本發(fā)明涉及納米生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及量子點(diǎn)偶聯(lián)β-HCG單抗的方法及其在免疫印跡中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

免疫印跡(Western blot) ，在分子生物學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，主要應(yīng)用于蛋白的定性和半定量分析。但該方法步驟煩瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)所用的有機(jī)熒光發(fā)色團(tuán)熒光穩(wěn)定性低，難以長(zhǎng)時(shí)間成像，使得檢測(cè)靈敏度低。不同的發(fā)色團(tuán)需要不同波長(zhǎng)的光源激發(fā)，使成像復(fù)雜化，且不能同時(shí)檢測(cè)多種蛋白。

量子點(diǎn)(Quantum dots, QDs)是一種半導(dǎo)體納米晶體，半徑小于或等于玻爾半徑，因此量子點(diǎn)表現(xiàn)出獨(dú)特的光學(xué)、電、磁和催化特性。與傳統(tǒng)有機(jī)染料分子探針相比，量子點(diǎn)的發(fā)射光譜寬度窄、可調(diào)，且分布對(duì)稱；其激發(fā)光譜寬，且連續(xù)分布，可用一種波長(zhǎng)激發(fā)大小不同的同種量子點(diǎn)而獲得多種標(biāo)記顏色；光穩(wěn)定性強(qiáng)；斯托克斯位移較大；生物相容性好；熒光壽命長(zhǎng)[Wegner KD, Lanh PT, Jennings T, et al. Influence of luminescence quantum yield, surface coating, and functionalization of quantum dots on the sensitivity of time-resolved fret bioassays [J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2013, 5(8): 2881]。

目前，量子點(diǎn)與生物分子偶聯(lián)常用的技術(shù)有配位鍵結(jié)合、靜電吸附、共價(jià)偶聯(lián)等。蛋白中某種特定氨基酸才能與金屬離子產(chǎn)生配位作用，因此應(yīng)用不廣泛；靜電吸附得到的偶聯(lián)物穩(wěn)定性較差。表面帶有羧基的水溶性量子點(diǎn)通過(guò)EDC等交聯(lián)劑可以與蛋白質(zhì)分子的氨基共價(jià)偶聯(lián)，得到的偶聯(lián)物具有良好的生物活性，且光學(xué)性質(zhì)良好。

基于量子點(diǎn)的免疫印跡在理論上具有光穩(wěn)定性強(qiáng)，靈敏度高，可多重標(biāo)記的特點(diǎn)，能定性定量檢測(cè)蛋白，準(zhǔn)確度高，不需要化學(xué)發(fā)光試劑，成像系統(tǒng)簡(jiǎn)單，耗時(shí)短。2005年，Ornberg首次報(bào)道將量子點(diǎn)應(yīng)用到免疫印跡中，利用量子點(diǎn)標(biāo)記二抗檢測(cè)不同濃度的MAPK，在不同曝光時(shí)間下檢測(cè)到其蛋白濃度與熒光強(qiáng)度有線性關(guān)系。該方法靈敏度高，光化學(xué)性能穩(wěn)定[Ornberg RL, Harper TF, Liu H. Western blot analysis with quantum dot fluorescence technology: a sensitive and quantitative method for multiplexed proteomics [J]. Nat Methods, 2005, 2(1): 79]。中國(guó)專利申請(qǐng)CN 101241140A《基于量子點(diǎn)標(biāo)記的免疫印跡檢測(cè)方法》，涉及了基于量子點(diǎn)標(biāo)記二抗的免疫印跡方法，該法仍舊需要經(jīng)過(guò)一抗的孵育，實(shí)驗(yàn)步驟較多，并且必須使用二抗，實(shí)驗(yàn)成本較為昂貴。

本發(fā)明的目的之一是，提供一種量子點(diǎn)標(biāo)記單抗蛋白的方法。

本發(fā)明的目的之二是，提供一種基于量子點(diǎn)的免疫印跡，且能簡(jiǎn)便定量測(cè)定蛋白的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于開發(fā)基于量子點(diǎn)的Western blot定量檢測(cè)蛋白，提供一種耗時(shí)短且線性關(guān)系良好的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用簡(jiǎn)單有效的方法制備CdTe量子點(diǎn)-β-HCG單抗偶聯(lián)物，并在Western blot檢測(cè)中表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系和穩(wěn)定性。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：量子點(diǎn)通過(guò)EDC等交聯(lián)劑偶聯(lián)β-HCG單抗；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離開后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，與量子點(diǎn)標(biāo)記的β-HCG單抗進(jìn)行特異性結(jié)合，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)，得到各條帶熒光強(qiáng)度，進(jìn)行定性定量分析。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：量子點(diǎn)-β-HCG單抗偶聯(lián)物的制備方法及其應(yīng)用，按照下述步驟進(jìn)行：

（1）量子點(diǎn)偶聯(lián)β-HCG單抗

偶聯(lián)時(shí)，加入磷酸鹽調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH，在巰基丙酸修飾的CdTe量子點(diǎn)中先加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺（EDC）溶液活化反應(yīng)10-15 min，再加入NHS溶液反應(yīng)10-15 min，最后加入β-HCG單抗于37℃反應(yīng)2-4 h。反應(yīng)結(jié)束后，將得到的偶聯(lián)物離心去沉淀，上清液經(jīng)超濾離心管離心，并用磷酸緩沖液洗滌，最后濃縮后4℃保存。

（2）基于量子點(diǎn)的免疫印跡法

蛋白樣品經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳按分子量大小分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜后并封閉，用量子點(diǎn)標(biāo)記的β-HCG單抗做為一抗孵育，膜上目的蛋白即能與之進(jìn)行特異性結(jié)合，最后采用紫外凝膠系統(tǒng)檢測(cè)成像。

蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳按分子量大小分離，再將PVDF膜于甲醇中激活，采用濕法轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜放入5%脫脂牛奶中，震蕩封閉1 h。用TBS溶液稀釋成一系列濃度的量子點(diǎn)-β-HCG單抗偶聯(lián)物，室溫下孵育2 h。反應(yīng)后直接將膜置于紫外凝膠系統(tǒng)中檢測(cè)成像。觀察熒光條帶，并檢測(cè)各條帶熒光強(qiáng)度，得出線性關(guān)系。

其中所述的的量子點(diǎn)，其表面帶有羧基的CdTe量子點(diǎn)，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm - 600 nm中的一種。

其中步驟（1）中加入的量子點(diǎn)與EDC質(zhì)量比為1:0.4 - 1:1，EDC與NHS質(zhì)量比為1: 0.1 - 1: 0.3。調(diào)節(jié)反應(yīng)pH為7.0 – 8.0，每步反應(yīng)10-15 min。最后加入的量子點(diǎn)與β-HCG單抗質(zhì)量比為1: 0.1-1: 0.5。

其中所述的量子點(diǎn)-β-HCG單抗偶聯(lián)物的應(yīng)用，檢測(cè)的目的蛋白條帶可針對(duì)HCG和β-HCG進(jìn)行特征檢測(cè)，并根據(jù)其熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測(cè)定。

有益效果

（1）本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于采用化學(xué)交聯(lián)劑的方法，制備了量子點(diǎn)-β-HCG單抗偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明具有良好的生物活性和光學(xué)特性；基于量子點(diǎn)的免疫印跡耗時(shí)短，步驟簡(jiǎn)單，不需要加入顯色液，節(jié)約成本，光學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)，在TBS緩沖液中可保存5天以上，且熒光強(qiáng)度無(wú)太大變化。

（2）本發(fā)明拓展了免疫印跡在微量檢測(cè)蛋白中的應(yīng)用，并且可以推廣到其他類別蛋白的微量檢測(cè)，其中量子點(diǎn)可自制，且不需要二抗，節(jié)約成本，定性定量結(jié)果均優(yōu)于傳統(tǒng)免疫印跡，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。

具體實(shí)施方式

以下所列實(shí)施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：量子點(diǎn)-β-HCG單抗偶聯(lián)物的制備

將巰基丙酸（MPA）修飾的CdTe量子點(diǎn)（發(fā)射波長(zhǎng)520 nm）于0.01M磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中，配制成1 mg/mL。取量子點(diǎn)0.2 mg，加入磷酸緩沖液稀釋至1 mL，加入0.877 g/mL 的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺（EDC）0.09 μL，于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上活化反應(yīng)10 min。再加入 0.1 mol/L的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）7.6 μL，繼續(xù)反應(yīng)10 min。最后加入9 mg/mL的β-HCG單抗2μL。37℃下反應(yīng)2 h，得到的偶聯(lián)物10000 rpm離心去沉淀，上清液經(jīng)10KD超濾離心管離心濃縮后4℃保存。

偶聯(lián)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，與未偶聯(lián)的量子點(diǎn)和β-HCG單抗相比，遷移速度變慢，確認(rèn)其偶聯(lián)成功。

實(shí)施例2：量子點(diǎn)-β-HCG單抗偶聯(lián)物的制備

將巰基丙酸（MPA）修飾的CdTe量子點(diǎn)（發(fā)射波長(zhǎng)550 nm）于0.01M磷酸鹽緩沖液（pH7.4）中，配制成1 mg/mL。取量子點(diǎn)0.3 mg，加入磷酸緩沖液稀釋至1 mL，加入0.877 g/mL 的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺（EDC）0.3 μL，于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上活化反應(yīng)15 min。再加入 0.1 mol/L的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）30 μL，繼續(xù)反應(yīng)15 min。最后加入9 mg/mL的β-HCG單抗8 μL。37℃下反應(yīng)3 h，得到的偶聯(lián)物10000 rpm離心去沉淀，上清液經(jīng)10KD超濾離心管離心濃縮后4℃保存。

偶聯(lián)物經(jīng)分子排阻色譜分析，與未偶聯(lián)的量子點(diǎn)和β-HCG單抗相比，保留時(shí)間提前，確認(rèn)其偶聯(lián)成功。

實(shí)施例3：量子點(diǎn)-β-HCG單抗偶聯(lián)物的制備

將巰基丙酸（MPA）修飾的CdTe量子點(diǎn)（發(fā)射波長(zhǎng)600 nm）于0.01M磷酸鹽緩沖液（pH8.0）中，配制成1 mg/mL。取量子點(diǎn)0.2 mg，加入磷酸緩沖液稀釋至1 mL，加入0.877 g/mL 的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺（EDC）0.23 μL，于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上活化反應(yīng)15 min。再加入 0.1 mol/L的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）52 μL，繼續(xù)反應(yīng)15 min。最后加入9 mg/mL的β-HCG單抗11 μL。37℃下反應(yīng)4 h，得到的偶聯(lián)物10000 rpm離心去沉淀，上清液經(jīng)10KD超濾離心管離心濃縮后4℃保存。

偶聯(lián)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，與未偶聯(lián)的量子點(diǎn)和β-HCG單抗相比，遷移速度變慢，確認(rèn)其偶聯(lián)成功。

實(shí)施例4：量子點(diǎn)-β-HCG單抗偶聯(lián)物在免疫印跡中的應(yīng)用

將含有β-巰基乙醇的Loading Buffer加入蛋白，混勻后煮沸10 min，冷卻后備用。配制12%分離膠和12%集成膠，待膠凝固后安裝好電泳裝置，倒入緩沖液，將變性后的蛋白取10 μL上樣。先恒壓80 V，指示劑跑至分離膠時(shí)，恒壓120 V，待指示劑跑至膠底部，停止電泳。將膠取出，與甲醇激活后的PVDF膜緊貼，夾在濾紙中間，于4℃中濕法轉(zhuǎn)膜2 h。膜轉(zhuǎn)好后取出，放入5%脫脂牛奶中室溫震蕩封閉1 h。將封閉后的膜用TBS洗凈殘留的吐溫，以1: 30稀釋的量子點(diǎn)標(biāo)記的β-HCG單抗室溫下孵育2 h，將膜置于TBS緩沖液中保存。

將膜直接放置于紫外凝膠系統(tǒng)中檢測(cè)成像，可以發(fā)現(xiàn)在46 KD 和23 KD處有明顯的亮的條帶。

實(shí)施例5：量子點(diǎn)-β-HCG單抗偶聯(lián)物在免疫印跡中的應(yīng)用

將含有β-巰基乙醇的Loading Buffer加入蛋白，混勻后煮沸10 min，冷卻后稀釋至不同濃度備用。配制15%分離膠和12%集成膠，待膠凝固后安裝好電泳裝置，倒入緩沖液，將不同濃度的蛋白各取10 μL上樣。先恒壓80 V，指示劑跑至分離膠時(shí)，恒壓120 V，待指示劑跑至膠底部，停止電泳。將膠取出，與甲醇激活后的PVDF膜緊貼，夾在濾紙中間，于4℃中濕法轉(zhuǎn)膜2 h。膜轉(zhuǎn)好后取出，放入5%脫脂牛奶中室溫震蕩封閉1 h。將封閉后的膜用TBS洗凈殘留的吐溫，以1: 50稀釋的量子點(diǎn)標(biāo)記的β-HCG單抗室溫下孵育2 h，將膜置于TBS緩沖液中保存。

將膜直接放置于紫外凝膠系統(tǒng)中檢測(cè)成像，可以發(fā)現(xiàn)在46 KD 和23 KD處有明顯的亮的條帶，并且隨蛋白濃度增加光強(qiáng)度越強(qiáng)。將得到的條帶讀取其灰度值并做出線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)可以達(dá)到0.9，穩(wěn)定性、精密度等指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)未使用內(nèi)參的免疫印跡法。