本發(fā)明涉及一種植物總黃酮的提取與測定方法，具體是一種黑草總黃酮提取物的提取方法與測定方法。

背景技術(shù)：

自然界很多植物含有黃酮類化合物。據(jù)估計，我國傳統(tǒng)中草藥有 20％含有黃酮類化合物。黃酮一直是醫(yī)藥及食品工業(yè)的熱點研究物質(zhì)，因為黃酮類化合物具有多種生理作用，例如蘆丁、槲皮素、槲皮苷能增強心臟收縮，減少心臟搏動次數(shù)；法爾杜鵑素、紫花杜鵑素等有止咳祛痰作用；牡荊素、漢黃芩素等具有抗腫瘤活性；水飛薊素有保肝作用等。植物所含的黃酮一般不以單一成分存在，而以幾種結(jié)構(gòu)相似或相近的成分共同存在，其總量稱為總黃酮含量。

黑草為玄參科鬼羽箭屬植物Buchnera cruciata Hamilt.的干燥全草，又名幼克草、克草、黑骨草、羽箭草，分布于我國江西、福建、湖南、湖北、廣東、廣西、貴州和云南等地，在廣西各地均有分布。其味微苦，寒，性涼，具有清熱，涼血，解毒等功效，用于治療流行感冒、中暑腹痛、蛛網(wǎng)膜下腔出血、暑熱口渴、腹痛、蕁麻疹等疾患。

目前已有相關(guān)黑草的研究，【文獻】黑草醇提物的藥理作用研究【作者】李燕婧，鐘正賢，張穎，盧文杰，牙啟康【刊名】廣西中醫(yī)藥, 2012,35(1):49-51，通過黑草提取物進行相關(guān)藥理試驗，證明黑草提取物具有一定的抗凝、抗炎、鎮(zhèn)痛和抗過敏作用，且毒性小，對于黑草成分的檢測也已有相關(guān)研究，【文獻】黑草藥材 HPLC指紋圖譜的研究【作者】劉吉成，陳大建【刊名】藥物分析雜志, 2013, 33(3): 424-428，報道了以木犀草素素成分為參照峰，采用 HPLC法建立黑草藥材的指紋圖譜，對不同產(chǎn)地的黑草進行了檢測，所建立的指紋圖譜，為黑草藥材的質(zhì)量控制提供參考，進而對于其相應(yīng)制劑的質(zhì)量控制也會起積極的作用；色譜柱：Agilent Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動相：乙腈與 0.7％冰醋酸，梯度洗脫；流速1.0 mL·mi n^-1；檢測波長350 nm；柱溫：35℃；進樣量：10μl?！疚墨I】黑草的化學(xué)成分研究【作者】盧文杰，牙啟康，陳家源，譚曉，黃艷，李曉華，周斌【刊名】中草藥, 2012, 43(6): 1079-1081，對黑草的化學(xué)成分進行了檢測，黑草提取物的提取方法為：將乙醇回流所得浸膏用水混懸，用石油醚萃取。所得石油醚萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯體積比分別為100：0和70：30進行梯度洗脫，TLC檢測，合并相同組分，再經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜得到化合物B-胡蘿卜苷、谷甾醇、甘露醇、正二十七烷醇、植醇、二十九烷、棕櫚酸、十八碳烯酸，醋酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，以醋酸乙酯-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，再經(jīng)反復(fù)重結(jié)晶，得到化合物芹菜素、木犀草素、香葉木素?！疚墨I】HPLC測定黑草中木犀草素和芹菜素的含量【作者】劉 吉成【刊名】中國實驗方劑學(xué)雜志, 2012,18(20):72-74，黑草用甲醇回流提取，所得提取液用高效液相色譜測定黑草藥材中木犀草素和芹菜素的含量，液相色譜條件為：Agilent Extend C18(4.6 mm×250 mm，5μm)色譜柱分離，以乙腈：0.7%冰醋酸 (30：70)為流動相，流速 1.0 mL·min^-1，檢測波長350 nm；柱溫35℃，進樣量l0μL。

黑草具有極高的藥用價值，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有公開對黑草總黃酮含量及總黃酮中的成分含量，因此無法確定黑草總黃酮的藥用機理，阻礙了黑草藥用價值的開發(fā)。本發(fā)明提供了一種黑草總黃酮的提取方法和測定方法，同時對總黃酮中的木犀草素、芹菜素及香葉木素的含量進行了測定。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種黑草總黃酮的提取方法和測定方法，同時用高效液相色譜法對總黃酮中的木犀草素、芹菜素及香葉木素的含量進行了準確測定，方法合理、穩(wěn)定性好，為黑草藥用價值的研究提供了參考數(shù)據(jù)，有利于黑草的進一步開發(fā)利用。

本發(fā)明所述的黑草總黃酮的提取方法，包括如下步驟：

（1）D101大孔樹脂的預(yù)處理：以體積濃度95%乙醇浸泡D101大孔樹脂20-30h，充分溶脹后，除去上浮樹脂及雜物，用濕法裝柱，繼續(xù)用體積濃度95%乙醇不斷洗滌，洗至流出液與水混合無白色渾濁現(xiàn)象，改用水洗至無醇味，備用；所述流出液與水混合的體積比為1:3；

（2）藥材的提取、濃縮：取黑草藥材，粉碎成粗粉，加入10倍于黑草重量的體積濃度60%乙醇；加熱回流提取5次，每次2小時，提取液濾過，合并濾液；濾液回收乙醇，并濃縮至無醇味；

（3）將步驟（2）中的濃縮液上至（1）柱中，用體積濃度5%-95%乙醇洗至顏色較淺，收集并濃縮至干，即得黑草總黃酮。

所述的黑草總黃酮含量以蘆丁計算不少于重量含量50.0%。

本發(fā)明提供了一種黑草總黃酮提取物的測定方法，采用分光光度法測定黑草總黃酮提取物，包括以下步驟：

（1）對照品儲備液的制備：精密稱取蘆丁對照品，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為0.2074mg/mL的溶液；

（2）標準曲線的繪制：分別精密吸取對照品儲備液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別至25mL量瓶中，分別加水至6.0mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6分鐘，加重量含量10%硝酸鋁1.0mL，搖勻，放置6分鐘；加重量含量4%氫氧化鈉溶液10.0mL，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘。于500nm波長處測定吸光度A，并進行空白對照，以對照品吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標繪制標準曲線；

（3）樣品測定：精密吸取供試品溶液2mL，至25mL量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，加水至6.0mL，加重量含量5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6分鐘，加10%硝酸鋁1.0mL，搖勻，放置6分鐘；加4%氫氧化鈉溶液10.0mL，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘。于500nm波長處測定吸光度，并進行空白對照，計算出總黃酮的含量，黑草中總黃酮含量以蘆丁計算不少于重量含量50%。

本發(fā)明還提供了一種液相色譜法同時測定黑草總黃酮中木犀草素、芹菜素及香葉木素的含量的方法，其液相色譜條件為：

色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)色譜柱；

流動相：乙腈-0.1%磷酸（25：75）；

流速為1mL/min；

檢測波長為350nm，進樣量為10μL。

含量測定方法包括以下步驟：

（1）對照品溶液的制備：分別精密稱取木犀草素對照品14.53mg、芹菜素對照品4.32mg以及香葉木素對照品4.25mg，置于同一50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得木犀草素濃度為290.6μg/mL、芹菜素濃度為86.4μg/mL及香葉木素濃度為85μg/mL的對照品儲備液。取對照品儲備液2mL，置25mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，得木犀草素濃度為23.25μg/mL、芹菜素濃度為6.91μg/mL及香葉木素濃度為6.8μg/mL的對照品溶液。

（2）供試品溶液的制備：精密稱取樣品10mg，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻、濾過即得。

（3）樣品的測定：對對照品溶液及供試品溶液進行高效液相色譜分析，記錄峰面積，并基于所得到的液相色譜分析結(jié)果，采用外標法計算所述黑草總黃酮中木犀草素、芹菜素及香葉木素的含量。黑草總黃酮中木犀草素含量不少于重量含量5%、芹菜素含量不少于重量含量1.5%、香葉木素含量不少于重量含量0.5%；

本發(fā)明還提供了一種黑草中總黃酮的提取和測定方法，高效液相色譜法可有有效測定出黑草總黃酮中木犀草素、芹菜素及香葉木素的含量。黑草總黃酮具有抗凝、抗炎、鎮(zhèn)靜和抗過敏作用，且毒性小，本發(fā)明為黑草總黃酮的藥用價值開發(fā)提供了參考數(shù)據(jù)。

測定過程包括以下步驟：

（1）色譜條件為：

色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18：4.6×250mm，5μm色譜柱；

流動相：乙腈-0.1%磷酸；

流速為1mL/min；

檢測波長為350nm，進樣量為10μL；

所述流動相的體積比為25:75；

（2）步驟：

（A）對照品溶液的制備：分別精密稱取木犀草素對照品14.53mg、芹菜素對照品4.32mg以及香葉木素對照品4.25mg，置于同一50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得木犀草素濃度為290.6μg/mL、芹菜素濃度為86.4μg/mL及香葉木素濃度為85μg/mL的對照品儲備液。取對照品儲備液2mL，置25mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，得木犀草素濃度為23.25μg/mL、芹菜素濃度為6.91μg/mL及香葉木素濃度為6.8μg/mL的對照品溶液；

（B）供試品溶液的制備：精密稱取樣品10mg，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻、濾過即得；

（C）樣品的測定：對對照品溶液及供試品溶液進行高效液相色譜分析，記錄峰面積，并基于所得到的液相色譜分析結(jié)果，采用外標法計算所述黑草總黃酮中木犀草素、芹菜素及香葉木素的含量。

上述黑草總黃酮的測定方法中，草總黃酮中木犀草素含量不少于重量含量5%、芹菜素含量不少于重量含量1.5%、香葉木素含量不少于重量含量0.5%。

附圖說明

圖1 對照品色譜圖。

圖2 供試品色譜圖。

具體實施例

實施例1

（1）D101大孔樹脂的預(yù)處理

以95%乙醇浸泡D101大孔樹脂24h，充分溶脹后，除去上浮樹脂及雜物，用濕法裝柱，繼續(xù)用體積濃度95%乙醇不斷洗滌，洗至流出液與水體積比1:3混合無白色渾濁現(xiàn)象，改用水洗至無醇味，備用。

（2）藥材的提取、濃縮

取黑草藥材100g，粉碎成粗粉，加入1000mL體積濃度60%乙醇；加熱回流提取5次，每次2小時，提取液濾過，合并濾液；濾液回收乙醇，并濃縮至無醇味。

（3）將步驟（2）中的濃縮液上至（1）柱中，分別用體積濃度10%，30%，50%，70%，95%乙醇洗至顏色較淺，收集并濃縮至干。

（4）洗脫液采用薄層色譜法進行檢視，發(fā)現(xiàn)體積濃度70%乙醇洗脫部位所得黃酮種類最多，即得黑草總黃酮。

實施例2

（1）儀器與試藥

①儀器：UV2550紫外-可見分光光度計（日本島津公司）、XS205電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）

②試藥：蘆丁對照品（中檢所，100080-200306）、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉

（2）溶液的制備

①對照品儲備液的制備：精密稱取蘆丁對照品10.37mg，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得（濃度為0.2074mg/mL）。

②標準曲線的繪制：分別精密吸取對照品儲備液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別至25mL量瓶中，分別加水至6.0mL，加重量含量5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6分鐘，加重量含量10%硝酸鋁1.0mL，搖勻，放置6分鐘；加重量含量4%氫氧化鈉溶液10.0mL，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘。于500nm波長處測定吸收度，以對照品吸收度（A）對濃度（C，mg/mL）進行線性回歸，得回歸方程：

A=12.489C+0.0025(r²=0.9997)

③供試品溶液的制備：分別精密稱取樣品23.22mg、23.39mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

④空白溶液的制備：以相應(yīng)溶液作為空白。

（3）樣品測定

精密吸取供試品溶液2mL，至25mL量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，加水至6.0mL，加重量含量5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6分鐘，加重量含量10%硝酸鋁1.0mL，搖勻，放置6分鐘；加重量含量4%氫氧化鈉溶液10.0mL，再加水至刻度，搖勻，放置15分鐘。于500nm波長處測定吸收度，計算出總黃酮的含量（以蘆丁計）

（4）結(jié)果計算

從回歸方程計算出供試品溶液中總黃酮的濃度，進而計算出總黃酮的含量（以蘆丁計）。黑草中總黃酮含量以蘆丁計算不少于重量含量50%。

實施例3

（1）儀器與試藥

儀器：高效液相色譜儀LC-10A（日本島津公司）、威瑪龍色譜工作站、XS205電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）

試藥：木犀草素對照品（上海源葉生物科技有限公司，LOT：YA0408YA13）、芹菜素對照品(上海源葉生物科技有限公司，LOT:K18D5C1)、香葉木素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：PM0509RA13）、甲醇、乙腈、磷酸。

（2）溶液的制備

①對照品溶液的制備：分別精密稱取木犀草素對照品14.53mg、芹菜素對照品4.32mg以及香葉木素對照品4.25mg，置于同一50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得木犀草素濃度為290.6μg/mL、芹菜素濃度為86.4μg/mL及香葉木素濃度為85μg/mL的對照品儲備液。取對照品儲備液2mL，置25mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，得木犀草素濃度為23.25μg/mL、芹菜素濃度為6.91μg/mL及香葉木素濃度為6.8μg/mL的對照品溶液。

②供試品溶液的制備：精密稱取樣品10mg，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻、濾過即得。

（3）樣品的測定

用高效液相色譜儀LC-10測定對照品溶液及供試品溶液。色譜條件為：采用安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)色譜柱，流動相為乙腈-0.1%磷酸的體積比為25:75，流速為1mL/min，檢測波長為350，進樣量為10μL。

（4）計算結(jié)果

根據(jù)得到的對照品及樣品的色譜圖，記錄峰面積，采用外標法計算含量。本發(fā)明黑草總黃酮中木犀草素含量不少于5%、芹菜素含量不少于1.5%、香葉木素含量不少于0.5%。

實施例4 黑草總黃酮藥理作用實驗

（1）黑草總黃酮對小鼠凝血時間的影響

取18～22g小鼠50只，雌雄各半，隨機分為空白對照組，黑草總黃酮高、中、低劑量組（10.0，5.0，3.0g/kg）和陽性阿司匹林組（0.2g/kg）,每組10只小鼠。用藥各組均予灌胃給藥，空白對照組給予等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)7d。末次給藥1h后，用內(nèi)徑為1mm的玻璃毛細管插入小鼠眥球后靜脈叢取血，至毛細玻璃管血柱達5cm為止，每隔30s折斷毛細玻璃管一小段，同時用肉眼觀察血柱是否移動，仔細檢查有無血絲出現(xiàn)，計算從毛細管采血到凝血絲出現(xiàn)的時間，進行組間比較。結(jié)果見表1。

結(jié)果表明：與空白對照組比較，黑草總黃酮高、中、低劑量組及阿司匹林組均能明顯延長小鼠凝血時間（P﹤0.05或P﹤0.01），提示黑草總黃酮具有抗凝血作用。

（2）黑草總黃酮對醋酸所致小鼠扭體次數(shù)的影響取18～22g小鼠50只，雌雄各半，隨機分為空白對照組，黑草總黃酮高、中、低劑量組（10.0，5.0，3.0g/kg）和陽性阿司匹林組（0.2g/kg）,每組10只小鼠。用藥各組均予灌胃給藥，空白對照組給予等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)7d。末次給藥1h后，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2mL，立即觀察并記錄20min內(nèi)各小鼠的扭體次數(shù)。比較給藥各組與空白對照組之間的差異，評價受試藥的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果見表2。

結(jié)果表明：與空白對照組比較，黑草總黃酮高、中、低劑量組及阿司匹林組均能明顯減少小鼠扭體次數(shù)（P﹤0.05或P﹤0.01），提示黑草總黃酮具有鎮(zhèn)痛作用。

（3）黑草總黃酮對巴豆油所致小鼠耳廓腫脹的抑制作用取18～22g小鼠50只，雌雄各半，隨機分為空白對照組，黑草總黃酮高、中、低劑量組（10.0，5.0，3.0g/kg）和陽性阿司匹林組（0.2g/kg）,每組10只小鼠。用藥各組均予灌胃給藥，空白對照組給予等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)7d。末次給藥0.5h后，用微量注射器取0.05mL2%巴豆油溶液涂于小鼠右耳。4h后處死小鼠，立即用口徑為8mm的打孔器沿著小鼠左右耳廓相同部位打孔取材，然后在電子天平上分別稱重，以兩耳片重量（mg）的差值作為腫脹程度指標，并求出百分抑制率（%）。結(jié)果見表3。

結(jié)果表明：與空白對照組比較，黑草總黃酮高、中、低劑量組及阿司匹林組均能明顯降低小鼠耳廓腫脹程度（P﹤0.05），提示黑草總黃酮具有抗炎作用。

（4）黑草總黃酮對小鼠被動皮膚過敏試驗

抗原：醫(yī)藥天花粉。佐劑：4%氫氧化鋁凝膠。臨用時以3.75mg天花粉溶于1.5mL氫氧化鋁凝膠中。致敏：健康小鼠10只，體重18～22g，將上述天花粉氫氧化鋁凝膠混懸液予腳掌注射，每只小鼠的兩只后腳掌各注入0.05mL，共注射0.1mL。15天后，斷頭取血，離心取抗血清備用。

被動皮膚致敏試驗：取18～22g小鼠50只，雌雄各半，隨機分為空白對照組，黑草總黃酮高、中、低劑量組（10.0，5.0，3.0g/kg）和陽性息斯敏組（0.01g/kg）,每組10只小鼠。用藥各組均予灌胃給藥，空白對照組給予等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)7d。取上述血清（10只致敏小鼠的混合抗血清）加生理鹽水稀釋成1：5，每鼠腹壁皮內(nèi)注射兩個點（相距0.2cm），每點0.03mL。再連續(xù)給藥2天，于末次給藥12h后，每只小鼠進行抗原攻擊，尾靜脈注射天花粉2.5mg/mL（用1%伊文思藍-生理鹽水配制），0.2mL/只，20min后處死動物，剪下腹部藍斑皮膚（0.5g）,剪碎，浸泡于丙酮生理鹽水溶液（7：3）5mL中48小時，離心取上清液，用分光光度計于610nm波長處測定吸收度，并作組間比較，評價藥物的抗過敏作用。結(jié)果見表4。

結(jié)果表明：與空白對照組比較，黑草總黃酮高、中劑量組及息斯敏組均能明顯降低小鼠皮膚藍斑吸光度（P﹤0.05或P﹤0.01），提示黑草總黃酮具有皮膚抗過敏作用。

（5）急性毒性試驗表明，黑草總黃酮的最大給藥量為410g生藥/kg體重。

黑草總黃酮高、中、低劑量組及阿司匹林組均能明顯延長小鼠凝血時間（P﹤0.05或P﹤0.01）；黑草總黃酮高、中、低劑量組及阿司匹林組均能明顯減少小鼠扭體次數(shù)（P﹤0.05或P﹤0.01）；黑草總黃酮高、中、低劑量組及阿司匹林組均能明顯降低小鼠耳廓腫脹程度（P﹤0.05）；黑草總黃酮高、中劑量組及息斯敏組均能明顯降低小鼠皮膚藍斑吸光度（P﹤0.05或P﹤0.01）。急性毒性試驗表明，黑草總黃酮的最大給藥量為410g生藥/kg體重。說明黑草總黃酮具有抗凝、抗炎、鎮(zhèn)痛和抗過敏作用，且毒性小。