專利名稱：用藥草提取物預(yù)防或治療牙周病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和/或治療牙周病(periodontal disease)的組合物，其中包括黃連(Coptidis Rhizoma)提取物或者黃連和牽牛子(Pharbitidis Semen)的混合提取物作為活性成分；黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物作為活性成分用于預(yù)防和/或治療牙周病的用途；以及一種通過給予黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物來預(yù)防和/或治療牙周病的方法。黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物具有激發(fā)抗炎作用、成骨細(xì)胞分化和牙槽骨再生以及阻止牙槽骨損壞的活性。
背景技術(shù)：
牙周組織由牙槽骨、牙周膜和牙齦(齒齦)組成。牙槽骨牢固地連接于頜骨的基 骨上，為與牙根相鄰的2-3mm區(qū)域，但是通常全為包括上牙槽骨在內(nèi)的硬質(zhì)組織。牙槽骨會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而變矮，有時(shí)會(huì)暴露牙根。牙齒脫落也會(huì)導(dǎo)致牙槽骨丟失。牙槽骨和牙齒是通過牙周膜連接到一起的，牙周膜是未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，平均厚度為O. 2_。牙槽骨可以緩沖和分散咀嚼時(shí)的壓力，并且將牙齒的感覺通過牙周膜傳遞到牙槽骨。牙周膜是未分化間充質(zhì)細(xì)胞層，其結(jié)構(gòu)用于骨重塑并適應(yīng)壓力，而不損失整個(gè)纖維的結(jié)構(gòu)和功能。牙周膜中未分化的間充質(zhì)細(xì)胞移動(dòng)到鄰近的組織。該細(xì)胞移動(dòng)到牙槽骨用于骨重塑，并移動(dòng)到牙齒以通過不斷地形成膠原纖維緊緊地固定牙齒。牙齦是可從外面可以看到的口腔中支撐組織的一部分，通常也是疾病(牙齦炎)的起點(diǎn)。當(dāng)該疾病擴(kuò)散到支撐組織時(shí)，牙根表面和與牙齒周圍的骨組織連接的牙周膜就會(huì)被破壞，并引起隨后的牙槽骨損壞，從而引起牙周病。牙周病和齲齒是最常見的口腔疾病之一，其臨床癥狀包括牙齦出血、舌腫、形成牙周袋、附著齦丟失、牙槽骨損壞和口臭，牙周病是牙齒脫落的一個(gè)主要原因(Ali，R. W. et al.，J. Clin. PeriodontoI. 1997，24，830-835 ；Socransky, S. S. et al.，J. Clin.Periodontol. 1998，15，440-444)。牙周病是一種常見的由炎癥引起的慢性病，大約10%至60%的成年人有處于各種不同診斷階段的牙周病(Xiong, X. et al.，B JOG. 2006,113,135-143 ；Albandar, J. M. and T. E. Rams, Periodontol. 2000,2002,29,7-10)。牙周病的類型包括牙齦炎和牙周炎在牙齦炎中，軟組織和牙齦中有炎癥；在牙周炎中，牙周膜支撐組織、牙槽骨、牙骨質(zhì)頻和軟組織損壞(Kinane D. F. ,Periodontol. 2000,2001，25，8-20)。牙周病可以引起牙齒脫落，是一種細(xì)菌感染所致疾病，是由共存于被稱為牙斑的生物膜中的微生物及其引起炎癥的分泌物引起的(Feng, Z., and A. Weinberg,Periodontol. 2000，2006，40，50-76)。隨著人們年齡的增長(zhǎng)，當(dāng)牙槽骨因先天或者后天因素弱化時(shí)，就會(huì)引起諸如牙周炎或牙槽骨軟骨發(fā)育不良(alveolarosteochondrodyslpasia)等牙周病。上述的牙槽骨軟骨發(fā)育不良會(huì)因牙槽骨質(zhì)疏松、牙槽骨軟化癥和牙槽骨損失等從而引起牙齒脫落。牙槽骨可通過重塑來維持自身，所述重塑包括成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨溶解。這一代謝過程是受到激素系統(tǒng)和局部因素控制的，并且當(dāng)骨溶解超過骨形成導(dǎo)致骨量下降到低于極限時(shí)，就會(huì)引起諸如牙槽骨質(zhì)疏松等牙槽骨軟骨發(fā)育不良。成骨細(xì)胞能夠通過將有機(jī)物——類骨質(zhì)(osteoid)沉積于骨中來幫助骨形成，所述類骨質(zhì)由I型膠原蛋白(type lcollagen)、骨I丐蛋白(osteocalcin)、骨粘連蛋白(osteonectin)和誕蛋白(sialoprotein)組成。所生成的類骨質(zhì)隨后經(jīng)歷礦化，其中成骨細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)待沉積至類骨質(zhì)的不斷形成的羥磷灰石一一種磷酸鈣的晶體一的礦化。越來越多的研究顯示，牙周病和系統(tǒng)性疾病存在關(guān)聯(lián)，所述系統(tǒng)性疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病發(fā)作、中風(fēng)、糖尿病和妊娠綜合征(Desvarieux, M. et al. , Circulation,2005，111，576-582 ;Offenbacher，S. et al. , J.Periodontol.，1996，67，1103-1113 ；Garcia, R. I. et al.，Periodontol. 2000，2001，25，21-36 ;Champagne，C. M. et al.，J. Int.Acad. Periodontol.，2000，2，9-13 ;Paquette，D. W.，J. Int.，Acad. Periodontol. , 2002,4，101-119)。已報(bào)到的與牙周病相關(guān)的妊娠綜合征有早產(chǎn)、低出生重量、流產(chǎn)和先兆子癇(McCormick, M. C.，N. Engl. J. Med. , 1985, 312,82-90 ；Shennan, A. H.，BMJ, 2003, 327， 604-618)。因?yàn)檠乐懿?duì)公眾健康是個(gè)很大的威脅，所以最重要的是開發(fā)對(duì)牙周病有效的藥物。改善口腔衛(wèi)生、非外科治療及外科治療(刮治術(shù)、根面平整術(shù)、刮除術(shù)和牙槽組織再生)等被用來治療牙周病。由于外科方法——最有效的治療方法——由于需要入院治療而很麻煩，并且有疾病發(fā)生后才進(jìn)行的局限性，牙周病成為了一種慢性病?？股鼗蛘呔植砍掷m(xù)釋放制劑已被用作疊加治療，但是所述藥物會(huì)到達(dá)不必要的身體部分，引起諸如抗性等副作用。最近，已經(jīng)鑒定出了具有抗性的牙周病微生物。為了克服上述外科治療和使用抗生素的局限性并提高預(yù)防和治療效果，需要開發(fā)新的具有消炎活性并能夠使牙槽組織從破壞和丟失中恢復(fù)的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題開發(fā)牙周病治療的研究的結(jié)果是，本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)黃連提取物或者黃連和牽牛子提取物的混合物具有優(yōu)良的消炎活性、成骨細(xì)胞分化活性和牙槽骨再生活性，以及降低牙槽骨破壞的活性，并且通過確認(rèn)黃連和牽牛子的混合提取物與單獨(dú)的黃連提取物或者單獨(dú)的牽牛子提取物相比在上述活性方面有較高的藥理學(xué)協(xié)同效應(yīng)而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種黃連提取物或者具有最佳混合比例的黃連提取物和牽牛子提取物的混合物，其具有最有效的藥理學(xué)協(xié)同效應(yīng)。技術(shù)方案本發(fā)明涉及到一種組合物、用途以及用于預(yù)防和/或治療牙周病的方法，使用黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物作為活性成分。本發(fā)明中，單獨(dú)的黃連提取物和/或黃連和牽牛子的混合提取物具有激發(fā)消炎作用、成骨細(xì)胞分化和牙槽骨再生以及防止牙槽骨破壞的活性。本發(fā)明者已經(jīng)通過確認(rèn)黃連和牽牛子的混合提取物與單獨(dú)的黃連提取物或者單獨(dú)的牽牛子提取物相比具有較高的提高消炎活性、成骨細(xì)胞分化和牙槽骨再生的活性，以及降低牙槽骨破壞的活性，并通過鑒定黃連提取物和牽牛子提取物具有最高協(xié)同效應(yīng)的最佳比例完成了本發(fā)明。
黃連是一種屬于毛茛科(Ranuncul aceae family)的多年生草本植物,具有抗微生物活性、抗高血壓活性和消炎活性。在中醫(yī)學(xué)上，黃連被用作健胃藥以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、子宮、膀胱、氣管和神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑。已知黃連包含諸如黃連素、玉蘭堿等生物堿，作為主要的藥理成分(Chung and Shin, Pictured dictionary of herbal medicines,490-493,1990)。牽牛子是旋花科(Convolvulaceaefamily)的裂葉牽牛(Pharbitis nil Choisy)或圓葉牽牛(Pharbitis purpurea Voigt)的種子。裂葉牽牛起源于諸如印度等亞州熱帶，有256個(gè)變種，其中黑色和白色的種子分別稱為黑牽牛子和白牽牛子。破壞后，牽牛子有微弱的臭味、有刺激性，味苦，性寒并且有毒。牽牛子能夠引起腹瀉、有利尿活性、并且能夠用于慢性腎盂腎炎和肝硬化引起的水腫和腹水。牽牛子對(duì)慢性咳嗽和哮喘有效，并且還能夠用于便秘和驅(qū)除寄生蟲。藥理學(xué)活性包括引起腹瀉的蠕動(dòng)。牽牛子包括大約2%的牽牛子式、樹脂糖苷和11%的脂肪酸，包括油精(olein)、棕櫚精(palmitin)和硬脂精(stearin)(Moon,Composition and use of herbs,p589,1984)。同時(shí)，本發(fā)明的研究人員還申請(qǐng)了一項(xiàng)專利，通過闡明抑制一氧化氮(NO)形成的活性和活化堿性磷酸鹽的活性從而使用牽牛子治療牙周病(KR 10-2008-0035877，一種含有牽牛子提取物作為活性成分的用于預(yù)防和 治療牙周病的藥物組合物)。如上所述，本發(fā)明中的黃連和牽牛子的混合提取物或者單獨(dú)的黃連提取物具有消炎活性和成骨細(xì)胞分化活性，尤其是黃連和牽牛子的混合提取物具有比單獨(dú)的黃連提取物或者單獨(dú)的牽牛子提取物更高的活性。本發(fā)明的目的就是提供具有最佳組成比(具有較高的藥理學(xué)協(xié)同效應(yīng))的混合物及其制備方法。首先，本發(fā)明涉及黃連提取物或者黃連和牽牛子的混合提取物的激發(fā)消炎作用、成骨細(xì)胞分化和牙槽骨再生的活性，以及防止牙槽骨破壞的活性。更具體地，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一種用于預(yù)防和/或治療牙周病的組合物，其包含黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物作為活性成分。另一個(gè)實(shí)施方案提供了黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物作為活性成分用于預(yù)防和/或治療牙周病的用途，或用于制備預(yù)防和/或治療牙周病的藥劑的用途。還有一個(gè)實(shí)施方案提供了一種通過給予黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物來預(yù)防和/或治療牙周病的方法。該預(yù)防和/或治療牙周病的方法可以包括給予需要預(yù)防或治療牙周病的患者黃連提取物或者黃連和牽牛子的混合提取物作為活性成分的步驟，并任選地包括在給藥步驟前鑒別需要預(yù)防或者治療牙周病的患者或者患有牙周病的患者。 本發(fā)明中，術(shù)語“黃連和牽牛子的混合提取物”是指各自通過分別提取黃連和牽牛子所獲得的黃連提取物和牽牛子提取物的混合物，以及由黃連和牽牛子的混合物獲得的提取物。本文所用的術(shù)語“提取物”是指粗提物和/或所述粗提物的特定溶劑可溶性提取物或級(jí)分，它可以為溶液、濃縮劑或粉末等形式。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案可表征為與單獨(dú)使用黃連提取物或者單獨(dú)使用牽牛子提取物時(shí)相比，通過使用黃連和牽牛子的混合提取物在消炎活性和成骨細(xì)胞分化活性方面具有協(xié)同效應(yīng)。為了使在消炎活性和成骨細(xì)胞分化活性方面的協(xié)同效應(yīng)最大化，上述混合提取物中黃連提取物和牽牛子提取物之間的干物質(zhì)重量比為0.5 : I至30 : I (黃連提取物的重量牽牛子提取物的重量)，優(yōu)選I : I至25 : 1，更優(yōu)選2. 5 : I至20 : 1，甚至更優(yōu)選7.5 I至15 I。上述的“干物質(zhì)”是指不含用于提取的溶劑的物質(zhì)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的混合提取物可以是黃連提取物和牽牛子提取物的混合物。 黃連提取物可以是通過用一種或者多種選自水和具有1-4個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑提取黃連、優(yōu)選其根莖部分所得到的粗提物；或者可以是通過將至少一種具有1-6個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的水溶液，優(yōu)選丙醇水溶液、異丙醇水溶液和水飽和的丁醇加至所述粗提物所得到的溶劑可溶性提取物。牽牛子提取物可以是通過用一種或幾種選自水和具有1-4個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑提取牽牛子粉末所得到的粗提物；或者可以是通過將一種或者多種選自具有1-6個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的水溶液，優(yōu)選丙醇水溶液、異丙醇水溶液和水飽和的丁醇加至所述粗提物所得到的溶劑可溶性提取物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于制備黃連或牽牛子粗提物的溶劑可以是一種或多種選自以下的溶劑水，10-70% (v/v)、優(yōu)選20-60% (v/v)、更優(yōu)選25-55% (v/v)的具有1-4個(gè)碳的直鏈或支鏈醇，優(yōu)選甲醇水溶液和乙醇水溶液和水飽和丁醇。用于制備黃連或牽牛子的溶劑可溶性提取物的溶劑可以是一種或多種選自以下的溶劑10-70% (v/v)、優(yōu)選20-60% (v/v)、更優(yōu)選25-55% (v/v)的具有1-6個(gè)碳的直鏈或支鏈醇，優(yōu)選丙醇水溶液和異丙醇水溶液和水飽和丁醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的混合提取物可以是黃連和牽牛子混合物的提取物。例如，所述混合提取物可以是通過以下方式獲得的粗提物通過混合黃連和牽牛子，并用一種或多種選自水和具有1-4個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑提取所述混合物所得到的粗提物；或者可以是通過以下方式獲得的溶劑可溶性提取物通過將一種或多種選自具有1-6個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的水溶液(優(yōu)選丙醇水溶液、異丙醇水溶液和水飽和的丁醇)的溶劑加至所述粗提物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于制備黃連和牽牛子粗提物的溶劑可以是水，10-70% (v/v)、優(yōu)選20-60% (v/v)、更優(yōu)選約25-55% (v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或者水飽和丁醇。用于制備所述溶劑溶解提取物的溶劑可以是一種或多種選自10-70%(v/v)、優(yōu)選20-60% (v/v)、更優(yōu)選25-55% (v/v)的具有1_6個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的水溶液，優(yōu)選丙醇水溶液、異丙醇水溶液和水飽和丁醇。在另一方面中，本發(fā)明涉及到一種制備具有牙周病治療活性的黃連和牽牛子的混合提取物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，制備黃連和牽牛子的混合提取物的方法可以包括如下步驟用一種或多種選自水和具有1-4個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑來提取黃連從而得到黃連提取物，所述溶劑例如水，10-70% (v/v)、優(yōu)選20-60% (v/v)、更優(yōu)選25-55% (v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或水飽和丁醇；用一種或多種選自水和具有1-4個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑來提取牽牛子、優(yōu)選牽牛子粉末從而得到牽牛子提取物，所述溶劑例如水，10-70% (v/v)、優(yōu)選20-60% (v/v)、更優(yōu)選25-55% (v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液,或水飽和丁醇；并且將所獲得的黃連提取物和牽牛子提取物按干物質(zhì)含量計(jì)以O(shè). 5 : I至30 : 1(黃連提取物的重量牽牛子提取物的重量)、優(yōu)選I : I至25 I、更優(yōu)選2.5 I至20 I、最優(yōu)選7. 5 : I至15 : I的比例混合。制備黃連提取物的步驟和制備牽牛子提取物的步驟可以進(jìn)一步包括以下步驟將一種或多種選自具有1-6個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑(優(yōu)選水飽和丁醇、丙醇和異丙醇)加至所得到的提取物，從而獲得溶劑可溶性提取物。制備黃連提取物的步驟詳述如下將黃連切成小片，然后向其中加入量為約5-20倍體積、優(yōu)選7-15倍體積于所述原材料的一種或多種選自水和具有1-4個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑進(jìn)行回流提取，所述溶劑如水，10-70% (v/v)、優(yōu)選20-60% (v/v)、更優(yōu)選25-55%的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或者水飽和丁醇。雖然對(duì)提取溫度沒有特別限制，但是提取溫度優(yōu)選40-110°C，更優(yōu)選55-90°C。優(yōu)選地，將所得到的提取物進(jìn)行過濾并收集濾液，然后向殘留物中加入量為約5-15倍體積、優(yōu)選8-12倍體積的一種或多種選自水和具有1-4個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑進(jìn)行回流提取，所述溶劑如水，10-70% (v/v)、優(yōu)選20-60% (v/v)、更優(yōu)選25-55%的甲醇 水溶液或乙醇水溶液，或者水飽和丁醇。雖然對(duì)提取溫度沒有特別限制，但是提取溫度優(yōu)選40-110°C，更優(yōu)選55-90°C。提取后，過濾所述提取物，與之前獲得的濾液合并，并進(jìn)行真空濃縮，從而獲得黃連提取物。雖然將所得到的提取物與之前得到的濾液進(jìn)行合并能夠增加提取效率，但是對(duì)本發(fā)明提取物的提取次數(shù)并沒有限制。如果用于制備黃連提取物的溶劑量過少，則攪拌會(huì)比較困難并且提取物的溶解度下降，導(dǎo)致較低的提取效率。如果用于制備黃連提取物的溶劑量過多，則下一步純化時(shí)需要的低級(jí)醇的量就會(huì)增加，這樣會(huì)導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)問題和處理問題。因此優(yōu)選將所述溶劑的量調(diào)整到上述范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可在初次提取后進(jìn)行再次提取，旨在防止只進(jìn)行初次提取所致的提取效率下降，因?yàn)樵谒幉萏崛∥锏漠a(chǎn)量很高的情況下，即使進(jìn)行了有效的過濾，水分含量仍然會(huì)比較高從而導(dǎo)致藥草提取物的損失，因而只進(jìn)行初次提取的時(shí)候效率會(huì)降低。所以，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在初次提取后可以進(jìn)行再次提取。另外，由于在每一步中均檢測(cè)提取效率，已發(fā)現(xiàn)第二次提取時(shí)提取了約80-90%的總提取物量，因此可表明，兩步提取比超過第三次提取的多步提取具有更顯著的經(jīng)濟(jì)效益。為了控制保留在所得濃縮物中的低級(jí)醇含量，以使其適合用作藥物成分，可以將所述濃縮物用約10-30倍、優(yōu)選15-25倍、更優(yōu)選大約20倍重量的水(基于該濃縮物的總量)進(jìn)行1-5次、優(yōu)選2-3次共沸濃縮，并將等量的水加入其中從而使之均勻地懸浮，然后將所述懸液凍干制成粉末形式的黃連提取物。制備牽牛子提取物的步驟詳述如下碾磨牽牛子，然后向其中加入量為大約3-20倍體積、優(yōu)選5-15倍體積于所述原材料的一種或多種選自水和具有1-4個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑提取1-10小時(shí)，優(yōu)選2-5小時(shí)，所述溶劑如水，10-70% (v/v)、優(yōu)選20-60% (v/v)、更優(yōu)選25-55%的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或者水飽和丁醇。雖然對(duì)提取溫度沒有特別限制，但是提取溫度優(yōu)選40-1IO0C，更優(yōu)選55-90°C。優(yōu)選地，可以將所得到的提取物進(jìn)行過濾以收集濾液，然后向殘留物中加入量為約1-10倍體積、優(yōu)選4-7倍體積的一種或多種選自水和具有1-4個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑，例如水，10-70% (v/v)、優(yōu)選20-60% (v/v)、更優(yōu)選25-55 %的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或者水飽和丁醇，并且升高溫度再次提取
1-10小時(shí)，優(yōu)選2-5小時(shí)，接著將所得提取物進(jìn)行過濾并經(jīng)過真空濃縮得到牽牛子提取物。將所得到的提取物與前面得到的濾液合并能夠增加提取效率，但是對(duì)本發(fā)明提取物的提取次數(shù)并沒有限制。兩次提取并在每次提取之后將所獲得的濾液合并可以提高提取效率，但是對(duì)于提取次數(shù)并沒有限制。如果用于制備牽牛子提取物的溶劑的量過少，則攪拌會(huì)比較困難并且提取物的溶解度下降，導(dǎo)致較低的提取效率。如果用于制備牽牛子提取物的溶劑量過多，則下一步純化時(shí)需要的低級(jí)醇的量就會(huì)增加，這樣會(huì)導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)問題和處理問題。因此優(yōu)選將所述溶劑的量調(diào)整到上述范圍內(nèi)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在初次提取后可以進(jìn)行再次提取，旨在防止只進(jìn)行初次提取所致的提取效率下降，因?yàn)樵谒幉萏崛∥锏漠a(chǎn)量很高的情況下，即使進(jìn)行了有效的過濾，水分含量仍然會(huì)較高從而導(dǎo)致藥草提取物的損失，因而只進(jìn)行初次提取時(shí)效率會(huì)降低。所以，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在初次提取后可以進(jìn)行再次提取。另 夕卜，由于在每一步均檢測(cè)提取效率，已發(fā)現(xiàn)第二次提取提取了約80-90%的總提取物量，因此可表明，兩步提取比超過第三次提取的多步提取具有更顯著的經(jīng)濟(jì)效益。在將通過使用甲醇水溶液、乙醇水溶液或水飽和丁醇的初次和第二次提取所獲得的黃連提取物和/或牽牛子提取物過濾和濃縮后，可以另外使用溶劑溶解提取步驟以純化掉諸如蛋白質(zhì)、多糖、脂肪酸等不必要雜質(zhì)，所述溶劑溶解提取步驟是使用與上述濾液相同量的低級(jí)醇進(jìn)行1-10次,優(yōu)選2-4次溶劑分配(solvent partition)來盡行的。上述低級(jí)醇包括具有1-6個(gè)碳的直鏈或支鏈醇，優(yōu)選地可選自一種或者多種由一種或者多種丁醇、丙醇、異丙醇和水飽和丁醇組成的醇。因此，如果與濾液相比低級(jí)醇的用量較少，則會(huì)形成諸如脂肪酸等不必要雜質(zhì)的微小粒子，從而使得溶劑分配不順利，并且降低活性成分的提取量。所以，優(yōu)選將低級(jí)醇的量調(diào)整在上述范圍之內(nèi)。將溶劑分配后所得到的低級(jí)醇級(jí)分在50_60°C下于真空中進(jìn)行濃縮以除去殘留在樣品中的溶劑。為了控制所得到的濃縮物中殘留低級(jí)醇的含量，以使其適合用作藥物成分，可以將所述濃縮物用大約10-30倍、優(yōu)選15-25倍、更優(yōu)選大約20倍重量的水(基于該濃縮物的總量)進(jìn)行1-5次、優(yōu)選2-3次共沸濃縮，并將等量的水加入其中從而使之均勻地懸浮，然后將所述懸液凍干制成半固體或干燥形式的牽牛子提取物。如上所述制備的兩種提取物的混合組合物的制備過程如下所述。將上述得到的黃連提取物和牽牛子提取物混合，干物質(zhì)重量比為0.5 I至30 I (黃連提取物的重量牽牛子提取物的重量)，優(yōu)選地為I : I至25 1，更優(yōu)選地為2. 5 I至20 1，最優(yōu)選地為7. 5 : I至15 : I。為了將上述混合提取物中的每種提取物混合均勻，可以向所述混合提取物中加入
2-3倍重量的水，然后在50-60°C下真空濃縮，然后再向所得濃縮物中加入等量的水并使之均勻懸浮，再將所述懸液凍干制成粉末形式的混合物。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，上述的制備方法可以包含如下步驟混合黃連和牽牛子優(yōu)選牽牛子粉末，其重量比為O. 2 : I至25 : I (黃連重量牽牛子重量)，優(yōu)選為O. 5 I至20 I，更優(yōu)選為I. 5 I至15 I，以制備黃連和牽牛子的混合物；并且
用一種或多種選自水和具有1-4個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑，如水，10-70% (v/V)、優(yōu)選20-60% (v/v)、更優(yōu)選大約25-55% (v/v)的甲醇水溶液或乙醇水溶液，或者水飽和丁醇，提取黃連和牽牛子的混合物。上述方法可進(jìn)一步包括以下步驟在得到黃連和牽牛子混合物的提取物的步驟以后，加入一種或多種選自具有1-6個(gè)碳的直鏈或支鏈醇的溶劑，優(yōu)選丙醇、異丙醇和水飽和丁醇，以獲得溶劑可溶性提取物。制備上述粗提物和所述溶劑可溶性提取物的詳細(xì)步驟與上述制備每種提取物的
步驟一致。任何常用方法都可以用作本發(fā)明中所使用的提取方法。例如所述提取可以通過低溫提取、熱水提取、超聲波提取或者回流提取進(jìn)行，但不限于此。本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和治療牙周病的組合物，含有黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物作為活性成分。另外，黃連和牽牛子的混合提取物以及單獨(dú)的黃連提取物都可以用于預(yù)防、治療或減輕牙周病的癥狀，因?yàn)樵摶旌咸崛∥锞哂休^高的消炎和成骨細(xì)胞分化活性。因此，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和治療牙周病的組合物，包含黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物作為活性成分。上述的牙周病是選自口腔炎(stomatitis)、、牙銀炎(gingivitis)、牙周炎(periodontitis)、牙槽骨損傷(alveolar bone damage)、牙槽骨質(zhì)疏松(alveolarosteoporosis)、牙槽骨軟化癥(alveolar osteomalacia)、牙槽骨損失(alveolar boneloss)和牙槽骨軟骨發(fā)育不良(alveolar osteochondrodyslpasia)中的一種或幾種。本發(fā)明組合物中作為活性成分的提取物含量可因使用類型和目的、患者狀況和疾病嚴(yán)重程度而異，以干物質(zhì)含量計(jì)范圍是0. 001-99. 9重量％，優(yōu)選0. 1-50重量％，但不限于此。本發(fā)明的組合物可以通過多種途徑給予哺乳動(dòng)物，包括人類。其給藥可以通過常用方法進(jìn)行，例如，其給藥可通過口服給藥、直腸內(nèi)給藥、通過靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、子宮內(nèi)注射(intrauterine)或者腦室內(nèi)注射給藥,優(yōu)選口服給藥。本發(fā)明的組合物可以被配制成口服劑型，比如粉末劑、顆粒劑、片劑、膠囊、懸浮液、乳劑、糖漿、氣霧劑等；或者被配制成非口服劑型，如透皮劑、栓劑和無菌注射液等。本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括適合藥用的和生理上可接受的佐劑，比如載體、賦形劑和稀釋劑，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、無定型纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥苯甲酯、羥苯丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。在配制時(shí)，常用的稀釋劑或賦形劑，比如填充劑、增容齊 、粘合齊 、保濕劑、崩解劑和表面活性劑也可以使用。用于口服的固體制劑包括片劑、丸劑、粉末劑、顆粒劑和膠囊，并且所述制劑還可以通過將上述提取物與一種或多種賦形劑如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖或明膠混合制備。還可以使用諸如硬脂酸 鎂和滑石等潤(rùn)滑劑，來替代簡(jiǎn)單的賦形劑。用于口服的液體制劑包括懸液、液體和溶液、乳劑、糖漿，并且常用的水、液體石蠟和其它賦形劑(如保濕劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑)也可使用。非口服制劑包括滅菌的水溶液、非水性溶劑、懸液、乳劑、凍干制劑、直腸栓劑和透皮制劑。丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)和可注射用酯類(如油酸乙酯)等可以被用作非水溶劑或懸浮。栓劑的基料包括witepsol、macrogol、吐溫61、可可油、月桂精油、甘油和明膠。本發(fā)明的藥物組合物可以以單一制劑形式給予人，但是也可以通過使用普通方案或者通過與在考慮標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐下選擇的藥物載體混合來給藥。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以經(jīng)由口服、含服或舌下給藥方式給藥，其形式為含有淀粉或乳糖的片劑，僅膠囊或含有賦形劑的膠囊，或者含有用于掩蓋味道或著色的化學(xué)藥品的酏劑或懸液。這種液體制劑可以用可藥用的添加劑例如懸液(例如甲基纖維素、半合成甘油酯如witepsol、杏仁油和PEG-6酯的混合物、甘油酯混合物如PEG-8和辛/癸甘油酯)配制。本發(fā)明的藥物組合物的用藥劑量依據(jù)患者的年齡、體重、健康狀況和疾病嚴(yán)重程 度以及用藥類型而有所不同，并且根據(jù)醫(yī)生或藥劑師的判斷可以一天用藥一次或有固定時(shí)間間隔的幾次。例如，有效成分的每日劑量可以是O. l_500mg/kg，優(yōu)選O. 5_300mg/kg。上述劑量只是一個(gè)平均值，該劑量可以依據(jù)個(gè)體差異而有所增加或減少。優(yōu)選具有上述劑量范圍，因?yàn)楫?dāng)本發(fā)明藥物組合物的每日劑量低于上述劑量的時(shí)候，不會(huì)獲得有意義的效果，而劑量高于上述劑量時(shí)不僅會(huì)造成浪費(fèi)還可能會(huì)引起不想要的副作用。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于改善和/或預(yù)防牙周病的健康功能食品，含有黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物。該健康功能食品可以是各種食物、飲料或食品添加劑等。所述健康功能食品中所包含的作為活性成分的提取物含量可依據(jù)食品類型、期望用途等被合適地改變，但沒有特別限制。例如，加入的量可以占食品總重量的0.01-15wt%;并且對(duì)于健康飲料組合物，可以加入的量為O. 02-10克，優(yōu)選O. 3-1克，以IOOml所述組合物計(jì)。除含有特定比例的上述提取物作為必需成分外，所述健康飲料組合物中的液體組分沒有特別的限制，并且可以包含各種興奮劑(cordial)或天然的碳水化合物。上述天然的碳水化合物包括單糖如右旋糖和果糖，二糖如麥芽糖和蔗糖，多糖，常用糖如糊精和環(huán)糊精，以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇和赤蘚糖醇。除上述之外的興奮劑，也可以有效地使用天然興奮劑(奇甜蛋白、甜菊提取物例如新蛇菊苷A(rebaudioside A)、甘草阜苷等)以及合成強(qiáng)心劑(糖精、阿司帕坦等)。上述天然碳水化合物的加入量可以是1-20克，優(yōu)選5-12克，以IOOml所述組合物計(jì)。本發(fā)明的組合物還可以含有各種營(yíng)養(yǎng)素、維生素、礦物質(zhì)(電解質(zhì))、調(diào)味劑如合成的和天然的調(diào)味劑、著色劑、增稠劑(乳酪或巧克力)、果膠酸及其鹽、藻酸及其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)性膠體增粘劑、PH調(diào)控劑、穩(wěn)定劑、防腐劑。甘油、醇和碳酸化劑可以應(yīng)用于碳酸飲料中。本發(fā)明的組合物還可以包括天然的果汁、果汁飲料和果肉以制作植物飲料。上述成分可以單獨(dú)或者組合使用。這些添加物的比例并不重要，但是一般選擇0-20重量份，以100重量份計(jì)。在又另一方面，本發(fā)明還提供了含有上述黃連提取物或黃連和牽牛于的混合提取物的口服產(chǎn)品。上述口服產(chǎn)品對(duì)預(yù)防和治療牙周病有效。上述口服產(chǎn)品可以包括牙膏、漱口水、口腔噴霧劑、口香糖、軟膏和貼片。上述口服產(chǎn)品還可以包含選自研磨劑、保濕劑、粘合劑、發(fā)泡劑、甜味劑、防腐劑、增效劑(efficacy agent)、調(diào)味劑、酸度調(diào)控劑和增白劑的添加劑。例如，上述研磨劑可以包括一種或幾種選自磷酸二鈣、二氧化硅沉淀、碳酸鈣、含水氧化鋁、高嶺土和碳酸氫鈉的研磨劑，研磨劑的含量范圍是20-60重量％ (占總重量的百分比，下同)，但不限于此。上述保濕劑可以包括一種或幾種選自甘油、山梨糖醇、無結(jié)晶山梨糖醇溶液、丙二醇、聚乙二醇和木糖醇的保濕劑，保濕劑的含量范圍為20-60重量％，但不限于此。上述粘合劑可以包括一種或幾種選自角叉菜膠、黃原膠、羧甲基纖維素鈉、羧基乙烯基聚合物、藻酸鈉和Iaponite的粘合劑,研磨劑的含量范圍為O. 1-3. O重量％,優(yōu)選O. 5-2. O重量％，但不限于此。上述發(fā)泡劑可以包括一種或幾種選自陰離子表面活性劑如十二烷基硫酸鈉和月桂酰肌氨酸鈉、縮聚物如失水山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油和聚氧乙烯、聚氧丙烯的發(fā)泡劑，研磨劑的含量范圍可以是O. 5-5. O重量％，優(yōu)選 O. 5-3. 5重量％，但不限于此。上述甜味劑可以包括一種或超過兩種選自糖精鈉、阿司帕坦和甘草酸的甜味劑，保濕劑的含量范圍是O. 05-0. 5重量％，但不限于此。上述防腐劑可以包括一種或超過兩種選自P-氧代苯甲酸酯和苯甲酸鈉的防腐劑。上述增效劑可以包含氟化鈉、酸化磷酸鹽氟化物(acidulated phosphate fluoride)、氟化亞錫、氟化胺(aminefluoride)、氯己定、氨甲環(huán)酸(tranexamic acid)、尿囊素(allantoin)、己酸(caproicacid)、多磷酸鹽(polyphosphates)、酶和藥草提取物。上述調(diào)味劑可以包含以合適比例混合的胡椒薄荷油(peppermint oil)、綠薄荷油(spearmint oil)、薄荷醇(menthol)和香芹酮(carvone)。上述酸度調(diào)控劑可以包含磷酸、磷酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、琥珀酸、琥珀酸鈉、酒石酸和酒石酸鈉，優(yōu)選的酸度值是5-8。上述增白劑可以是二氧化鈦(titanicoxide),可為0. 1-2重量但不限于此。考慮到天然提取物的一般特性，預(yù)期本發(fā)明的藥草提取物在給予人時(shí)有較小的副作用，并且標(biāo)準(zhǔn)化的組合物在動(dòng)物中沒有表現(xiàn)出任何毒性。本發(fā)明的單獨(dú)黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物特征為具有提高的消炎活性、成骨細(xì)胞分化活性以及牙槽骨再生活性，以及減少牙槽骨破壞的活性。


附圖I為示出制備實(shí)施例1-11以及實(shí)施例I. I和I. 2的提取物增加成骨細(xì)胞分化的活性的結(jié)果。附圖2為示出制備實(shí)施例5的混合提取物在牙周病動(dòng)物模型中減少牙槽骨吸收(以牙槽骨破壞標(biāo)示)的活性的CT圖像。附圖3為示出制備實(shí)施例5的混合提取物在牙周病動(dòng)物模型中減少牙槽骨吸收(圖示為牙槽骨嵴(AC)到釉質(zhì)牙骨質(zhì)界(CEJ)之間的距離)的活性的圖。附圖4為示出制備實(shí)施例5的混合提取物在人工骨損傷動(dòng)物模型中提高骨再生的活性(點(diǎn)線圈顯示骨損傷后由beta-TCP包被的區(qū)域，實(shí)線圈顯示僅骨損傷區(qū)域)的CT圖像。附圖5為示出制備實(shí)施例5的混合提取物在人工骨損傷動(dòng)物模型中提高骨再生的活性的圖(對(duì)于誘導(dǎo)組，骨密度的百分?jǐn)?shù))。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明將通過下述實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)詳細(xì)介紹。然而，下述實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)僅僅用于解釋本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不限于此。實(shí)施例I :制備藥草提取物I. I制備黃連提取物將黃連(根部)用水清洗以去除雜質(zhì)并充分干燥。將所制備的250克黃連用2. O升50% (體積比)乙醇水溶液在80°C下回流提取兩次，每次3小時(shí)，然后將提取物進(jìn)行過濾并真空濃縮獲得57. 5克粗提物。向粗提物中加入O. 3升水以將其懸浮，再加入O. 6升水飽和丁醇，使其分為兩層，然后僅將水飽和丁醇級(jí)分進(jìn)行收集并真空濃縮至干燥。當(dāng)大多數(shù)丁醇和水蒸發(fā)掉以后，加入O. 2升水對(duì)其進(jìn)行共沸濃縮，共沸濃縮重復(fù)兩次。最后加入等量的蒸餾水來懸浮所述濃縮物，然后將所得懸液進(jìn)行凍干獲得31. 8克粉末形式的黃連提取物。
I. 2制備牽牛子提取物將牽牛子用水清洗以去除雜質(zhì)、完全干燥并研磨成粉末。將所制備的250克牽牛子用2. O升50% (體積比)乙醇水溶液在80°C下進(jìn)行回流提取兩次，每次3小時(shí)，然后將提取物進(jìn)行過濾并真空濃縮得到33. 3克粗提物。向此粗提物中加入O. 3升水以將其懸浮，再加入O. 6升水飽和丁醇，使其分為兩層，然后僅將水飽和丁醇級(jí)分進(jìn)行收集并真空濃縮至干燥。當(dāng)大多數(shù)丁醇和水蒸發(fā)掉以后，加入O. 2升水對(duì)其進(jìn)行共沸濃縮，共沸濃縮重復(fù)兩次。最后，加入等量的蒸餾水來懸浮所述濃縮物，然后將所得懸液凍干得到6. 9克粉末形式的牽牛子提取物。實(shí)施例2.制備黃連和牽牛子的混合提取物制備實(shí)施例I :混合提取物(1:1)將上述實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物和實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物以重量比I : I混合(黃連提取物重量牽牛子提取物重量)。為了使其混合均勻，可向該混合提取物中加入約2-3倍重量的水，然后在50-60°C下真空濃縮。然后再次往所得濃縮物中加入等量的水以將其懸浮均勻，將所得懸液凍干以制備粉末形式的混合提取物。制備實(shí)施例2 :混合提取物(2. 5 I)混合提取物是以與上述制備實(shí)施例I相同的方法制備，但是實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物與實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物的重量比是2. 5 : I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)。 制備實(shí)施例3 :混合提取物(5:1)混合提取物是以與上述制備實(shí)施例I相同的方法制備，但是實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物與實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物的重量比是5 : I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)。制備實(shí)施例4 :混合提取物(7. 5 I)混合提取物是以與上述制備實(shí)施例I相同的方法制備，但是實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物與實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物的重量比是7. 5 : I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)。制備實(shí)施例5 :混合提取物(10 I)混合提取物是以與上述制備實(shí)施例I相同的方法制備，但是實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物與實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物的重量比是10 : I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)。制備實(shí)施例6 :混合提取物(12. 5 I)混合提取物是以與上述制備實(shí)施例I相同的方法制備，但是實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物與實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物的重量比是12. 5 : I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)。制備實(shí)施例7 :混合提取物(15 I)混合提取物是以與上述制備實(shí)施例I相同的方法制備，但是實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物與實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物的重量比是15:1(黃連提取物重量牽牛子提取物重量)。
制備實(shí)施例8 :混合提取物(17. 5 I)混合提取物是以與上述制備實(shí)施例I相同的方法制備，但是實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物與實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物的重量比是17. 5 : I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)。制備實(shí)施例9 :混合提取物(20 : I)混合提取物是以與上述制備實(shí)施例I相同的方法制備，但是實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物與實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物的重量比是20 : I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)。制備實(shí)施例10 :混合提取物(22. 5 I)混合提取物是以與上述制備實(shí)施例I相同的方法制備，但是實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物與實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物的重量比是22. 5 : I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)。制備實(shí)施例11 :混合提取物(25 I)混合提取物是以與上述制備實(shí)施例I相同的方法制備，但是實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物與實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物的重量比是25 : I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)。實(shí)施例3 藥理學(xué)活性的測(cè)定實(shí)驗(yàn)實(shí)施例I :成骨細(xì)胞增殖活性為了評(píng)估上述制備實(shí)施例1-11中制備的混合提取物以及實(shí)施例I. I和I. 2中制備的單一提取物的成骨細(xì)胞增殖活性，根據(jù)Lim等人的方法(Lim S et al,. Korean J. FoodSci. Technol，39，694-700. 2007)應(yīng)用 BrdU 試劑盒(cell proliferation ELISA, Roche)以MG-63細(xì)胞系(人成骨細(xì)胞，韓國(guó)細(xì)胞系研究聯(lián)盟(Korean Cell Line Bank)，KCLBNo. 21427)測(cè)試活性，結(jié)果如附圖I所示。實(shí)驗(yàn)方案將在補(bǔ)充有10%胎牛血清的 DMEM(Dulbeccc)' s Modified Eagle' s medium,Cambrex,USA)中培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞以IxlO4細(xì)胞/ml的濃度放入96孔板中，并在CO2培養(yǎng)箱(5% C02，95%相對(duì)濕度，37°C )中穩(wěn)定24小時(shí)，并加入上述的混合提取物或者單一提取物，終濃度為3ug/ml。在用BrdU處理每個(gè)孔后、培養(yǎng)12-16小時(shí)并進(jìn)行細(xì)胞固定后，加入抗BrdU溶液(過氧化物酶綴合的抗BradU抗體，Roche)和底物(TMB (3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物溶液，Roche) 200 μ I進(jìn)行顯色反應(yīng)。然后加入25 μ I IM的硫酸終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)測(cè)定450nm處吸光度,從而評(píng)估成骨細(xì)胞增殖的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 評(píng)估了實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物和實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物以及上述制備實(shí)施例1-11中制備的混合提取物的成骨細(xì)胞增殖活性，結(jié)果示于附圖I。如附圖I所示，實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物和實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物以及上述制備實(shí)施例1-11中制備的混合提取物均具有成骨細(xì)胞增殖活性。另外，制備實(shí)施例2-9中的提取物顯示出較高的成骨細(xì)胞增殖活性，這確認(rèn)了本發(fā)明的混合提取物具有藥理學(xué)協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)將黃連提取物和牽牛子提取物混合為制備實(shí)施例4至7中的7. 5 : I至15 : I時(shí)，成骨細(xì)胞的增殖活性尤其高。當(dāng)將黃連提取物和牽牛子提取物混合為制備實(shí)施例5中的10 I時(shí)，成骨細(xì)胞的增殖活性最高。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2 :體外消炎活性為了評(píng)估上述制備實(shí)施例1-11中制備的混合提取物以及實(shí)施例I. I和I. 2中制備的單一提取物的體外消炎活性，通過改進(jìn)Sherman等人的方法(Sherman et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun. 191,1301-1308,1993)，用 LPS-激活的小鼠白血病單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞系——RAff 264. 7細(xì)胞系(以下稱為RAW 264. 7細(xì)胞，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC#TIB-71)，通過測(cè)量穩(wěn)定的一氧化氮氧化物(N03_)的形成來測(cè)試活性，結(jié)果如表I所示。實(shí)驗(yàn)方案將在補(bǔ)充有10%胎牛血清的 DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle' s medium,Cambrex,USA)中培養(yǎng)的RAW 264. 7細(xì)胞以2. 5x10s細(xì)胞/ml的濃度放入48孔板中，通過加ALPS(10ng/ml)誘導(dǎo)活化，加入上述的混合提取物和單一提取物(終濃度為3ug/ml)并在CO2培養(yǎng)箱(5% CO2,95%相對(duì)濕度，37°C )中穩(wěn)定24小時(shí)。在50 μ I的每一上清中，加入50 μ I Griess試劑(37. 5mM ulphanilic acid, 12. 5mM N-I-蔡基-乙二胺二氧化物,6. 5mMHCl)并于室溫反應(yīng)10分鐘。然后通過用分光光度計(jì)測(cè)量540nm處吸光度來測(cè)定N03_的濃度，從而評(píng)估體外消炎活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)估實(shí)施例I. I中制備的黃連提取物和實(shí)施例I. 2中制備的牽牛子提取物以及上述制備實(shí)施例1-11中制備的混合提取物的體外消炎活性并在下表I中示出。表I
劑量(μ g/ml)NO合成抑制率(％)
制備實(shí)施例I 363
制備實(shí)施例2 3Tl
制備實(shí)施例3 375
制備實(shí)施例4 379
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防或治療牙周病的組合物，包含黃連(Coptidis Rhizoma)提取物或黃連和牽牛子(Pharbitidis Semen)的混合提取物作為活性成分， 其中所述黃連和牽牛子的混合提取物是黃連提取物和牽牛子提取物的混合物或者是黃連和牽牛子的混合物的提取物。
2.權(quán)利要求I的組合物，其中所述混合提取物包含以干物質(zhì)重量計(jì)比例為I: I至.25 I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)的黃連提取物和牽牛子提取物。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述混合提取物包含以干物質(zhì)重量計(jì)比例為2.5 I至.20 I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)的黃連提取物和牽牛子提取物。
4.權(quán)利要求I的組合物，其中所述黃連提取物、所述牽牛子提取物或所述黃連和牽牛子的混合物的提取物是 用一種或多種選自水和分子中碳原子數(shù)為I至4的直鏈或支鏈醇的溶劑所得到的粗提物，或者 通過將至少ー種分子中碳原子數(shù)為I至6的直鏈或支鏈醇的水溶液加入到所述黃連粗提物、所述牽牛子粗提物或者所述黃連和牽牛子的混合物的粗提物中所得到的溶劑可溶性提取物。
5.權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)的組合物,其中所述牙周病是口腔炎、牙銀炎、牙周炎、牙槽骨損傷、牙槽骨質(zhì)疏松、牙槽骨軟化癥、牙槽骨損失或者牙槽骨軟骨發(fā)育不良。
6.權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物被制成粉末劑、顆粒劑、片劑、膠囊、軟膏、懸液、乳劑、糖漿、氣霧劑、透皮劑、栓劑或無菌注射液。
7.權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物的給藥量以活性成分含量計(jì)是姆天 0. I 至 500mg/kg。
8.一種用于預(yù)防或治療牙周病的健康功能食品，包含權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)的組合物。
9.一種以黃連提取物或黃連和牽牛子的混合提取物作為活性成分預(yù)防或治療牙周病的用途， 其中所述黃連和牽牛子的混合提取物是黃連提取物和牽牛子提取物的混合物，或者黃連和牽牛子的混合物的提取物。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述混合提取物包含以干物質(zhì)重量計(jì)比例為I: I至.25 I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)的黃連提取物和牽牛子提取物。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述混合提取物包含以干物質(zhì)重量計(jì)比例為2.5 I至.20 I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)的黃連提取物和牽牛子提取物。
12.權(quán)利要求9的用途，其中所述黃連提取物、所述牽牛子提取物或所述黃連和牽牛子的混合物的提取物是 使用一種或者多種選自水和分子中碳原子數(shù)為I至4的直鏈或支鏈醇的溶劑所得到的粗提物，或者 通過將至少ー種分子中碳原子數(shù)為I至6的直鏈或支鏈醇的水溶液加入到所述黃連粗提物、所述牽牛子粗提物或所述黃連和牽牛子的混合物的粗提物中所得到的溶劑可溶性提取物。
13.權(quán)利要求9至12中任ー項(xiàng)的用途，其中所述牙周病是口腔炎、牙齦炎、牙周炎、牙槽骨損傷、牙槽骨質(zhì)疏松、牙槽骨軟化癥、牙槽骨損失或者牙槽骨軟骨發(fā)育不良。
14.權(quán)利要求書9至12中任ー項(xiàng)的用途，其中所述黃連提取物或所述黃連和牽牛子的混合提取物的給藥量是姆日0. I至500mg/kg。
15.一種用于預(yù)防或治療牙周病的方法，包括 將黃連提取物或者黃連和牽牛子的混合提取物作為活性成分給予需要預(yù)防或者治療牙周病的患者， 其中上述黃連和牽牛子的混合提取物是黃連提取物和牽牛子提取物的混合物或者黃連和牽牛子的混合物的提取物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述混合提取物物包含以干物質(zhì)重量計(jì)比例為I: I至25 I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)的黃連提取物和牽牛子提取物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述混合提取物包含以干物質(zhì)重量計(jì)比例為2.5 I至20 I (黃連提取物重量牽牛子提取物重量)的黃連提取物和牽牛子提取物。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述黃連提取物、所述牽牛子提取物或所述黃連和牽牛子的混合物的提取物是 用一種或多種選自水和分子中碳原子數(shù)為I至4的直鏈或支鏈醇的溶劑所得到的粗提物，或者 通過將至少ー種分子中碳原子數(shù)為I至6的直鏈或支鏈醇的水溶液加入到所述黃連粗提物、所述牽牛子粗提物或所述黃連和牽牛子的混合物的粗提物中所得到的溶劑可溶性提取物。
19.權(quán)利要求15至18任ー項(xiàng)的方法，其中所述牙周病是口腔炎、牙齦炎、牙周炎、牙槽骨損傷、牙槽骨質(zhì)疏松、牙槽骨軟化癥、牙槽骨損失或者牙槽骨軟骨發(fā)育不良。
20.權(quán)利要求書15至18中任ー項(xiàng)的方法，其中所述黃連提取物或所述黃連和牽牛子的混合提取物的給藥量是姆日0. I至500mg/kg。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以黃連提取物或黃連和牽牛子混合提取物作為有效活性成分預(yù)防和/或治療牙周病的用途。黃連提取物或黃連和牽牛子混合提取物具有激發(fā)消炎作用、成骨細(xì)胞分化和牙槽骨再生的活性，并具有預(yù)防牙槽骨損壞的活性，從而可以有效預(yù)防和/或治療牙周病。
文檔編號(hào)A61K36/718GK102665745SQ201080046663
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者文曉進(jìn), 李剛真, 李泰厚, 李鐘旭, 林康鉉, 漁津, 辛榮埈, 韓昌均 申請(qǐng)人:韓國(guó)安國(guó)藥品株式會(huì)社