1471.348E1.5981.6062.522.5890.6840.678F0.9780.9521.6231.6250.3290.329(3)最低檢測限(靈敏度)的測定：取適量的編號LDH9、HRP2-9、HRP2-26的nABPs用CB(PH9.6)進行包被，包被濃度分別為：2ug/ml，2ug/ml，4ug/ml。置于2～8℃冰箱包被18～24h，棄去包被液，加入封閉液150ul/孔，封閉3h后，棄去封閉液干燥備用。按照原來惡性瘧原蟲培養(yǎng)液濃度是4×104個/微升，隨后按照1∶1稀釋后再進一步對倍稀釋后100ul/孔加入到制備好的包被板中，同時做空白孔對照測試重復24個孔，置于室溫反應1h后用PBST洗滌5次，再分別對應加入制備好的濃度5ug/ml的配對生物素標記LDH9-5及HRP2-9-1、HRP2-9-7100ul/孔，室溫反應1h后用PBST洗滌5次，隨后加入1∶5000的辣根過氧化物酶標記親和素100ul/孔，再置于室溫反應1h后PBST洗滌5次，最后加入TMB底物顯色液，室溫反應15min后，加入2mol/L的稀硫酸50ul/孔終止反應，于波長450nm下檢測吸光度值，結果如表6。表6表6(續(xù))判斷標準：參考現(xiàn)行的其他方法學檢測，要求最低檢測限(即靈敏度)應不大于1000個寄生蟲/微升，結果如圖3。綜合數(shù)據(jù)，并計算處理，結果如表7，顯示HRP2-26與HRP2-9-7配對最低檢測限為1653大于1000個瘧原蟲/微升，不符合檢測要求，而LDH9與LDH9-5及HRP2-9與HRP2-9-1配對最低檢測限分別為333及283個瘧原蟲/微升，符合檢測要求。可以進一步用LDH9與LDH9-5及HRP2-9與HRP2-9-1進行下一步測試。表7實施例4nABPs的臨床檢測性能對比測試驗證臨界值(cutoff值)的確定方法：取多樣本混合制成的瘧疾陰性人全血，用選定的配對LDH9及HRP2-9進行測試，判定方法：以臨界值(cutoff值)＝陰性對照均值×2；當檢測結果≥臨界值，判為陽性；當檢測結果＜臨界值，判為陰性；注意：當檢測結果接近于臨界值，需要重新測試，或者進一步做其他檢測。根據(jù)實施例3測試篩選得到的針對檢測LDH蛋白及HRP2蛋白的配對nABPs，即編號LDH9與LDH9-5配對檢測LDH、編號HRP2-9與HRP2-9-1配對檢測HRP2。將用于包被的LDH9及HRP2-9兩種nABPs分別包被于高吸附力的96微孔板中，按照濃度分別為2ug/ml進行4℃包被18～24h，棄去包被液，加入含3％BSA的封閉液150ul/孔，封閉3h后，棄去封閉液干燥備用。按照原來惡性瘧原蟲培養(yǎng)液濃度是4×104個寄生蟲/微升，隨后稀釋成5000個寄生蟲/微升，以此濃度作為質控樣本。另取適量經多樣本混合的瘧疾陰性的人全血進行按1：5稀釋作為陰性對照樣本。待測的瘧疾陽性人全血樣本也按1：5稀釋后，以上質控樣本、陰性對照樣本、經稀釋的待測人全血樣本均按100ul/孔加入到制備好的包被板中，同時做空白孔對照，置于室溫反應1h后用PBST洗滌5次，再分別對應加入制備好的濃度5ug/ml的配對生物素標記LDH9-5及HRP2-9-1100ul/孔，室溫反應1h后用PBST洗滌5次，隨后加入1：5000的辣根過氧化物酶標記親和素100ul/孔，再置于室溫反應1h后PBST洗滌5次，最后加入TMB底物顯色液，室溫反應15min后，加入2mol/L的稀硫酸50ul/孔終止反應，于波長450nm下檢測吸光度值，檢測結果如表8。表8統(tǒng)計數(shù)據(jù)，并計算結果如表9，LDH試劑檢測樣本，陰性及陽性符合率分別為100％及93.75％；HRP2試劑檢測樣本，陰性及陽性符合率都為100％；以上兩個檢測試劑性能初步判斷滿足進一步的試劑開發(fā)要求。表9SEQUENCELISTING<110>廣東合鑫生物科技有限公司<120>非抗體結合蛋白在制備瘧疾檢測試劑中的應用<130><160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>391<212>PRT<213>LDH9<400>1AspTyrGluThrSerSerAsnGlyGlnProAlaGlyThrLeuAspAsn151015ValLeuGluPheValThrGlyHisGluGlyAsnSerArgLysAsnSer202530SerAsnGlyGlyAsnProTyrAspIleAspHisLysLysThrIleSer354045SerAlaIleIleAsnHisAlaPheLeuGlnAsnThrValMetLysAsn505560CysAsnTyrLysArgLysArgArgGluArgAspTrpAspCysAsnThr65707580LysLysAspValCysIleProAspArgArgTyrGlnLeuCysMetLys859095GluLeuThrAsnLeuValAsnAsnThrAspThrAsnPheHisSerAsp100105110IleThrPheArgLysLeuTyrLeuLysArgLysLeuIleTyrAspAla115120125AlaValGluGlyAspLeuLeuPheLysLeuAsnAsnTyrArgTyrAsn130135140LysAspPheCysLysAspIleArgTrpSerLeuGlyAspPheGlyAsp145150155160IleIleMetGlyThrAspMetGluGlyIleGlyTyrSerLysValVal165170175GluAspAsnLeuArgSerIlePheGlyThrGlyLysAsnAlaGlnGln180185190HisArgLysGlnTrpTrpAsnGluSerLysAlaGlnIleTrpThrAla195200205MetMetTyrSerValLysLysArgLeuLysGlyLysPheIleTrpIle210215220CysLysIleAsnValAlaValAsnIleGluProGlnIleTyrArgArg225230235240IleArgGluTrpGlyArgAspTyrValSerGluLeuProThrGluVal245250255GlnLysLeuLysGluLysCysAspGlyLysIleAsnTyrThrAspLys260265270LysValCysLysValProProCysGlnAsnAlaCysLysSerTyrAsp275280285GlnTrpIleThrArgLysLysAsnGlnTrpAspValLeuSerAsnLys290295300PheLysSerValLysAsnAlaGluLysValGlnThrAlaGlyIleVal305310315320ThrProTyrAspIleLeuLysGlnGluLeuAspGluPheAsnGluVal325330335AlaPheGluAsnGluIleAsnLysArgAspGlyAlaTyrIleGluLeu340345350CysValCysSerValGluGluAlaLysLysAsnThrGlnGluValVal355360365ThrAsnValAspAsnAlaAlaLysSerGlnAlaThrAsnSerAsnPro370375380IleSerGlnProValAspSer385390<210>2<211>305<212>PRT<213>LDH9-5<400>2MetGlyIleLeuProSerProGlyMetProAlaLeuLeuSerLeuVal151015SerLeuLeuSerValLeuLeuMetGlyCysValAlaGluThrGlyLeu202530AlaAlaGlnProAlaMetAlaAspIleValIleThrGlnAspGluLeu354045SerAsnProValThrSerGlyGluSerValSerIleSerCysArgSer505560SerLysSerLeuLeuTyrGlnAspGlyLysThrTyrLeuAsnTrpPhe65707580LeuGlnArgProGlyGlnSerProGlnLeuLeuIleTyrLeuMetSer859095ThrArgAlaSerGlyValSerAspArgPheSerGlySerGlySerGly100105110ThrAspPheThrLeuGluIleSerArgValGluAlaGluAspValGly115120125ValTyrTyrCysGlnGlnLeuValGluTyrProLeuThrPheGlyAla130135140GlyThrLysLeuGluLeuLysArgAlaAspGlyGlyGlyGlySerGly145150155160GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlnValGlnLeuGlnGlnSer165170175GlyProGluLeuValLysProGlyAlaSerValLysIleSerCysLys180185190AlaSerGlyTyrAlaPheIleSerSerTrpMetAsnTrpValLysGln195200205ArgProGlyLysGlyLeuGluTrpIleGlyArgIleTyrProGlyAsp210215220GlyAspThrHisTyrAsnGlyLysPheLysGlyLysAlaThrLeuThr225230235240AlaAspLysSerSerSerThrAlaTyrMetGlnLeuSerSerLeuThr245250255SerGluAspSerAlaValTyrPheCysAlaArgGluGluThrAlaGln260265270ThrGlyGlyPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrLeuThrValSer275280285SerGluAlaSerGlyAlaAspHisGlyThrLysHisHisHisHisHis290295300His305<210>3<211>392<212>PRT<213>HRP2-9<400>3PheLeuIleLysLysCysGlyAsnAsnSerGlyAspGlyGluThrIle151015PheSerGluLysLeuAsnAsnAlaAsnIleLysCysAsnGluAsnLys202530SerThrAsnAsnLysMetLysSerSerValIleSerSerValLeuAsn354045AlaThrAsnTyrIleArgGlyCysGlnProLysIleTyrAspGlyLys505560IlePheProGlyLysGlyGlyGluLysGlnTrpIleCysLysAspThr65707580IleIleHisGlyAspThrAsnGlyAlaCysIleProProArgThrGln859095AsnLeuCysValGlyGluLeuTrpTyrLysSerTyrGlyGlyArgSer100105110AsnIleLysAsnAspThrLysGluSerLeuLysAsnLysLeuLysAsn115120125AlaIleGlnLysGluThrGluLeuLeuTyrGluTyrHisAspLysGly130135140ThrAlaIleIleSerGlnAsnAspLysLysGlyGlnLysAlaAsnAsn145150155160AsnAsnSerAsnGlyLeuProLysGlyPheCysHisAlaValGlnArg165170175SerPheIleAspTyrLysAsnMetIleLeuGlyThrSerValAsnIle180185190TyrGluTyrIleGlyLysLeuGlnGluAspIleLysLysIleIleGlu195200205LysGlyThrProGlnGlnLysAspLysThrValGlySerGlyAlaGlu210215220AsnValAsnAlaTrpTrpLysGluIleGluLysAspMetTrpAspAla225230235240ValArgCysGlyIleThrLysIleAsnLysLysLysLysAsnGlyThr245250255TyrThrGlyAspGluCysGlyIlePheProProThrGlyAsnAspGlu260265270AspGlnSerValSerTrpPheLysGluTrpGlyGluGlnPheCysIle275280285GluArgLeuGlnTyrGluGlnAsnIleArgAspAlaCysThrAsnAsn290295300GlyLysAsnGlyLysLysCysIleAsnSerLysSerGlyGlnGlyAsp305310315320LysIleGlnGlyAlaCysLysArgLysCysGluLysTyrLysLysTyr325330335IleSerGluLysLysGlnGluTrpAspLysGlnLysThrLysTyrGlu340345350AsnLysTyrValGlyLysSerAlaSerAspLeuLeuLysGluAsnTyr355360365ProGluCysIleSerAlaAsnPheAspPheIlePheAsnAspAsnIle370375380GluTyrLysThrTyrTyrProTyr385390<210>4<211>358<212>PRT<213>HRP2-9-1<400>4PheLeuIleLysGlyAspGlyGluThrIlePheSerGluLysLeuLys151015AsnAlaGluLysLysCysLysGluAsnGluSerThrAspThrAsnIle202530IleLysAsnGluLeuAspThrLysLeuSerGluProIleTyrIleArg354045GlyCysGlnSerLysArgTyrAspGlyPheIleSerProGlyLysGly505560GlyGluLysGlnGlyAlaCysIleProProArgThrGlnAsnLeuCys65707580ValGlyAsnLeuTrpAspLysSerTyrGlyGlyArgSerAsnIleLys859095AsnAspThrLysGluLeuLeuLysGluLysIleLysAsnAlaIleHis100105110LysGluThrGluLeuLeuTyrGluTyrHisAspLysGlyThrAlaIle115120125IleSerArgGlyLysGlnLysGluGlyGlyGluGluAlaAsnAsnAsn130135140SerAsnGlyLeuProLysGlyPheCysHisAlaValGlnArgSerPhe145150155160IleAspTyrLysAsnMetIleLeuGlyThrSerValSerThrTyrGlu165170175TyrIleGlyLysLeuGlnGluAspIleLysLysIleIleGluGlnGlu180185190ThrThrLysGlnAsnGlyLysThrValGlySerGlyAlaGluAsnVal195200205AsnAlaTrpTrpLysGlyIleGluLysAspMetTrpGlyAlaValLys210215220CysGlyIleLysThrIleLysLysGlnLysLysAsnGlyThrPheAsn225230235240GlyAspGluCysGlyValSerProProThrGlyAsnAspGluAspGln245250255PheValSerGluGlnAsnIleArgGluAlaCysThrIleAsnGlyLys260265270AsnGluLysLysCysIleAsnSerLysSerGlyGlnGluAspLysVal275280285GluGlyAlaCysLysArgLysCysGluLysTyrLysLysTyrIleSer290295300GluLysLysGlnGluTrpAspLysGlnLysThrLysTyrGluAsnLys305310315320TyrValGlyLysSerAlaSerAspLeuLeuLysGluAsnTyrProGlu325330335CysIleSerAlaAsnPheAspPheIlePheAsnAspLysAlaAspHis340345350LysLysTyrTyrProTyr355當前第1頁1 2 3