本發(fā)明屬于總黃酮提取技術領域，尤其涉及一種巖生忍冬總黃酮提取方法。

背景技術：

巖生忍冬(Lonicera rupicola Hook.f.&Thomson)，又名西藏忍冬，為忍冬科忍冬屬藤本藥用植物，主要產(chǎn)于寧夏南部、甘肅(臨潭)、青海東南部、四川西部、云南西北部及西藏東部至西南部，生于高山灌叢草甸、流石灘邊緣、林緣河灘草地或山坡灌叢中。忍冬屬植物俗稱金銀花，是具有悠久歷史的常用中藥，常作為金銀花入藥。其主要的提取活性成分是黃酮類化合物，黃酮類化合物是現(xiàn)代很多藥用植物的主要成分，具有抗菌消炎、增加腦血流量及冠脈流量、降壓、抗腫瘤和陣痛、抗癌和調(diào)節(jié)免疫等作用。有關巖生忍冬中的黃酮類化合物研究的報道較少，通過參考了相關文獻后，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外文獻對巖生忍冬這一資源的乙醇回流提取總黃酮的工藝優(yōu)化的報道較少，且根據(jù)已報道的文獻中，同屬的藥用植物總黃酮的最優(yōu)提取工藝是乙醇回流提取方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種巖生忍冬總黃酮提取方法，旨在解決國內(nèi)外文獻對巖生忍冬這一資源的乙醇回流提取總黃酮的工藝優(yōu)化的報道較少的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種巖生忍冬總黃酮提取方法，所述巖生忍冬總黃酮提取方法采用乙醇回流提取法對巖生忍冬總浸膏的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度80％、浸提溫度60℃、浸提次數(shù)3次、料液比1:20。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由所述巖生忍冬總黃酮提取方法提取的巖生忍冬總黃酮制備的抗菌消炎藥物。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由所述巖生忍冬總黃酮提取方法提取的巖生忍冬總黃酮制備的增加腦血流量及冠脈流量藥物。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由所述巖生忍冬總黃酮提取方法提取的巖生忍冬總黃酮制備的降壓藥物。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由所述巖生忍冬總黃酮提取方法提取的巖生忍冬總黃酮制備的抗腫瘤藥物。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由所述巖生忍冬總黃酮提取方法提取的巖生忍冬總黃酮制備的抗癌藥物。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由所述巖生忍冬總黃酮提取方法提取的巖生忍冬總黃酮制備的調(diào)節(jié)免疫藥物。

本發(fā)明提供的巖生忍冬總黃酮提取方法，采用正交設計試驗的方法探索巖生忍冬總黃酮乙醇回流提取工藝的最優(yōu)條件，確定巖生忍冬中黃酮類化合物的乙醇提取法的最優(yōu)工藝條件和測定其總黃酮的抗菌活性，為合理利用巖生忍冬這一寶貴資源提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。優(yōu)選巖生忍冬總黃酮乙醇提取工藝的最佳條件及檢測其的抗菌活性。以總黃酮的浸膏率為指標，采用正交試驗設計L₉(3⁴)考察乙醇濃度、溫度、浸提次數(shù)和料液比對巖生忍冬總黃酮乙醇提取工藝的影響；測定巖生忍冬總黃酮對14種標準菌的最小抑菌濃度(MIC)。巖生忍冬總黃酮乙醇提取法最佳提取工藝條件為：乙醇濃度80％、提取溫度60℃、浸提次數(shù)3次、料液比1：20，提取的黃酮類化合物為巖生忍冬干重的2.76％；巖生忍冬總黃酮對14種標準菌有一定的抑制作用。該工藝的重現(xiàn)性較好，對巖生忍冬總黃酮的進一步開發(fā)利用有參考價值。

根據(jù)正交試驗結(jié)果分析表明，采用乙醇回流提取法對巖生忍冬總浸膏的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度80％、浸提溫度60℃、浸提次數(shù)3次、料液比1:20。在此條件下，3次平行試驗平均的總浸膏提取率為24.92％。均值都高于正交試驗的浸膏率，總黃酮浸膏率為2.76％。且提取物總黃酮對14種標準菌都有一定的抑制作用，最小抑菌濃度在2.588～10.35mg/mL之間。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合試驗對本發(fā)明的應用原理作進一步的描述。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材

巖生忍冬采自紅原，由西南民族大學藥理研究室陳朝喜副教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物，莖葉曬干后置于恒溫干燥箱內(nèi)備用。

1.1.2供試菌株

維氏氣單胞菌CGMCC3700、大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞桿菌CGMCCPa3、普通變形桿菌CGMCC1.491、肺炎克雷伯氏菌CGMCC1.1062、痢疾志賀氏菌CGMCC1.1869、中間耶爾森氏菌CGMCC1.6197、腸沙門氏菌腸亞種CGMCC1.10754、粘質(zhì)沙雷氏菌CGMCC1.4256、金黃色葡萄球菌ATCC25913、F菌(糞腸球菌ATCC25912)、S菌(屎腸球菌ATCC35667)、阪崎腸桿菌CGMCC1.6765、陰溝腸桿菌陰溝亞種CGMCC 1.2022，由西南民族大學藥理實驗室保存提供。

1.1.3試劑

無水乙醇、80％乙醇、70％乙醇、60％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、去離子水、二甲基亞砜、氫氧化鈉溶液等。

1.1.4主要設備及耗材

電子天平、索氏提取器、超純水儀、RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水真空泵、低溫冷卻液循環(huán)泵、電熱鼓風烘干箱、恒溫干燥箱、無菌操作臺、立式壓力蒸汽滅菌器、試管、量筒、燒杯、茄形瓶、玻璃棒、試管架、注射器、記號筆、稱量紙、移液槍、槍頭、接種環(huán)、接種針、圓底錐形瓶、平底錐形瓶、一次性手套、口罩等。

1.1.5培養(yǎng)基

MH肉湯：按MH肉湯粉、蒸餾水比例為21g/1000mL配制。在電子天平上稱取一定量的MH肉粉劑于錐形瓶中，并加入相應比例的蒸餾水，溶解后將一部分分裝至試管(每管3mL)，放入立式壓力蒸汽滅菌器121℃高壓蒸汽滅菌20min后取出，放置于37℃培養(yǎng)箱，24h后做無菌檢查，合格者放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1乙醇提取法工藝流程

稱取5g巖生忍冬莖葉→乙醇回流→趁熱過濾→合并濾液→減壓、濃縮→鼓風干燥箱烘干10min→計算總凈膏率→選取最優(yōu)工藝條件進行3次平行試驗→分別計算其的總凈膏率→分別用去離子水溶解→合并溶液→取一定量的溶液NaOH溶液進行堿性顯色反應→2BV石油醚脫色→2BV乙酸乙酯萃取→減壓、濃縮→鼓風干燥箱烘干10min→計算3次平行試驗所得總黃酮的浸膏率。

1.2.2正交設計試驗

稱取9份5g巖生忍冬莖葉備用，按照乙醇回流提取因素水平表1和L9(34)正交試驗設計表2對巖生忍冬進行乙醇回流提取1h，趁熱過濾，合并濾液，用同等濃度的乙醇洗滌藥渣2-3次，一并納入濾液，冷卻后定容，搖勻，待用。然后將濾液置于60℃、90r/min的條件下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器上進行減壓、濃縮。濃縮成浸膏后置于電熱恒溫鼓風干燥10min，取出稱重，求總浸膏率。總浸膏率計算公式為：

總浸膏率(％)＝總浸膏質(zhì)量/巖生忍冬干重×100％

表1：L9(34)正交試驗因素水平表

1.2.3平行試驗

為了進一步考察上述提取工藝的最優(yōu)條件的穩(wěn)定性和合理性，按照該提取流程的最優(yōu)工藝條件下進行3次重復性實驗，分別稱取3份5g的巖生忍冬莖葉進行乙醇回流提取，且分別將濾液置于60℃、90r/min條件下，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器上進行減壓、濃縮。濃縮后置于電熱恒溫鼓風干燥箱烘干10min，取出稱重，分別求其總浸膏率。驗證該條件是否為最優(yōu)的提取條件。

1.2.4總黃酮的提取和分離

將3次平行試驗的總浸膏加入適量的去離子水溶解后，定容。用2BV的石油醚脫色，取下層液體，再用2BV的乙酸乙酯萃取，取上層液體，將溶液置于60℃、90r/min條件下，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器上進行減壓、濃縮。濃縮后置于電熱恒溫鼓風干燥箱烘10min，取出稱重，計算總黃酮的浸膏率。

總黃酮浸膏率(％)＝萃取后的浸膏質(zhì)量/巖生忍冬干重×100％

1.2.5總黃酮的堿性反應

加入適量的去離子水將萃取后的浸膏溶解。用NaOH溶液檢測浸膏溶液是否含有黃酮類化合物。(堿性顯色反應：二氫黃酮類與查耳酮類化合物易在堿性條水平條件下呈橙色→黃顏色；黃酮類化合物在堿性條件下不穩(wěn)定易氧化，產(chǎn)生黃色→深紅色→綠棕色沉淀；黃酮醇類在堿液中先呈黃色，通入空氣后變?yōu)樽厣?確定該溶液含有黃酮類化合物后，將該溶液置于60℃、90r/min條件下，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器上進行減壓、濃縮。濃縮后置于電熱恒溫鼓風干燥箱烘干10min，取出稱重，求黃酮類化合物的浸膏得率。然后加10毫升的二甲基亞風溶液將浸膏溶解備用。

1.2.6體外抗菌試驗

1.2.6.1提取物藥液濃度的設置取用10mL二甲基亞基砜溶解后的總黃酮提取物通過孔徑0.22μm(尼龍66)的過濾篩在無菌工作臺中過濾。

1.2.6.2菌懸液的制備

在無菌操作臺中，在標準菌株培養(yǎng)基中挑取單個菌落接種于3mLMH肉湯試管中，放置于37℃350rpm的搖床中震蕩培養(yǎng)4h，制得供試菌液，再用MH肉湯把菌液稀釋1000倍后備用。

1.2.6.3最小抑菌濃度(MIC)的測定

參照CLSI(2013版)指導原則和執(zhí)行標準，采取微量肉湯稀釋法測定巖生忍冬總黃酮對14種標準菌株的體外抑制的敏感度，用濾頭將總黃酮浸膏溶液過濾待用。取14個96孔板，按照倍比稀釋法，將MH肉湯按照每孔100加入96孔板。提取物均加100μL，以不加菌懸液的總黃酮藥液為陰性對照，37℃培養(yǎng)24h后觀察MIC結(jié)果。所有陰性對照孔培養(yǎng)基澄清，說明本實驗方法可行?？椎撞壳逦怀霈F(xiàn)菌體沉淀的最低抗菌藥物濃度，即為該菌的最小抑菌濃度。

2.結(jié)果與分析

2.1正交設計試驗結(jié)果與分析

乙醇回流法提取巖生忍冬的總浸膏量的正交實驗結(jié)果及直觀分析表2和方差分析表3，如下所示：

表2：L₉(3⁴)正交試驗結(jié)果

正交設計實驗結(jié)果及直觀分析表2和9次水平試驗結(jié)果表明：參考R值可以直接得出考察因素對巖生忍冬總浸膏提取影響的大小順序為：提取溫度>乙醇濃度>料液比>浸提次數(shù)；A3B1C3D2即乙醇濃度80％、提取溫度60℃、浸提次數(shù)3次、料液比1：30，是巖生忍冬總浸膏乙醇回流提取法提取率最高的一組試驗。

表3：L₉(3⁴)正交試驗方差分析表

正交設計試驗方差分析表3結(jié)果表明：選定的四個因素乙醇濃度、提取溫度、料液比、浸提次數(shù)在設定的水平內(nèi)對巖生忍冬總浸膏的提取率影響無顯著性差異，因此只能根據(jù)直觀分析表3結(jié)果以及各考察因素的效應曲線圖進行選擇最優(yōu)的提取工藝條件，最優(yōu)工藝條件為：A3B1C3D1即乙醇濃度80％、提取溫度60℃、浸提次數(shù)3次、料液比1：20。

2.2平行試驗結(jié)果與分析

3次平行試驗總浸膏率分別為23.9％、25.92％、24.94％，結(jié)果均高于L₉(3⁴)正交設計試驗的結(jié)果(表2)，3組平行試驗總浸膏的提取量為3.738g，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好，A3B1C3D1即乙醇濃度80％、提取溫度60℃、浸提次數(shù)3次、料液比1：20是乙醇回流法提取巖生忍冬的最優(yōu)工藝條件。

2.3總黃酮的提取和分離結(jié)果與分析

根據(jù)相關文獻報道，平行實驗所得到的忍冬總浸膏混懸于適量的水，可以用石油醚萃取得到石油醚萃取物后再用同等體積的乙酸乙酯除去其他雜質(zhì)，取乙酸乙酯層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成浸膏后即得到總黃酮的粗提物?？傸S酮的浸膏質(zhì)量為0.414g，按照上述公式計算，巖生忍冬總黃酮的提取率為2.76％。

2.4總黃酮的堿性反應結(jié)果與分析

經(jīng)過石油醚和乙酸乙酯萃取后得到的提取液進行的堿性顯色反應的顏色變化為由黃色→棕色，與上述的黃酮類化合物的堿性顯色反應產(chǎn)生的顏色變化即黃色→棕色基本一致，因此可以判斷萃取后的巖生忍冬總浸膏中含有黃酮醇類等物質(zhì)。

2.5最小抑菌濃度的測定結(jié)果與分析

表4：總黃酮對14種病原菌的MIC試驗結(jié)果

由表4中的數(shù)據(jù)得出，巖生忍冬中提取的總黃酮對上述14種標準菌均有一定的抑制作用。具體情況如下：

總黃酮提取物對銅綠假單胞桿菌、普通變形桿菌、腸沙門氏菌腸亞種、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、痢疾志賀氏菌等7種菌株的抑制作用最強，最小抑菌濃度為2.588mg/mL；對維氏氣單胞菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、F菌(糞腸球菌)、S菌(屎腸球菌)、陰溝腸桿菌陰溝亞種、中間耶爾森氏菌等6種菌株有較強的抑菌作用，最小抑菌濃度為6.9mg/mL；對大腸桿菌有一定的抑菌作用，最小抑菌濃度為10.35mg/mL。

黃酮類化合物是巖生忍冬中的主要活性成分之一，具有廣泛的藥用前景和商用價值。其在植物體內(nèi)以苷或苷元的形式存在，根據(jù)有關文獻報道，在大多數(shù)的情況下，用有機溶劑可將苷或苷元全部提出，甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑常用來提取黃酮類化合物，但由于甲醇、丙酮等毒性較大，黃酮化合物在乙醇中易溶解且提取率也相對較高，因此一般采用乙醇為提取溶劑。正交試驗設計的分析方法是目前最常用的工藝優(yōu)化實驗設計和分析方法。用正交表安排實驗方案，并利用計算機軟件即正交設計助手進行計算分析，最終迅速找到優(yōu)化方案，是一種高效處理多因素優(yōu)化問題的科學計算方法。本實驗以巖生忍冬莖葉的總浸膏率為指標，通過乙醇回流法的正交實驗設計優(yōu)化其總黃酮提取工藝條件。最終得到的最優(yōu)方案A3B1C3D1的總浸膏率的均值為24.92％，該結(jié)果比正交表中的任一方案的結(jié)果都高。正交設計試驗節(jié)能省時，流程簡單、易操作，彌補了單一因素對提取工藝操作達不到優(yōu)化的結(jié)果，從而使結(jié)果更加可靠。為優(yōu)化巖生忍冬總浸膏率的提取工藝提供了理論方法依據(jù)。

本實驗的正交設計試驗的方差分析結(jié)果顯示，該正交設計實驗在設定的水平內(nèi)。平行試驗所得的總浸膏經(jīng)石油醚、乙酸乙酯處理后，所得的總黃酮浸膏率為2.76％。根據(jù)最小抑菌濃度結(jié)果表明，巖生忍冬總黃酮提取物對14種標準菌株都有一定的抑制作用，但是對大腸桿菌的敏感度較低，其最小的抑菌濃度為10.35mg/mL。但是對其他的革蘭氏陰性菌(銅綠假單胞桿菌、普通變形桿菌、腸沙門氏菌腸亞種、痢疾志賀氏菌等)有較強的敏感性，其的最小抑菌濃度均為2.588mg/mL。革蘭氏陽性菌(金黃色球菌)的最小抑菌濃度為2.588mg/mL，與本次實驗中的革蘭氏陰性菌的最小抑菌濃度相比較表明：巖生忍冬總黃酮提取物對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌都有一定的抑菌作用。為合理開發(fā)巖生忍冬這一藥用資源提供參考數(shù)據(jù)。

根據(jù)正交試驗結(jié)果分析表明，采用乙醇回流提取法對巖生忍冬總浸膏的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度80％、浸提溫度60℃、浸提次數(shù)3次、料液比1:20。在此條件下，3次平行試驗平均的總浸膏提取率為24.92％。均值都高于正交試驗的浸膏率，總黃酮浸膏率為2.76％。且提取物總黃酮對14種標準菌都有一定的抑制作用，最小抑菌濃度在2.588～10.35mg/mL之間。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。