本申請(qǐng)涉及一種人體血清中肌鈣蛋白I的定量測(cè)定方法、試劑及試劑盒。
背景技術(shù)：
：肌鈣蛋白I，由肌鈣蛋白T(cTnT)、肌鈣蛋白I(cTnI)及肌鈣蛋白C(cTnC)三種亞單位組成，和原肌球蛋白一起通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子對(duì)橫紋肌動(dòng)蛋白ATP酶的活性來(lái)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互作用。當(dāng)心肌損傷后，心肌肌鈣蛋白I復(fù)合物釋放到血液中，4-6小時(shí)后，開始在血液中升高，升高的肌鈣蛋白I能在血液中保持很長(zhǎng)時(shí)間6-10天。肌鈣蛋白I具有高度心肌特異性和靈敏度，所以肌鈣蛋白I已成為目前最理想的心肌梗死標(biāo)志物。目前已知的測(cè)定肌鈣蛋白的方法有電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法；酶聯(lián)熒光分析法。這些方法具有檢測(cè)線性范圍小、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、價(jià)格昂貴、過(guò)度浪費(fèi)資源的缺點(diǎn)，不適于常規(guī)檢驗(yàn)，尤其是大規(guī)模流行病學(xué)檢查或臨床大批量標(biāo)本諸多項(xiàng)目的同時(shí)檢測(cè)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本申請(qǐng)的目的是提供一種能夠應(yīng)用于大規(guī)模臨床試驗(yàn)的人體血清中肌鈣蛋白I的定量測(cè)定方法、試劑及試劑盒。本申請(qǐng)采用了以下技術(shù)方案：本申請(qǐng)的一方面公開了一種定量測(cè)定人體血清中肌鈣蛋白I含量的試劑，該試劑由分別放置的試劑I和試劑II組成，其中，所述試劑I含有甘氨酸緩沖液、聚乙二醇6000；所述試劑II含有甘氨酸緩沖液、羊抗人肌鈣蛋白I抗體、乳膠、吐溫-20、蛋白保護(hù)劑2、小牛白蛋白。進(jìn)一步的，所述蛋白保護(hù)劑2為甘油。進(jìn)一步的，所述試劑I中甘氨酸緩沖液含量為110-180mmol/L，聚乙二醇6000的濃度為1.8-2.6％。進(jìn)一步的，所述試劑I中甘氨酸緩沖液含量為140mmol/L，聚乙二醇6000的濃度為2.4％。進(jìn)一步的，所述試劑II中甘氨酸緩沖液含量為110-180mmol/L，羊抗人肌鈣蛋白I抗體含量為0.1-0.5g/L，乳膠含量為1-5g/L，吐溫-20含量為0.1％-0.5％(V/V)，蛋白保護(hù)劑2含量為0.5％-1.5％、小牛白蛋白含量為20-100g/L。進(jìn)一步的，所述試劑II中甘氨酸緩沖液含量為140mmol/L，羊抗人肌鈣蛋白I抗體含量為0.2g/L，乳膠含量為2g/L，吐溫-20含量為0.3％(V/V)，蛋白保護(hù)劑2含量為1％，小牛白蛋白含量為50g/L。本申請(qǐng)的另一方面提供一種定量測(cè)定人體血清中肌鈣蛋白I含量的試劑盒，其中裝有上述定量測(cè)定人體血清中肌鈣蛋白I含量的試劑，該試劑由分別放置的試劑I及試劑II組成。本申請(qǐng)的另一方面提供一種定量測(cè)定人體血清中肌鈣蛋白I含量的方法，該方法包括向血清樣品中加入所述試劑I，37℃孵育5分鐘，在一定的波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光度A1；然后向樣品中加入試劑II，繼續(xù)孵育5分鐘后在上述波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A2，由下式(1)計(jì)算△A樣本；用同樣的方法測(cè)定校準(zhǔn)液的吸光度值△A標(biāo)準(zhǔn)；再通過(guò)下式(2)計(jì)算得到血清樣品的肌鈣蛋白I含量：△A＝A2-A1(1)血清中肌鈣蛋白I含量(ng/mL)＝△A樣本/△A標(biāo)準(zhǔn)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度(2)本方法的原理為：采用多點(diǎn)非線性LOGIT-LOG4P或LOGIT-LOG5P或SPLINE等校準(zhǔn)模式進(jìn)行多點(diǎn)定標(biāo)(不用水空白)，由儀器根據(jù)校準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的△A自動(dòng)生成校準(zhǔn)曲線后，計(jì)算樣品濃度。本申請(qǐng)中將特異抗體結(jié)合于膠乳顆粒表面，標(biāo)本與膠乳顆粒在緩沖液中混合，標(biāo)本中的cTnl與膠乳顆粒表面的抗體結(jié)合，使相鄰的膠乳顆粒彼此交聯(lián)，在500nm附近測(cè)量溶液濁度增加，其增加的程度與標(biāo)本中的cTnl含量相關(guān)。本發(fā)明直接定量測(cè)定人血清樣品中肌鈣蛋白I含量的試劑盒，是將分別放置的上述試劑I和試劑II以不同的規(guī)格裝入試劑盒包裝中。該試劑盒具有多種不同的規(guī)格，可以分別適用于目前在臨床實(shí)驗(yàn)室普遍使用的各種國(guó)內(nèi)外品牌的自動(dòng)生化分析儀器。本發(fā)明采用的試劑盒及檢測(cè)方法只需幾十微升血清，無(wú)需離心或電泳等分離處理，操作簡(jiǎn)便，可滿足全自動(dòng)化分析的要求，適用于大規(guī)模樣品的及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)。具體實(shí)施方式實(shí)施例一按照下述成分和比例配置下述本發(fā)明試劑I及試劑II：試劑I:甘氨酸緩沖液140mmol/L聚乙二醇60002.4％試劑II：在樣品管中將225μl試劑I和25μl血清樣品混合，在37℃下孵育5分鐘，使用雅培C16000全自動(dòng)生化分析儀，在主波長(zhǎng)500nm，測(cè)定吸光度A1，然后向樣品中加入70μl試劑II，混勻，在37℃下孵育5分鐘，測(cè)定相同波長(zhǎng)下的吸光度A2。根據(jù)如下公式(1)計(jì)算△A樣本。用同樣的方法和條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值，并計(jì)算△A標(biāo)準(zhǔn)。然后根據(jù)公式(2)計(jì)算樣品的血清樣品中肌鈣蛋白I含量：△A＝A2-A1(1)血清中肌鈣蛋白I含量(ng/mL)＝△A樣本/△A標(biāo)準(zhǔn)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度(2)本申請(qǐng)所用校準(zhǔn)液為伯樂(lè)校準(zhǔn)品。實(shí)施例二按照下述成分和比例配置下述本發(fā)明試劑I及試劑II：試劑I:甘氨酸緩沖液110mmol/L聚乙二醇60001.8％試劑II：在樣品管中將225μl試劑I和25μl血清樣品混合，在37℃下孵育5分鐘，使用日立7180型全自動(dòng)生化分析儀，在主波長(zhǎng)500nm，測(cè)定吸光度A1，然后向樣品中加入70μl試劑II，混勻，在37℃下孵育5分鐘，測(cè)定相同波長(zhǎng)下的吸光度A2。根據(jù)如下公式(1)計(jì)算△A樣本。用同樣的方法和條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值，并計(jì)算△A標(biāo)準(zhǔn)。然后根據(jù)公式(2)計(jì)算樣品的血清樣品中肌鈣蛋白I含量：△A＝A2-A1(1)血清中肌鈣蛋白I含量(ng/mL)＝△A樣本/△A標(biāo)準(zhǔn)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度(2)實(shí)施例三按照下述成分和比例配置下述本發(fā)明試劑I及試劑II：試劑I:甘氨酸緩沖液180mmol/L聚乙二醇60002.6％試劑II：在樣品管中將225μl試劑I和25μl血清樣品混合，在37℃下孵育5分鐘，使用奧林帕斯AU400型全自動(dòng)生化分析儀，在主波長(zhǎng)500nm，測(cè)定吸光度A1，然后向樣品中加入70μl試劑II，混勻，在37℃下孵育5分鐘，測(cè)定相同波長(zhǎng)下的吸光度A2。根據(jù)如下公式(1)計(jì)算△A樣本。用同樣的方法和條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值，并計(jì)算△A標(biāo)準(zhǔn)。然后根據(jù)公式(2)計(jì)算樣品的血清樣品中肌鈣蛋白I含量：△A＝A2-A1(1)血清中肌鈣蛋白I含量(ng/mL)＝△A樣本/△A標(biāo)準(zhǔn)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度(2)實(shí)施例四按照下述成分和比例配置下述本發(fā)明試劑I及試劑II：試劑I:甘氨酸緩沖液140mmol/L聚乙二醇60001.8％試劑II：在樣品管中將225μl試劑I和25μl血清樣品混合，在37℃下孵育5分鐘，使用森龍8020型全自動(dòng)生化分析儀，在主波長(zhǎng)500nm，測(cè)定吸光度A1，然后向樣品中加入70μl試劑II，混勻，在37℃下孵育5分鐘，測(cè)定相同波長(zhǎng)下的吸光度A2。根據(jù)如下公式(1)計(jì)算△A樣本。用同樣的方法和條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值，并計(jì)算△A標(biāo)準(zhǔn)。然后根據(jù)公式(2)計(jì)算樣品的血清樣品中肌鈣蛋白I含量：△A＝A2-A1(1)血清中肌鈣蛋白I含量(ng/mL)＝△A樣本/△A標(biāo)準(zhǔn)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度(2)實(shí)施例五使用本實(shí)施例1中所列的試劑，按照實(shí)施例1所述的方法和條件對(duì)100例血清樣品的血清中肌鈣蛋白I含量進(jìn)行測(cè)定，每份血清樣品同時(shí)以市售血清中肌鈣蛋白I含量測(cè)定試劑盒(太原川至生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行對(duì)照性測(cè)定。1、SPSS定量統(tǒng)計(jì)分析1.1統(tǒng)計(jì)描述表1描述統(tǒng)計(jì)量表2描述統(tǒng)計(jì)量1.2配對(duì)T檢驗(yàn)表3成對(duì)樣本相關(guān)系數(shù)N相關(guān)系數(shù)Sig.對(duì)1本發(fā)明數(shù)據(jù)&對(duì)照數(shù)據(jù)100.992.000表4成對(duì)樣本檢驗(yàn)表5成對(duì)樣本檢驗(yàn)tdfSig.(雙側(cè))對(duì)1本發(fā)明數(shù)據(jù)-對(duì)照數(shù)據(jù)-1.72899.087其中，P值＝0.087，＞0.05，表明兩組數(shù)據(jù)相互獨(dú)立，是兩個(gè)不同的試劑盒的結(jié)果1.3雙變量相關(guān)性表6相關(guān)性**.在.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。R＝0.9921.4新型回歸分析及散點(diǎn)表表7模型匯總a.預(yù)測(cè)變量:(常量),VAR00019。b.因變量：本發(fā)明數(shù)據(jù)。表8系數(shù)aa.因變量:本發(fā)明數(shù)據(jù)方程：Y＝0.994*X-0.002，r＝0.992，X軸：對(duì)照數(shù)據(jù)，Y軸：本發(fā)明數(shù)據(jù)2、臨床結(jié)果定性統(tǒng)計(jì)分析臨床研究肌鈣蛋白I測(cè)定試劑盒與對(duì)比產(chǎn)品測(cè)定結(jié)果分析：交叉列表分析表9臨床確診與對(duì)照組試劑以對(duì)比產(chǎn)品試劑盒為參照組：陽(yáng)性符合率＝[29/(29+1)]×100％＝96.66％陰性符合率＝[69/(69+1)]×100％＝98.57％總的一致性＝[(69+29)/100]×100％＝98％3、性能指標(biāo)分析3.1準(zhǔn)確性用已知肌鈣蛋白I定值血清進(jìn)行三次平行測(cè)量測(cè)定，取均值，得出：表103.2重復(fù)性同一批次試劑對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算標(biāo)本測(cè)定結(jié)果平均值，得出批內(nèi)不精密度:CV≤5.0％。表103.3線性范圍選取肌鈣蛋白I24.9ng/ml的血清，用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，取五個(gè)梯度濃度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次取平均值，計(jì)算理論濃度與相應(yīng)實(shí)測(cè)值均值進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r，對(duì)理論值和實(shí)測(cè)值進(jìn)行直線回歸統(tǒng)計(jì)分析，回歸方程為Y＝25.675X+0.316,并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.0001)。表11表明本法在0.3-25.0ng/ml血清肌鈣蛋白I濃度范圍內(nèi)，實(shí)測(cè)值與理論濃度相關(guān)系數(shù)為r:0.994。4.討論和結(jié)論上述100例標(biāo)本中，肌鈣蛋白I異常標(biāo)本30例，肌鈣蛋白I正常標(biāo)本70例通過(guò)交叉列表分析、SPSS軟件統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：本發(fā)明準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、線性范圍寬，并且與對(duì)比產(chǎn)品在陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總的一致性及相關(guān)性等方面符合較好。因此，本發(fā)明的肌鈣蛋白I測(cè)定試劑盒能夠滿足臨床性能要求，有效性強(qiáng)，安全性高，可滿足全自動(dòng)化分析的要求，適用于大規(guī)模樣品的及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本申請(qǐng)所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本申請(qǐng)的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本申請(qǐng)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本申請(qǐng)構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本申請(qǐng)的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3