本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及SSBP1蛋白的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥的轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細胞從原發(fā)部位，經(jīng)淋巴道、血管或體腔等途徑，到達其他部分繼續(xù)生長。癌癥的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特點之一，也是被認為是治療失敗、造成患者死亡的首要原因。一般來說，癌癥轉(zhuǎn)移的途徑主要包括下述幾種：(1)直接蔓延：隨著腫瘤體積的不斷增大，腫瘤細胞可沿周圍正常組織的薄弱處，直接延伸，侵入并破壞鄰近組織或器官。(2)淋巴道轉(zhuǎn)移：腫瘤細胞侵入淋巴管后，隨淋巴液轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)內(nèi)生長形成轉(zhuǎn)移瘤，是常見的腫瘤轉(zhuǎn)移方式。(3)血行轉(zhuǎn)移：癌細胞可經(jīng)淋巴途徑進入靜脈，也可直接侵入血液循環(huán)而致遠處轉(zhuǎn)移。(4)種植性轉(zhuǎn)移和經(jīng)椎旁靜脈系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移等等。對于癌癥病人而言，早期診斷和控制轉(zhuǎn)移是實現(xiàn)對癌癥的臨床治愈的關(guān)鍵，尋找與癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)的可靠且早期的預(yù)報信號，已成為腫瘤臨床診治領(lǐng)域的熱點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供SSBP1蛋白在制備用于檢測癌癥轉(zhuǎn)移的試劑盒、抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物以及抑制與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路的藥物中的應(yīng)用，上述應(yīng)用可有助于實現(xiàn)臨床上對癌癥轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)和不良預(yù)后。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實施方式首先提供了SSBP1蛋白(single-strandedDNAbindingprotein1；SSBP1蛋白；線粒體單鏈結(jié)合蛋白1)在制備用于檢測癌癥轉(zhuǎn)移的試劑盒中的應(yīng)用，所述癌癥為乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。在上述應(yīng)用中，SSBP1蛋白用作檢測癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)分子標記。具體來說，該種應(yīng)用是檢測SSBP1蛋白在乳腺、肺、卵巢或胃的細胞組織中的表達量是否存在表達下調(diào)：如存在表達下調(diào)，則得出發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移的結(jié)論；如不存在表達下調(diào)，則得出未發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移的結(jié)論。同時，本發(fā)明的實施方式也提供SSBP1蛋白在制備抑制癌癥轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用，所述癌癥為乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。此外，本發(fā)明的實施方式還提供SSBP1蛋白在制備抑制TGF-β信號通路的藥物中的應(yīng)用，所述TGF-β信號通路與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。具體來說，本發(fā)明的實施方式首先通過對親本乳腺癌細胞MDA-MB-231及其衍生的高轉(zhuǎn)移細胞MDA-MB-231HM和MDA-MB-231Bo進行線粒體定量蛋白組學(xué)對比分析，發(fā)現(xiàn)線粒體單鏈結(jié)合蛋白1(SSBP1)在具有高轉(zhuǎn)移潛能的乳腺癌細胞呈現(xiàn)低表達。其次通過體外細胞功能學(xué)實驗以及裸鼠動物模型，均證實沉默SSBP1可以促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移能力；而過表達SSBP1能顯著抑制其轉(zhuǎn)移能力。進而發(fā)現(xiàn)沉默SSBP1能增加TGF-β的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致細胞TGF-β分泌增加，TGF-β/SMAD信號通路被激活，誘發(fā)細胞發(fā)生EMT，最終促進乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移。同時，在肺癌、卵巢癌或胃癌細胞系中，也發(fā)現(xiàn)干擾SSBP1后能顯著促進腫瘤的遷移能力。發(fā)明的實施方式所提供的SSBP1蛋白的上述種應(yīng)用，將為乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌轉(zhuǎn)移的診斷或預(yù)后提供一條全新的途徑，SSBP1蛋白更有可能成為對癌癥轉(zhuǎn)移進行臨床治療的靶分子。附圖說明圖1是具體實施方式中線粒體蛋白SSBP1的質(zhì)譜結(jié)果；圖2是具體實施方式中線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)顯示SSBP1在MDA-MB-231、MDA-MB-231HM、MDA-MB-231Bo細胞系中差異表達的結(jié)果圖；圖3是具體實施方式中Westernblot驗證SSBP1在MDA-MB-231、MDA-MB-231HM、MDA-MB-231Bo細胞系中表達情況的結(jié)果圖；圖4是具體實施方式中Real-TimePCR顯示SSBP1在乳腺癌細胞系中表達情況的結(jié)果圖；圖5是具體實施方式中Westernblot驗證干擾表達SSBP1和過表達SSBP1在乳腺癌細胞中的效果的結(jié)果圖；圖6是具體實施方式中Transwell驗證在MDA-MB-231中干擾SSBP1表達后對侵襲和遷移的影響的結(jié)果圖，其中，圖6-1是實驗結(jié)果的代表性圖片，圖6-2是實驗結(jié)果的柱狀統(tǒng)計圖；圖7是具體實施方式中Transwell驗證在MDA-MB-468中干擾SSBP1表達后對侵襲和遷移的影響的結(jié)果圖，其中，圖7-1是實驗結(jié)果的代表性圖片，圖7-2是實驗結(jié)果的柱狀統(tǒng)計圖；圖8是具體實施方式中Transwell驗證在MDA-MB-231Bo中過表達SSBP1后對侵襲的影響的結(jié)果圖，其中，圖8-1是實驗結(jié)果的代表性圖片，圖8-2是實驗結(jié)果的柱狀統(tǒng)計圖；圖9是具體實施方式中WB檢測TGF-β信號通路相關(guān)分子的結(jié)果圖；圖10是具體實施方式中TGF-β信號通路抑制劑處理后，逆轉(zhuǎn)SSBP1對轉(zhuǎn)移的影響結(jié)果圖；圖11是具體實施方式中Real-timePCR檢測SSBP1干擾和過表達后 TGF-β的mRNA水平：其中，圖11-1是MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞株的實驗結(jié)果圖、圖11-2是MDA-MB-231Bo細胞株的實驗結(jié)果圖；圖12是具體實施方式中ELISA檢測SSBP1干擾和過表達后TGF-β的分泌水平：其中，圖12-1是MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞株的實驗結(jié)果圖、圖12-2是MDA-MB-231Bo細胞株的實驗結(jié)果圖；圖13是具體實施方式中小鼠活體成像驗證干擾和過表達SSBP1后體內(nèi)轉(zhuǎn)移效果的結(jié)果圖；圖14是具體實施方式中臨床標本中檢測SSBP1與患者的生存率的結(jié)果圖；圖15是具體實施方式中臨床標本中檢測SSBP1與患者的腫瘤分期的結(jié)果圖；圖16是具體實施方式中臨床標本中檢測SSBP1與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的結(jié)果圖；圖17是具體實施方式中Real-timePCR驗證SSBP1在肺癌細胞A549、胃癌細胞SGC-7901和卵巢癌細胞A2780中的干擾效果的結(jié)果圖；圖18是實施例Transwell驗證在肺癌細胞A549中沉默SSBP1的表達后對侵襲和遷移的影響的結(jié)果圖；圖19是實施例Transwell驗證在卵巢癌細胞A2780中沉默SSBP1的表達后對侵襲和遷移的影響的結(jié)果圖；圖20是實施例Transwell驗證在胃癌細胞SGC-7901中沉默SSBP1的表達后對侵襲和遷移的影響的結(jié)果圖。具體實施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā) 明的各實施方式進行詳細的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術(shù)細節(jié)。但是，即使沒有這些技術(shù)細節(jié)和基于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現(xiàn)本申請各權(quán)利要求所要求保護的技術(shù)方案。1材料和方法1.1材料1.1.1細胞系人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、肺癌細胞A549、胃癌細胞SGC-7901、卵巢癌細胞A2780均購自中國科學(xué)院上海細胞庫，MDA-MB-231HM、MDA-MB-231Bo系列高轉(zhuǎn)移細胞株由本實驗室構(gòu)建。1.1.2裸鼠來源，品系和品種BALB/c(nu/nu)裸小鼠，由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(滬)(2007-0005)；實驗動物使用許可證編號合格證編號：SCXK(滬)(2007-0005)；日齡:28-35天；體重:16-20g；性別:雌性；飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。1.1.2主要試劑1.1.2.1蛋白電泳及免疫印跡用試劑蛋白裂解液T-PER(Pierce)BCA試劑盒(索萊寶)4×蛋白上樣緩沖液、過硫酸銨APS(生工)Trisbase、甘氨酸glycine、十二烷基硫酸鈉SDS(Amresco)N,N,N',N'-四甲基乙二胺TEMED(Sigma)30％聚丙烯酰胺(索萊寶)分離膠緩沖液：1.5MTris，pH8.8(Bio-Rad)濃縮膠緩沖液：1.0MTris，pH6.8(Bio-Rad)一抗稀釋液(碧云天)化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore)脫脂奶粉(BD)本實施例的蛋白印跡(WB)實驗中所用抗體詳細信息參見下表1：表1蛋白印跡(WB)實驗中用到的抗體及稀釋度AntibodyHostDilutionCompanySSBP1rabbitpolyclonal1:1000AbcamGAPDHrabbitpolyclonal1:2000ProteinTech1.1.3主要儀器微型垂直電泳槽(Bio-Rad公司)MiniTrans-Blot微型電泳轉(zhuǎn)移槽(Bio-Rad公司)CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏公司)MettlerPE-160型電子天平(Mettler)低溫高速離心機(ThermoSorvall公司)MultiSKANMK3酶標儀(Thermo公司)動物活體成像儀(BrukerMI)1.1.4培養(yǎng)基及常用溶液配制DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone)、L15培養(yǎng)基(Sigma)使用前加入常量雙抗(Sigma)、10％FBS(Gibco)；ProteinloadingbufferPack(5×Loadingbuffer，20×Reducingagent，F(xiàn)ermentas)；電泳緩沖液(25mMTris-HCl，250mM甘氨酸，0.1％SDS)；1.0MTris-HCl(pH6.8)；1.5MTris-HCl(pH8.8)；10％過硫酸銨；封閉液：0.1MPBS(pH7.4)配制的5％脫脂奶粉或5％BSA；20×轉(zhuǎn)膜緩沖液(48mMTrisbase，39mM甘氨酸，20％甲醇)；丙烯酰胺凝膠配方如下表2所示：表2丙烯酰胺凝膠配方試劑10ml10％分離膠5ml5％濃縮膠膠H2O4.00ml3.40ml30％丙烯酰胺3.30ml0.83mlTris-HCl2.50ml(1.5MpH8.8)0.63ml(1.0MpH6.8)10％SDS0.10ml0.05ml10％過硫酸銨0.10ml0.05mlTEMED4.00μl5.00μl1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng)MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-231Bo細胞用含10％胎牛血清(Gibco)、100U/ml青霉素、100μl/ml鏈霉素的L15培養(yǎng)液(Sigma)培養(yǎng)于37℃、5％CO2和培養(yǎng)箱中。肺癌細胞A549、胃癌細胞SGC-7901、卵巢癌細胞A2780用10％胎牛血清(Gibco)、100U/ml青霉素、100μl/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(Sigma)。細胞培養(yǎng)排除支原體及真菌污染，所有細胞3個月之后丟棄并重新復(fù)蘇。1.2.2重組野生型SSBP1表達載體構(gòu)建以細胞系MDA-MB-231cDNA為模板，設(shè)計引物引入BamHI/EcoRI酶切位點，PCR擴增SSBP1的CDS區(qū)域，純化PCR擴增片段并用BamHI/EcoRI酶切，與同樣經(jīng)過BamHI/EcoRI酶切的pCDH載體連接，按照FermentasT4連接酶連接流程操作。引物序列如下：Forward：5’-CCGGAATTCGCCACCATGGACTACAAGGACGATGATGACAAGCTCGATGGAGGAATGTTTCGAAGACCTGTATT-3’Reverse：5’-CGCGGATCCCTACTCCTTCTCTTTCGTCT-3’1.2.3感受態(tài)細菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒抽提純化利用DH5α(Takara)感受態(tài)細菌轉(zhuǎn)化，按實驗室常規(guī)方法操作。所得克隆用質(zhì)粒小抽試劑盒抽提，酶切鑒定是否插入外源性片段，確定后有插入外源性片段的克隆送上海鉑尚生物有限公司送測序。測序正確的克隆制備質(zhì)粒，方法按照TIANGEN質(zhì)粒小抽提試劑盒操作說明進行。1.2.4包裝病毒本研究中使用慢病毒包裝體系，使用三質(zhì)粒系統(tǒng)：pCDH(過表達攜帶目的基因載體)或者GV122(攜帶干擾片段的載體)，psPAX2和pMD2.G(包裝質(zhì)粒)。將生長狀態(tài)良好的HEK-293T細胞接種至6cm的細胞培養(yǎng)皿中，到第二天約90％以上的融合度，進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑用PEI，三質(zhì)粒的用量的摩爾比為1:1:1，總量為8.2μg。將4μg的pCDH/GV122或相應(yīng)的pcdh-SSBP1/shRNA，3μgpsPAX2和1.2μgpMD2.G與24μlPEI混合，室溫放置10min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；將混合液加入到已接好的HEK-293T細胞中，再加DMEM至總體積3ml；轉(zhuǎn)染8h后換3ml含10％FBS的DMEM，終止轉(zhuǎn)染；換液48h后取培養(yǎng)上清液，0.45μm的濾膜過濾，分裝，-70℃凍存?zhèn)溆谩?.2.5腫瘤細胞的病毒感染將生長狀態(tài)良好的腫瘤細胞(包括乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-468、肺癌細胞A549、胃癌細胞SGC-7901和卵巢癌細胞A2780)，接至6cm培養(yǎng)皿，第二天約達到50％的融合度，進行感染。用含10％FBS的L15(或者DMEM)培養(yǎng)基將病毒液1:1稀釋，在稀釋液中加polybrene至終濃度為8μg/ml；將稀釋液加到細胞中，培養(yǎng)8h后換含10％FBS的L15(或DMEM)培養(yǎng)基。相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)染效率采用Westernblot或者RealtimePCR進一步確定。1.2.6蛋白提取(1)貼壁細胞棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS清洗細胞兩遍并吸凈清洗液，將細胞培養(yǎng)皿置于冰上，加上適量蛋白裂解液，用細胞刮刀刮取細胞；(2)吸取裂解液于EP管，4℃冰浴40min，期間置震蕩器上震蕩數(shù)次；(3)14000rpm離心10min后，將上清轉(zhuǎn)移至新EP管；(4)取5μl使用BCA法測定蛋白濃度。(5)剩余蛋白上清添加5×Loadingbuffer和20×DTT，沸水浴10min變性；1.2.7Westernblot(1)分別配制10％聚丙烯酰胺凝膠分離膠、5％濃縮膠；(2)每孔蛋白30μg上樣；(3)70V電泳30min到達分離膠界面后改120V電泳繼續(xù)電泳至溴酚藍到達分離膠底部；(4)電泳結(jié)束后，采用冰浴濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Milipore)上，轉(zhuǎn)膜條件：220mA恒流50min；(5)將PVDF膜在PBST(PBSpH＝7.4，0.1％Tween20)中漂洗一次，浸入5％脫脂牛奶封閉液或者BSA封閉液中，室溫1h；(6)用一抗稀釋液稀釋一定濃度的一抗孵育膜4℃過夜；(7)PBST洗膜3次，每次10min；(8)再以脫脂牛奶稀釋一定濃度的過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1h；(9)PBST洗膜3次，每次10min；(10)等量混合曝光液中的A液和B液，適量滴加于PVDF膜蛋白面，放入成像儀暗室，進行曝光檢測。1.2.8細胞遷移、侵襲能力檢測實驗(1)取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，將細胞懸浮于空DMEM培養(yǎng)液中備用。(2)細胞濃度至2.5×105個/ml(乳腺癌細胞的遷移實驗)或5×105個/ml(乳腺癌細胞的侵襲實驗)，取200μL細胞懸液置于上室(遷移實驗)或者預(yù)置Matrigel的小室上室(侵襲實驗)，600μL含20％FBS培養(yǎng)液置于下室，放入細胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)15小時后將小室取出，加入10％多聚甲醛，固定20分鐘。后去除固定液，加適量結(jié)晶紫染色液染色20分鐘，然后小心洗去染色液，置于室溫中干燥。最后計數(shù)并拍照，每組設(shè)三個重復(fù)樣本。(肺癌細胞A549、胃癌細胞SGC-7901和卵巢癌細胞A2780的侵襲實驗選擇細胞數(shù)1×106/ml取200μL置于上室，其他步驟相同)1.2.9動物實驗(1)將5×105/只MDA-MB-231和MDA-MB-231Bo細胞通過尾靜脈注射到6-8周齡雌性裸鼠；(2)6周以后，給予每只裸鼠注射150mg/kg底物熒光素，于活體成像系統(tǒng)中進行成像，讀取信號值，并做統(tǒng)計分析。1.2.10免疫組化步驟脫蠟水化：60℃烤片過夜，依次置于二甲苯(×3次)、無水乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中浸泡5min。漂洗：PBS漂洗3次，每次5min?？乖迯?fù)：浸入枸椽酸鹽緩沖液，置于微波爐高火加熱10min，保溫10 min。重復(fù)漂洗步驟。消除內(nèi)源性過氧化物酶活性：3％H2O2孵育30min。重復(fù)漂洗步驟。一抗孵育：加入稀釋后的抗體，抗SSBP1(1:100)，抗p-SMAD3(1:100)，濕盒內(nèi)4℃過夜。重復(fù)漂洗步驟。二抗孵育：加入鼠抗兔(1:3000)，濕盒內(nèi)室溫孵育1h。重復(fù)漂洗步驟。顯色：顯微鏡下監(jiān)測DAB顯色過程3min，終止反應(yīng)。雙蒸水漂洗5min。蘇木素復(fù)染細胞核1min。雙蒸水漂洗5min。脫水封片：梯度酒精脫水，二甲苯透明(×3次)，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果。2實驗結(jié)果2.1SSBP1在乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細胞中低表達對MDA-MB-231,MDA-MB-231HM,MDA-MB-231Bo三株細胞系抽提線粒體蛋白質(zhì)，進行iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選差異表達蛋白。SSBP1的表達水平在MDA-MB-231HM，MDA-MB-231Bo中顯著下調(diào)。附圖1為線粒體蛋白SSBP1的iTRAQ質(zhì)譜結(jié)果圖；附圖2為線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)顯示SSBP1在MDA-MB-231、MDA-MB-231HM和MDA-MB-231Bo細胞系中差異表達的結(jié)果圖。隨后對三株細胞系線粒體蛋白進行WesternBlot驗證，證實了上述差異表達的結(jié)果。附圖3為Westernblot驗證SSBP1在MDA-MB-231、 MDA-MB-231HM和MDA-MB-231Bo這三株細胞系中表達情況的結(jié)果圖。我們進一步在乳腺癌細胞系中檢測SSBP1的mRNA表達水平，結(jié)果顯示，SSBP1在轉(zhuǎn)移能力較強的基底樣細胞系(BT549，MDA-MB-468，MDA-MB-231)中的表達水平顯著低于轉(zhuǎn)移能力較弱的Luminal細胞系(MCF-7，T47D，ZR-75-30)。附圖4為Real-TimePCR顯示SSBP1在乳腺癌細胞系中表達情況的結(jié)果圖。2.2SSBP1調(diào)控腫瘤細胞體外遷移侵襲我們選取了乳腺癌細胞MDA-MB-231和MDA-MB-468、肺癌細胞A549、胃癌細胞SGC-7901和卵巢癌細胞A2780五株細胞作為干擾SSBP1表達的細胞模型，選取MDA-MB-231Bo作為過表達SSBP1細胞模型。兩條獨立的shRNA片段干擾效果以及過表達SSBP1效果經(jīng)WesternBlot或Real-timePCR驗證。附圖5為Westernblot驗證干擾表達SSBP1和過表達SSBP1在乳腺癌細胞中的效果的結(jié)果圖。附圖17為Real-timePCR驗證SSBP1在肺癌細胞A549、胃癌細胞SGC-7901和卵巢癌細胞A2780中的干擾效果圖。接著我們進行了體外Transwell遷移和侵襲實驗。結(jié)果顯示：在MDA-MB-231和MDA-MB-468遷移和侵襲實驗中，相比較shCon組，SSBP1下調(diào)細胞的遷移和侵襲能力顯著增強。相反地，在MDA-MB-231Bo高轉(zhuǎn)移細胞中過表達SSBP1后，MDA-MB-231Bo體外轉(zhuǎn)移能力明顯下降。圖6是Transwell驗證在MDA-MB-231中干擾SSBP1表達后對侵襲和遷移的影響的結(jié)果圖，其中，圖6-1是實驗結(jié)果的代表性圖片，圖6-2是實驗結(jié)果的柱狀統(tǒng)計圖；圖7是Transwell驗證在MDA-MB-468中干擾SSBP1表達后對侵襲和遷移的影響的結(jié)果圖，其中，圖7-1是實驗結(jié)果的代表性圖片，圖7-2是實驗結(jié)果的柱狀統(tǒng)計圖；圖8是實Transwell驗證在MDA-MB-231Bo中過表達SSBP1后對侵襲的影響的結(jié)果圖，其中，圖8-1是實驗結(jié)果的代表性圖片，圖8-2是實驗結(jié)果的柱狀統(tǒng)計圖。圖18是Transwell驗證在肺癌細胞A549 中干擾SSBP1表達后對侵襲和遷移的影響的結(jié)果圖；圖19是Transwell驗證在卵巢癌細胞系A(chǔ)2780中干擾SSBP1表達后對侵襲和遷移的影響的結(jié)果圖；圖20是Transwell驗證在胃癌細胞SGC-7901中干擾SSBP1表達后對侵襲和遷移的影響的結(jié)果圖。2.3SSBP1調(diào)控乳腺癌細胞體內(nèi)遷移侵襲為了進一步明確SSBP1在體內(nèi)調(diào)控乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的能力，我們將MDA-MB-231shCon、MDA-MB-231shSSBP1#1、MDA-MB-231BoCon、MDA-MB-231BoSSBP1四株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞標記Luciference熒光質(zhì)粒后以5×105細胞濃度給予BALB/c裸小鼠尾靜脈注射，6周后進行裸小鼠活體成像。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SSBP1沉默組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶明顯多于對照組，而SSBP1過表達組小鼠的肺部轉(zhuǎn)移灶明顯少于對照組。結(jié)果說明SSBP1對于乳腺癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用。圖13是小鼠活體成像驗證干擾表達和過表達SSBP1后體內(nèi)轉(zhuǎn)移效果的結(jié)果圖。2.4沉默SSBP1可以激活乳腺癌細胞的TGF-β信號通路我們檢測了TGF-β/SMAD信號通路中的重要節(jié)點。Real-timePCR和Elisa實驗均顯示，沉默SSBP1可以促進MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞轉(zhuǎn)錄和分泌TGF-β，而過表達SSBP1可以抑制MDA-MB-231Bo細胞分泌TGF-β。圖11是Real-timePCR檢測SSBP1干擾和過表達后TGF-β的mRNA水平：其中，圖11-1是MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞株的實驗結(jié)果圖、圖11-2是MDA-MB-231Bo細胞株的實驗結(jié)果圖；圖12是ELISA檢測SSBP1干擾和過表達后TGF-β的分泌水平：其中，圖12-1是MDA-MB-231和MDA-MB-468細胞株的實驗結(jié)果圖、圖12-2是 MDA-MB-231Bo細胞株的實驗結(jié)果圖；同時，通過WesternBlot檢測TGF-β信號通路中p-SMAD3、SMAD3、SMAD7和TβR1等重要節(jié)點分子的表達情況，圖9是WB檢測TGF-β信號通路相關(guān)分子的結(jié)果圖；發(fā)現(xiàn)SSBP1沉默組細胞分泌TGF-β增加后，SMAD3磷酸化水平明顯升高，而TGF-β受體TβR1以及TβR1抑制分子SMAD7都沒有明顯變化。在MDA-MB-231Bo細胞中過表達SSBP1可以觀察到相關(guān)分子的相反變化。用TGF-β信號通路抑制劑處理后，能顯著抑制SSBP1干擾所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，圖10是TGF-β信號通路抑制劑處理后，逆轉(zhuǎn)SSBP1對轉(zhuǎn)移的影響結(jié)果圖。2.5SSBP1的表達對乳腺癌患者預(yù)后、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系接下來，在臨床標本中進一步驗證了這一結(jié)論。根據(jù)SSBP1表達情況，將250例標本分為高表達組和低表達組。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示：SSBP1低表達患者更容易出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)，Log-rank檢驗提示P<0.001；上述結(jié)果提示SSBP1可作為乳腺癌患者獨立預(yù)后因素。進行Spearman相關(guān)分析顯示：SSBP1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)(P＝0.009)。單因素生存分析結(jié)果顯示：SSBP1的表達(P<0.001)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(P<0.001)以及腫瘤組織學(xué)分級(P＝0.038)均是無病生存期的影響因素。應(yīng)用Cox風(fēng)險模型對生存資料進行多因素分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性(HR＝2.23，P＝0.007)和SSBP1的低表達(HR＝0.385，P＝0.002)是危險因素，SSBP1表達降低，復(fù)發(fā)風(fēng)險增加。圖14是臨床標本中檢測SSBP1與患者的生存率的結(jié)果圖；圖15是臨床標本中檢測SSBP1與患者的腫瘤分期的結(jié)果圖；圖16是臨床標本中檢測SSBP1與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的結(jié)果圖。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，上述各實施方式是實現(xiàn)本發(fā)明的具體實施例，而在實際應(yīng)用中，可以在形式上和細節(jié)上對其作各種改變，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3