本發(fā)明涉及天然藥物的超聲提取，是一種鐵皮石斛總黃酮提取方法。

背景技術(shù)：

鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura etMigo)是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，以新鮮或者干燥莖入藥，屬補(bǔ)虛藥中的補(bǔ)陰藥，主要分布于中國(guó)廣西、云南、安徽、浙江、福建等地。其性味甘，微寒，歸胃、腎經(jīng)，具有益胃生津，滋陰清熱的功效。用于熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少于嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨痿軟。此外，現(xiàn)代藥理研究表示，鐵皮石斛具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、降低血糖、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等作用、對(duì)慢性胃炎、糖尿病、久病體弱導(dǎo)致的免疫功能低下、眼科保健及惡性腫瘤的輔助治療等方面都有廣泛應(yīng)用。

根據(jù)發(fā)明人對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的了解，至今未公開與鐵皮石斛總黃酮的提取工藝且包括顆粒半徑、料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間相關(guān)的有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處做出了改進(jìn)，提供了一種合理、高效的鐵皮石斛總黃酮提取方法，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明公開了一種鐵皮石斛總黃酮提取方法，包括如下步驟：

1)將鐵皮石斛藥材粉碎成粉末過篩；

2)將藥材粉末置于錐形瓶中，加入乙醇，用超聲提取法提取一定時(shí)間；

3)過濾并用乙醇洗滌濾渣；

4)合并濾液和洗滌液，用乙醇定容后，得到含黃酮的溶液；

5)顯色后測(cè)定吸光度，代入回歸方程，計(jì)算黃酮含量。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的步驟2)所述藥材粉末顆粒半徑20～80目，料液比(g/ml)1:10～30，乙醇濃度60％～100％，提取時(shí)間20～60min。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的步驟2)所述藥材粉末顆粒半徑50目，料液比(g/ml)1:20，乙醇濃度90％，提取時(shí)間40min。

本發(fā)明的有益效果在于：

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的顆粒半徑、料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間，采用三氯化鋁比色法測(cè)定黃酮含量。該工藝采用的超聲提取法快捷、節(jié)能，且能達(dá)到較高的提取率，適合鐵皮石斛的總黃酮提取，為天然藥物的開發(fā)應(yīng)用提供了理論參考和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，其最佳提取方案如下：顆粒半徑50目，料液比1:20，乙醇濃度90％，提取時(shí)間40min。

附圖說明

附圖1為NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH顯色法測(cè)定蘆丁曲線圖；

附圖2為AlCl₃顯色法測(cè)定蘆丁曲線圖；

附圖3為最佳波長(zhǎng)確定時(shí)繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

附圖4為不同pH緩沖液(左：pH＝5.2，右：pH＝4.3)對(duì)蘆丁測(cè)定的影響曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例，結(jié)合說明書附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地說明：

鐵皮石斛總黃酮提取工藝

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

759紫外-可見光分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；精密PH計(jì)；KQ5200B超聲波清洗器；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，三氯化鋁，醋酸鈉，冰醋酸，乙醇均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 顯色試劑的配置

精密稱取AlCl₃6.70g，乙醇定容至500ml，配成0.1mol/L的溶液。精密稱取無水乙酸鈉5.44g，乙醇定容至200ml，配成0.2mol/L的溶液。精密量取2.30ml冰醋酸，用蒸餾水稀釋至200ml配成0.2mol/L的醋酸溶液[5-7]。將醋酸鈉溶液和冰醋酸溶液配成pH值為5.2的緩沖溶液。

1.3 藥材

由浙江鐵楓堂科技股份有限公司提供，產(chǎn)品批號(hào)140712。并由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃酮的測(cè)定方法

鐵皮石斛黃酮的測(cè)定儀蘆丁為對(duì)照品，分別采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法和AlCl₃顯色法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1及圖2，表明采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法時(shí)，顯色結(jié)果并不好，供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)不一致；而采用AlCl₃顯色法時(shí)，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)基本一致，所以本次實(shí)驗(yàn)選擇AlCl₃顯色法。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(120℃烘干至恒重)20.0mg，80％乙醇定容至100ml，配成0.2mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

2.3 待測(cè)樣品溶液的制備

將粉碎后的鐵皮石斛粉末在鼓風(fēng)干燥箱中烘干，精密稱取1g置于100ml錐形瓶中，按設(shè)定好的條件進(jìn)行超聲提取(提取前稱重，提取后用無水乙醇補(bǔ)足重量)，提取液濾過后，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用相應(yīng)濃度乙醇定容。

2.4 波長(zhǎng)選擇

精密量取1ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于25ml具塞試管中，加入2ml0.1mol/l的AlCl₃溶液，在加入1ml pH為5.2的NaAc-HAc緩沖溶液，靜置10min，在200-600nm范圍掃描，蘆丁在402nm處有最大吸收，空白無干擾。

精密量取1ml待測(cè)的鐵皮石斛溶液，置于25ml具塞試管中，加入2ml0.1mol/l的AlCl₃溶液，在加入1ml pH為5.2的NaAc-HAc緩沖溶液，靜置10min，在200-600nm范圍掃描，待測(cè)溶液在402nm處有也最大吸收，因此，選擇402nm作為測(cè)定波長(zhǎng)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7ml分別置于25ml具塞試管中，加80％乙醇稀釋至2ml，搖勻。加入2ml0.1mol/l的AlCl₃溶液，在加入1ml pH為5.2的NaAc-HAc緩沖溶液，靜置10min，在402nm處測(cè)定吸光度值。

以蘆丁的含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3及圖4)，其回歸方程為y＝4.1986x+0.0377，相關(guān)系數(shù)R＝0.9998，圖3表明蘆丁在40～140μg范圍內(nèi)，含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系。圖4結(jié)果表明緩沖液的pH對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響非常大，以pH＝5.2時(shí)較為適宜，且緩沖液的加入順序幾乎對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。

2.6 鐵皮石斛黃酮提取過程中的單因素影響研究

2.6.1 料液比對(duì)鐵皮石斛黃酮得率的影響

在恒定顆粒大小為80目、提取時(shí)間為40min，乙醇濃度為80％的條件下。分別設(shè)料液比為1：10、1：15、1：20、1：25、1：30進(jìn)行提取，按“2.5項(xiàng)下方法操作”，測(cè)定含量，并計(jì)算鐵皮石斛黃酮得率得率。在上述條件下，每份平行2次，結(jié)果取2次測(cè)定的平均值。由表2-1可以看出，提取率先隨料液比的增加而增加，然后逐漸趨于平緩。這是因?yàn)榱弦罕刃?，則溶劑量少，所以兩相界面的濃度差小，不利于黃酮的擴(kuò)散。當(dāng)料液比為1：30時(shí)黃酮提取率最高，但與1：25相比僅提高了0.001％，說明1：25的料液比較為適宜。

表2-1 料液比對(duì)鐵皮石斛黃酮提取率的影響

2.6.2 乙醇濃度對(duì)鐵皮石斛黃酮得率的影響

在恒定顆粒大小為80目，料液比為1:25，提取時(shí)間為40min的條件下，分別設(shè)乙醇濃度為60％、70％、80％、90％、100％進(jìn)行提取，按“2.5項(xiàng)下方法操作”，測(cè)定含量，并計(jì)算鐵皮石斛黃酮得率得率。在上述條件下，每份平行2次，結(jié)果取2次測(cè)定的平均值。由表2-2可知，隨著乙醇濃度的提高，鐵皮石斛黃酮的提取率先增大后減小。這算因?yàn)橐掖紝?duì)黃酮的溶解度比水大，乙醇對(duì)細(xì)胞的破壞作用比水強(qiáng)，特別是在超聲的作用下更明顯。

表2-2 乙醇濃度對(duì)鐵皮石斛黃酮提取率的影響

2.6.3 提取時(shí)間對(duì)鐵皮石斛黃酮得率的影響

在恒定顆粒大小為80目，料液比為1:25，浸提乙醇濃度為80％的條件下，分別設(shè)提取時(shí)間為20min、30min、40min、50min、60min進(jìn)行提取，按“2.5項(xiàng)下方法操作”，測(cè)定含量，并計(jì)算鐵皮石斛黃酮得率得率。在上述條件下，每份平行2次，結(jié)果取2次測(cè)定的平均值。由表2-3可知隨著超聲作用時(shí)間的增加鐵皮石斛黃酮提取率逐漸增加，但超過40min后，趨于穩(wěn)定。

表2-3 提取時(shí)間對(duì)鐵皮石斛黃酮提取率的影響

2.6.4 顆粒半徑對(duì)鐵皮石斛黃酮得率的影響

在恒定料液比為1:25，提取時(shí)間為40min，乙醇濃度為80％的條件下。分別設(shè)粉碎程度為20目、40目、60目、80目進(jìn)行提取，按“2.5項(xiàng)下方法操作”，測(cè)定含量，并計(jì)算鐵皮石斛黃酮得率得率。在上述條件下，每份平行2次，結(jié)果取2次測(cè)定的平均值。由表2-4可知，隨著顆粒半徑的減小，鐵皮石斛黃酮提取率先增大后減小。這可能是因?yàn)榉鬯檫^度，導(dǎo)致黃酮被多糖等包裹不易溶出。

表2-4 顆粒半徑對(duì)鐵皮石斛黃酮提取率的影響

表2-5 提取工藝因素水平

2.7 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[8-13]

在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(34)4因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，選用因素及水平見表2-5，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2-6，方差分析結(jié)果見表2-7

由正交實(shí)驗(yàn)極差分析可知，影響因素最重要的是乙醇濃度，其次是顆粒半徑，再次是提取時(shí)間，最后是料液比。由方差分析在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，因素B和D的水平1和2對(duì)鐵皮石斛黃酮提取率影響不大，考慮大生產(chǎn)的需要，料液比增大會(huì)增加生產(chǎn)成本，時(shí)間增加會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，因此最佳條件應(yīng)為A2B1C3D1，即顆粒半徑40目，料液比1:20，乙醇濃度90％，提取時(shí)間40min。

表2-6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2-7 方差分析

2.8 最佳提取工藝的驗(yàn)證

在最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，該條件下測(cè)得黃酮提取率為0.245％，RSD＝2.1％。結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.9 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取供試品溶液6份，按“2.5”項(xiàng)下操作，結(jié)果見表2-7。吸光度的RSD＝0.30％，說明該法精密度良好。

表2-8 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2-9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.10 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取供試品溶液，按“2.5”項(xiàng)下操作，每隔十分鐘測(cè)一次吸光度值。結(jié)果見表2-8。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在室溫條件下，供試品在40min內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.11 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密量取供試品溶液6份，按“2.5”項(xiàng)下操作，在相同條件下測(cè)定并計(jì)算總黃酮的含量，結(jié)果見表2-9。RSD＝1.33％，重復(fù)性好。

表2-10 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.12 回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取已知黃酮含量供試品2ml，平行6份，精密加入0.5ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.5”項(xiàng)下操作，根據(jù)測(cè)定值計(jì)算回收率，結(jié)果見表2-10。平均回收率為99.8％。

表2-11 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本發(fā)實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)鐵皮石斛總黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳提取工藝為：顆粒半徑50目，料液比1:20，乙醇濃度90％，提取時(shí)間40min。該工藝簡(jiǎn)單可行，為鐵皮石斛藥材的合理、高效的利用提供了理論參考和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。