本發(fā)明涉及黃酮的提取工藝，尤其涉及一種鹽地堿蓬總黃酮的提取方法。
背景技術(shù)：
鹽地堿蓬(Suacda salsa)，又名翅堿蓬、黃須菜，野生于海涂或鹽場的鹽灘之上，無污染，被稱為標(biāo)準(zhǔn)綠色食品。鹽地堿蓬的營養(yǎng)成分非常豐富，其鮮嫩莖葉的蛋白質(zhì)含量占干物質(zhì)的40％，與大豆相仿；而籽粒的脂肪含量高達36.4％，遠高于大豆(18.8％)。另外，堿蓬莖葉中含有大量的人體所必需的氨基酸、維生素、胡蘿卜素和Ca、P、Fe、Cu、Zn、Mn、Se等微量元素，其中有許多指標(biāo)都高于螺旋藻。由此可見其食用、保健、藥用價值之大，非一般食品所能及。
總黃酮是人體必需的營養(yǎng)素，人體內(nèi)部不能合成只能從飲食中攝取，是一類重要的激發(fā)態(tài)活性物質(zhì)，是生命運動不可或缺的機體生理功能調(diào)節(jié)劑。總黃酮以黃酮、黃酮醇、黃烷酮等形式存在，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)和藥理作用；研究表明總黃酮具有以下功效：抗病原微生物、抗感染、抗炎癥、抗?jié)?、抗過敏、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗動脈硬化、抗血栓形成、抗輻射、抗突變、抗腫瘤、保護肝臟和心肌、凈化血液、改善微循環(huán)狀態(tài)、促進組織再生，全面調(diào)節(jié)機體生理功能。國內(nèi)外主要從銀杏葉、大豆、山楂葉、荷葉、花生殼等中提取黃酮化合物，且以銀杏葉和大豆的研究最為深入，此外也有報道從堿蓬中提取黃酮化合物，提取工藝多采用有機溶劑—乙醇進行浸提，但是存在的問題是黃酮化合物提取率低，提取時間長，且黃酮化合物中含有葉綠素、多糖及其他雜分，影響產(chǎn)品純度。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種鹽地堿蓬總黃酮的提取方法，該方法工藝簡單，操作方便，時間短，提高黃酮化合物的提取率，并有效去除葉綠素、多糖及其他雜分，提高黃酮化合物產(chǎn)品純度。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種鹽地堿蓬總黃酮的提取方法，所述提取方法包括下列步驟：
S1.采摘新鮮堿蓬莖葉，經(jīng)過清洗、干燥和粉碎后過20-80目篩，得到堿蓬粉；
S2.稱取S1中的堿蓬粉并加入所述堿蓬粉重量10-18倍的蒸餾水，調(diào)pH值在4.8-6之間，然后加入復(fù)合酶并在200-500mpa的真空密閉條件下酶解15-25min，浸提1-2.5h，離心、過濾得到上清液a和濾渣；
S3.取S2所得的上清液a濃縮，然后再加入濃縮液體積10-20倍的體積濃度為45％-80％的乙醇，浸提1-3h，離心、過濾得到上清液b；
S4.將S3得到的上清液b濃縮，然后再加入濃縮液體積1-2倍的萃取液，攪拌、靜置，得到萃取液層和上清液層，經(jīng)過分離得到上清液c，濃縮上清液c、冷凍干燥得到總黃酮粗品；
S5.將S4得到的總黃酮粗品，用蒸餾水溶解，然后過大孔樹脂柱，并用體積濃度為50％-75％的乙醇對其進行洗脫，收集洗脫液，然后將洗脫液濃縮、冷凍干燥得到精制總黃酮。
作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述復(fù)合酶的加入量為所述堿蓬粉重量的0.03％-0.05％。
作為一種改進的技術(shù)方案，所述復(fù)合酶為纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶，且所述纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的比例為1.1-1.7:0.7-1:0.3。
作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述酶解的酶解溫度為40-65℃。
作為一種改進的技術(shù)方案，取S2得到的濾渣，然后用75％的乙醇超聲浸提1-2h，離心、過濾，得到的濾液與所述上清液a合并。
作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述S3中的乙醇的濃度為65％。
作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述S5中大孔樹脂柱選用HPD-722或D101-B。
作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述S4中的萃取液為石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇中的一種；或乙酸乙酯與正丁醇的混合液。
作為一種進一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述S4中的萃取液為乙酸乙酯與正丁醇的混合液，且所述乙酸乙酯與正丁醇按照1:1的比例混合。
采用了上述技術(shù)方案后，本發(fā)明的有益效果是：
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明主要具有以下優(yōu)點：
(1)采用復(fù)合酶在高壓真空密閉條件下對堿蓬進行酶解，使細胞壁內(nèi)的總黃酮完全釋放出來，且縮短酶解時間和提取時間，同時提高總黃酮的提取率，可使總黃酮提取率達到267mg/g；
(2)通過乙醇浸提，萃取液萃取可有效除去多糖分子和葉綠素；
(3)借助大孔樹脂柱對黃酮化合物進行富集，洗脫液洗脫進一步對總黃酮進行分離、純化，提高黃酮化合物的純度，且純化后提取物中鹽地堿蓬中黃酮含量達到84.6％；
(4)本發(fā)明工藝簡單、操作方便、有機溶劑毒性小、易回收、可行性好。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明采用NaNO2-Al(NO3)3方法測定鹽地堿蓬中總黃酮的含量。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：首選準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度98％)20mg，以60％乙醇定容至100mL作為母液。然后吸取母液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10mL分置于25mL容量瓶中，各加入5％NaNO21mL，搖勻，靜置6min，然后加入10％Al(NO3)3溶液1.0mL，搖勻，靜置6min，再加入1mol/L的NaOH溶液10mL，最后用60％乙醇稀釋至刻度，靜置15min于510nm下測定吸光度值，由吸光度對濃度建立回歸方程：Y＝0.0895+0.1024(r＝0.9993)。
實例1
一種鹽地堿蓬總黃酮的提取方法，包括下列步驟：
S1.采摘新鮮堿蓬莖葉，經(jīng)過清洗、干燥和粉碎后過60目篩，得到堿蓬粉；
S2.稱取S1中的堿蓬粉5g并加入所述堿蓬粉重量10倍的蒸餾水，調(diào)pH值為4.8，然后加入0.03％的復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的比例為1:0.7:0.3)并在500mpa的真空密閉條件下酶解15min，且酶解溫度控制在45℃，浸提1.5h，離心、過濾得到上清液a和濾渣；
S3.取S2所得的上清液a濃縮，然后再加入濃縮液體積10倍的體積濃度為60％的乙醇，浸提1.5h，離心、過濾得到上清液b；
S4.將S3得到的上清液b濃縮，然后再加入濃縮液等體積的石油醚，攪拌、靜置，得到萃取液層和上清液層，經(jīng)過分離得到上清液c，濃縮上清液c、冷凍干燥得到總黃酮粗品；
S5.將S4得到的總黃酮粗品，用蒸餾水溶解，然后過大孔樹脂柱(HPD-722)，用體積濃度為60％乙醇對其進行洗脫，洗脫液流速1.5ml/min，收集洗脫液，然后對洗脫液進行濃縮、冷凍干燥得到精制總黃酮。在此工藝條件下堿蓬中提取的總黃酮223mg/g，純度為80.1％。
實例2
S1.采摘新鮮堿蓬莖葉，經(jīng)過清洗、干燥和粉碎后過80目篩，得到堿蓬粉；
S2.稱取S1中的堿蓬粉5g并加入所述堿蓬粉重量15倍的蒸餾水，調(diào)pH值為5，然后加入0.04％的復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的比例為1.5:1:0.3)并在500mpa的真空密閉條件下酶解20min，且酶解溫度控制在50℃，浸提2h，離心、過濾得到上清液a和濾渣；
S3.取S2所得的上清液a濃縮，然后再加入濃縮液體積15倍的體積濃度為75％的乙醇，浸提2.5h，離心、過濾得到上清液b；
S4.將S3得到的上清液b濃縮，然后再加入濃縮液體積2倍的萃取液(乙酸乙酯與正丁醇按1:1混合)，攪拌、靜置，得到萃取液層和上清液層，經(jīng)過分離得到上清液c，濃縮上清液c、冷凍干燥得到總黃酮粗品；
S5.將S4得到的總黃酮粗品，用蒸餾水溶解，然后過大孔樹脂柱(HPD-722)，用體積濃度為65％乙醇對其進行洗脫，洗脫液流速2ml/min，收集洗脫液，然后對洗脫液進行濃縮、冷凍干燥得到堿蓬總黃酮。在此工藝條件下堿蓬中提取的總黃酮267mg/g，純度為84.6％。
其中在操作S3步驟時，先取S2得到的濾渣，然后用75％的乙醇超聲浸提1-2h，離心、過濾，得到的濾液與所述上清液a合并。
實例3
S1.采摘新鮮堿蓬莖葉，經(jīng)過清洗、干燥和粉碎后過80目篩，得到堿蓬粉；
S2.稱取S1中的堿蓬粉5g并加入所述堿蓬粉重量12倍的蒸餾水，調(diào)pH值為5.5，然后加入0.05％的復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的比例為1.7:0.9:0.3)并在200mpa的真空密閉條件下酶解20min，且酶解溫度控制在58℃，浸提2h，離心、過濾得到上清液a和濾渣；
S3.取S2所得的上清液a濃縮，然后再加入濃縮液體積15倍體積濃度為75％的乙醇，浸提2.5h，離心、過濾得到上清液b；
S4.將S3得到的上清液b濃縮，然后再加入濃縮液體積1.5倍的氯仿，攪拌、靜置，得到萃取液層和上清液層，經(jīng)過分離得到上清液c，濃縮上清液c、冷凍干燥得到總黃酮粗品；
S5.將S4得到的總黃酮粗品，用蒸餾水溶解，然后過大孔樹脂柱(D101-B)，用體積濃度為70％乙醇對其進行洗脫，洗脫液流速2ml/min，收集洗脫液，然后對洗脫液進行濃縮、冷凍干燥得到堿蓬總黃酮。在此工藝條件下堿蓬中提取的總黃酮232mg/g，純度為82.6％。
實例4
S1.采摘新鮮堿蓬莖葉，經(jīng)過清洗、干燥和粉碎后過40目篩，得到堿蓬粉；
S2.稱取S1中的堿蓬粉5g并加入所述堿蓬粉重量12倍的蒸餾水，調(diào)pH值為5.5，然后加入0.05％的復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的比例為1.3:0.8:0.3)并在300mpa的真空密閉條件下酶解25min，且酶解溫度控制在60℃，浸提2h，離心、過濾得到上清液a和濾渣；
S3.取S2所得的上清液a濃縮，然后再加入濃縮液體積18倍的體積濃度為50％的乙醇，浸提3h，離心、過濾得到上清液b；
S4.將S3得到的上清液b濃縮，然后再加入濃縮液體積2倍的乙酸乙酯，攪拌、靜置，得到萃取液層和上清液層，經(jīng)過分離得到上清液c，濃縮上清液c、冷凍干燥得到總黃酮粗品；
S5.將S4得到的總黃酮粗品，用蒸餾水溶解，然后過大孔樹脂柱(D101-B)，用體積濃度為75％乙醇對其進行洗脫，洗脫液流速1.5ml/min，收集洗脫液，然后對洗脫液進行濃縮、冷凍干燥得到堿蓬總黃酮。在此工藝條件下堿蓬中提取的總黃酮212mg/g，純度為81.2％。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。