本發(fā)明涉及一種檢測外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞新靶標(biāo)蛋白的方法，尤其涉及一種檢測非小細(xì)胞肺癌患者外周血腫瘤細(xì)胞PDL1基因的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞程序式死亡配體1(Programmed cell death 1 ligand 1，PDL1)，也稱為表面抗原分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或B7同源體(B7 homolog 1，B7-H1)，是人類體內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，由CD274基因編碼。非小細(xì)胞肺癌通過表達(dá)PDL1來誘導(dǎo)形成免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，逃避機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞免于機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除。研究顯示PDL1/PD1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平與患者的臨床病理因素及預(yù)后存在顯著的相關(guān)性。PDL1/PD1抑制劑在非小細(xì)胞非小細(xì)胞肺癌患者的治療中都表現(xiàn)出了令人驚喜的療效及良好的耐受性，也提示了免疫治療可以作為一種安全而有效的治療方式。以PDL1/PD1為代表的免疫治療成為非小細(xì)胞肺癌的治療領(lǐng)域的新焦點。

目前通常使用免疫組織化學(xué)方法，檢測非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中的PDL1蛋白表達(dá)情況。該方法被認(rèn)為是PDL1檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但對于部分缺乏手術(shù)指證或存在手術(shù)禁忌癥的非小細(xì)胞肺癌患者，由于腫瘤組織無法切除，細(xì)針穿刺組織又容易造成腫瘤播散，PDL1狀態(tài)評估變得困難。另外，對于非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)早期的患者，由于無法獲得腫瘤組織樣本，更加無法判斷PDL1狀態(tài)。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cell，CTC)是從實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，它存在于非小細(xì)胞肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中，其檢測對于評估腫瘤患者的預(yù)后判斷、療效評估、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測，以及選擇合適的個體化治療具有重要的臨床意義。因CTC檢測具有實時、基本無創(chuàng)等特點，被稱為“無創(chuàng)液態(tài)活檢”。

CTCs檢測過程一般分為分離和檢測兩個步驟。CTCs分離的主要方法包括依賴于腫瘤細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的免疫學(xué)分離技術(shù)、依賴于免疫細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的免疫學(xué)分離技術(shù)及基于形態(tài)學(xué)富集的膜過濾技術(shù)(Isolating by size of epithelial tumor cells，ISET)。第一種方法是通過包被腫瘤細(xì)胞表面抗原的特異性抗體EpCAM、CK等的磁珠，借助外加磁場篩選富集CTCs，又稱陽性富集法。比如申請?zhí)枮?01310219229.X的中國專利公開了一種利用樹狀分子與特異性物質(zhì)共價偶聯(lián)并進(jìn)一步修飾后捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離方法。但是，該技術(shù)由于抗原表達(dá)的缺失及特異性問題，會造成假陰性結(jié)果。

第二種及第三種方法，是通過去除非腫瘤細(xì)胞成分的方法達(dá)到CTCs富集的目的，又稱陰性富集法。第二種方法是通過裂解紅細(xì)胞后，利用包被免疫細(xì)胞表面抗原的特異性抗體的磁珠，去除大部分的免疫細(xì)胞，從而留下CTCs及少量免疫細(xì)胞，從而達(dá)到富集CTCs的目的。例如申請?zhí)枮?01310200385.1的中國專利公開了一種裂解去除紅細(xì)胞并且利用免疫微珠去除白細(xì)胞等的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法。

第三種方法是根據(jù)細(xì)胞大小的差異，利用過濾的方法將體積較大的腫瘤細(xì)胞篩選富集。第二種和第三種方法的優(yōu)勢在于不會導(dǎo)致CTCs的丟失，方法簡單、價格低廉，分離獲得的CTCs具有活性可用于后續(xù)研究；但由于混雜有免疫細(xì)胞等非CTCs，無法直接準(zhǔn)確判斷CTCs的數(shù)量及種類。必須通過其它檢測手段才能準(zhǔn)確檢測CTCs。一般來說，需要先用石蠟包埋，然后做成石蠟切片后再進(jìn)行染色鑒定。整個檢測過程非常復(fù)雜困難。使得成本上升。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述提到的技術(shù)問題，以及為了克服傳統(tǒng)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測手段及對于缺乏手術(shù)指證或存在手術(shù)禁忌癥的非小細(xì)胞肺癌患者，及非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)早期的患者，由于無法獲得腫瘤組織樣本而無法判斷PDL1狀態(tài)的不足，本發(fā)明提供了一種非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PDL1基因的檢測方法，其特征在于，檢測方法如下：步驟a:對來自于非小細(xì)胞肺癌患者的外周血標(biāo)本進(jìn)行膜過濾，以獲得外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞；步驟b:對步驟a獲得的濾膜進(jìn)行固定；步驟c:對步驟b獲得的濾膜進(jìn)行原位檢測，以確定PDL1表達(dá)情況。常規(guī)PDL1檢測，是通過對病人腫瘤病理組織樣本進(jìn)行檢測，而對于無法取得腫瘤病理組織樣本的病人的PDL1表達(dá)情況無法檢測。本發(fā)明通過對病人的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分離和檢測，從而實現(xiàn)了對病人的PDL1表達(dá)情況進(jìn)行評估，解決了原本因無法取得腫瘤病理組織樣本而不能對病人PDL1進(jìn)行檢測的問題，使無論能否通過手術(shù)等手段取得腫瘤病理組織的所有病人受益。在本發(fā)明中，對來自于非小細(xì)胞肺癌患者的外周血標(biāo)本進(jìn)行膜過濾分離以獲取外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞以后；用同一張濾膜原位利用細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)方法檢測非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的PDL1和CD45表達(dá)情況。膜原位免疫熒光檢測PDL1相對于常規(guī)檢測，不需要將循環(huán)腫瘤細(xì)胞從濾膜上分離，也無需進(jìn)行常規(guī)病理組織免疫熒光檢測方法中包埋、脫蠟、蛋白修復(fù)等過程，避免了以上過程中對靶蛋白的損傷，使結(jié)果更加準(zhǔn)確，不必使用二甲苯等有機(jī)溶劑，降低環(huán)境污染，同時減少了步驟，使操作更加簡單、方便，并降低檢測成本。

優(yōu)選地，在步驟c之后，進(jìn)一步對所述濾膜用HE染色鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞。所述HE染色鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞也是在所述濾膜原位進(jìn)行的。在免疫熒光檢測PDL1之后，接著在濾膜原位用HE染色鑒定檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞，確定非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其數(shù)量。這相比常規(guī)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測中，通過循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的腫瘤標(biāo)準(zhǔn)物來確認(rèn)腫瘤細(xì)胞，減少了漏檢的風(fēng)險，更加準(zhǔn)確；同時，也減少了常規(guī)石蠟切片等一系列復(fù)雜的步驟，大大優(yōu)化了檢測。

優(yōu)選地，在利用細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的PDL1為單陽性表達(dá)的情況下，用HE染色的方法對樣本進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)分析，減少了常規(guī)通過腫瘤標(biāo)志物來確定循環(huán)腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致漏檢的風(fēng)險，更加準(zhǔn)確。

優(yōu)選地，在膜過濾之前對非小細(xì)胞肺癌患者的外周血進(jìn)行預(yù)處理：將采集的外周血樣用生理鹽水進(jìn)行2-10倍稀釋，稀釋后用0.1％-2％多聚甲醛固定外周血樣10-15分鐘。這樣可以使得過濾效果更佳。

優(yōu)選地，在過濾步驟中，將預(yù)處理后的外周血樣加入到膜過濾裝置的濾器倉后，使其依靠重力自然過濾。

優(yōu)選地，過濾結(jié)束后，在濾器倉內(nèi)加生理鹽水沖2-3次，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞被截留在濾膜上。

優(yōu)選地，濾膜取出后，將濾膜細(xì)胞面朝上置于干凈的新載玻片上，用中性樹脂固定膜于載玻片上；并將濾膜浸泡在4％多聚甲醛中，室溫靜置固定25min。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)方法檢測非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的PDL1和CD45表達(dá)情況的具體步驟如下：

1)用免疫組化筆圈出樣品區(qū)域；

2)通透：向樣本區(qū)域內(nèi)滴加200μ1含0.2％-1％Tween20或Triton的通透液通透30分鐘；

3)封閉：PBS漂洗3次，每次5分鐘，之后加入200μ1含3％BSA的PBS，封閉30min；

4)一抗孵育：加入PDL1、CD45一抗混懸液200μl，兩種一抗均以PBS稀釋，混勻后的終濃度為1:500，室溫下孵育40min；

5)二抗孵育：PBS洗滌3次，每次5分鐘，之后加入二抗混懸液200μl，兩種二抗均以PBS稀釋，混勻后的終濃度為1:1000，室溫下避光孵育30min，兩種二抗分別帶有紅色熒光和綠色熒光標(biāo)記；

6)細(xì)胞核染色及封片：PBS洗滌3次，每次5分鐘，之后加入DAPI50μl，染細(xì)胞核5min，蓋玻片封片；

7)熒光顯微鏡下2h內(nèi)觀察結(jié)果，拍照、記錄PDL1、CD45情況，確定是否存在PDL1單色陽性細(xì)胞；

根據(jù)本發(fā)明的實施例，在利用細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)方法檢測非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的PDL1為單陽性表達(dá)的情況下，用HE染色的方法對樣本進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)分析，具體步驟如下：

1)用自來水浸泡、沖洗去蓋玻片及熒光染料；

2)蘇木精液染色約5分鐘，自來水清洗染液；

3)分化：1％鹽酸乙醇分化液分化處理3-5秒，自來水洗；

4)伊紅染色：0.5％伊紅液染色1-2分鐘，自來水洗；

5)脫水：80％乙醇沖洗3-5秒，95％乙醇洗3-5分鐘，無水乙醇洗1分鐘；

6)封片：加30ul中性樹脂膠，蓋玻片封片；

7)拍照采集照片，可供細(xì)胞病理學(xué)專家閱片。

本發(fā)明的另一個方面還提供了一種膜過濾裝置，其包括：廢液缸、濾器架、濾器，所述濾器放置在濾器架的孔上，所述濾器架放置于廢液缸中。

優(yōu)選地，所述濾器包括濾器倉、濾膜、濾膜支撐物、濾器下口，所述濾膜置于濾膜支撐物上，所述濾器倉下部連接濾膜，所述濾器下口上部連接濾膜支撐物。

優(yōu)選地，濾膜為透明的濾膜。更優(yōu)選地，疏水材料制成，且其濾孔的直徑為8-10微米。

本發(fā)明另一方面提供了一種檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中PDL1蛋白的方法，所述方法通過檢測非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PDL1基因來確定，所述檢測步驟包括：步驟a:對來自于非小細(xì)胞肺癌患者的外周血標(biāo)本進(jìn)行膜過濾，以獲得外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞；步驟b:對步驟a獲得的濾膜進(jìn)行固定；步驟c:對步驟b獲得的濾膜進(jìn)行檢測，以確定外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的PDL1和CD45表達(dá)情況；步驟d:HE染色鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種檢測非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PDL1基因的試劑盒，其包括膜過濾裝置、用于免疫熒光雙標(biāo)方法的一抗混懸液和二抗混懸液、以及用于HE染色的蘇木精和伊紅。還可以進(jìn)一步包括：4％多聚甲醛、2％多聚甲醛、含0.5％Tween20的通透液、PBS、80％乙醇、95％乙醇、1％鹽酸乙醇、無水乙醇、0.5％伊紅液、中的一種或多種。

本發(fā)明還提供了一種濾膜在制備原位檢測非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PDL1的膜過濾裝置或試劑盒中的用途，其中，所述濾膜是透明的，所述濾膜為疏水材料制成，且其濾孔直徑為8-10微米。優(yōu)選地，檢測的方法如下：步驟a:對來自于非小細(xì)胞肺癌患者的外周血標(biāo)本用所述濾膜進(jìn)行過濾，以獲得外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞；步驟b:對步驟a獲得的濾膜進(jìn)行固定；步驟c:對步驟b獲得的濾膜進(jìn)行原位檢測，以確定PDL1表達(dá)情況。更優(yōu)選地，在步驟c中，使用免疫熒光雙標(biāo)方法對所述濾膜進(jìn)行原位檢測。尤其優(yōu)選地，如果在步驟c中檢測到PDL1單色陽性細(xì)胞，進(jìn)一步對所述濾膜用HE染色鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

有益效果：本發(fā)明借助ISET技術(shù)原理分離富集CTCs，通過免疫熒光雙標(biāo)排除PDL1陽性的CD45陽性白細(xì)胞的干擾，再對PDL1單陽性細(xì)胞并進(jìn)行HE染色病理分析，繞道滿足了臨床PDL1檢測金標(biāo)準(zhǔn)的要求，對于非小細(xì)胞肺癌患者醫(yī)學(xué)診斷具有很好的臨床推廣價值。

更重要的是,本發(fā)明實現(xiàn)了在同一張膜上原位進(jìn)行PDL1和病理檢測，極大地降低了檢測手續(xù)和成本提高了檢測效率。本發(fā)明提供的非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PDL1基因的檢測方法，該方法不依賴于是否獲得腫瘤組織樣本，同時，能夠在同一張膜片上，利用細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)方法和HE病理染色技術(shù)鑒定非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞及循環(huán)腫瘤細(xì)胞中PDL1的表達(dá)情況，本發(fā)明中同時檢測PDL1和CD45主要是為了排除白細(xì)胞的干擾，因為PDL1也會在白細(xì)胞膜上表達(dá)。而DAPI的用途是標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核，一般呈藍(lán)色。免疫熒光雙標(biāo)后PDL1單陽性表達(dá)說明符合PDL1檢測金標(biāo)準(zhǔn)的要求，再結(jié)合HE細(xì)胞病理學(xué)分析更加能明確癌細(xì)胞的狀態(tài)，對于醫(yī)學(xué)診斷具有很好的臨床推廣價值。

傳統(tǒng)地,循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測一般是通過病理染色形狀等確認(rèn)細(xì)胞數(shù)量；或者通過細(xì)胞表面標(biāo)志物確定細(xì)胞數(shù)量。本發(fā)明方法,直接檢測非小細(xì)胞肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞上的PDL1。大大提高了檢測效率，降低了檢測成本。

本發(fā)明的基因檢測方法不屬于診斷或者治療方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的膜過濾裝置結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明膜過濾裝置的濾器的結(jié)構(gòu)示意剖視圖；

圖3為本發(fā)明膜過濾裝置的濾器濾膜的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為非小細(xì)胞肺癌患者外周血分離獲取的循環(huán)腫瘤細(xì)胞PDL1免疫熒光圖；

圖5為非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞HE染色圖像。

附圖標(biāo)記說明：

1 廢液缸；

2 濾器架

3 濾器；

4 濾器倉；

5 濾膜；

6 濾膜支撐物；

7 濾器下口；

8 濾孔。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。

本發(fā)明中，術(shù)語HE染色蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining)，是石蠟切片技術(shù)里常用的染色法。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。

一、利用膜過濾裝置分離獲取非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：

非小細(xì)胞肺癌患者血液樣本的獲?。?/p>

采集5例已經(jīng)確診為非小細(xì)胞肺癌患者的外周血，每例采集外周血5ml。同時抽取5例正常人血液樣本5ml做陰性對照。

外周血液樣本預(yù)處理：

將按照上面步驟采集到的外周血樣用生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋，稀釋后用2％多聚甲醛固定外周血樣15分鐘；

過濾裝置的準(zhǔn)備：

過濾裝置的各個部件都是市售的，在預(yù)處理的間期，如圖1、2、3所示組裝膜過濾分離腫瘤細(xì)胞(ISET)裝置。用10ml生理鹽水潤洗濾器。

分離富集外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：

將經(jīng)過預(yù)處理的外周血樣加入到膜過濾裝置的濾器倉中，使其依靠重力自然過濾；過濾結(jié)束后，生理鹽水沖洗濾器倉及濾膜2-3次，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞被截留在濾膜上；

取膜及固定：

取出濾膜，將濾膜正面朝上置于干凈的新載玻片上，用中性樹脂固定膜于載玻片上，將濾膜浸泡在4％多聚甲醛中，室溫靜置固定25min。

二、利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)及HE病理染色技術(shù)鑒定非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：

(一)免疫熒光技術(shù)檢測PDL1表達(dá)情況：

1、用免疫組化筆圈出樣品區(qū)域；

2、通透：向樣本區(qū)域內(nèi)滴加200μ1含0.5％Tween20的通透液通透30分鐘；

3、封閉：PBS漂洗3次，每次5分鐘，之后加入200μ1含3％BSA的PBS，封閉30min；

4、一抗孵育：加入PDL1、CD45一抗混懸液200μl，兩種一抗均以PBS稀釋，混勻后的終濃度為1:500，室溫下孵育40min；

5、二抗孵育：PBS洗滌3次，每次5分鐘，之后加入二抗混懸液200μl，兩種二抗均以PBS稀釋，混勻后的終濃度為1:1000，室溫下避光孵育30min，兩種二抗分別帶有紅色熒光和綠色熒光標(biāo)記；其中，二抗是抗鼠Ig抗體、抗兔Ig抗體，并且抗體上帶有熒光標(biāo)記。

6、細(xì)胞核染色及封片：PBS洗滌3次，每次5分鐘，之后加入DAPI50μl，染細(xì)胞核5min，蓋玻片封片；

7、熒光顯微鏡下2h內(nèi)觀察結(jié)果，拍照、記錄PDL1、CD45情況，確定是否存在PDL1單色陽性細(xì)胞；如觀察到PDL1單色陽性細(xì)胞則繼續(xù)進(jìn)行下一步檢測，否則停止檢測。

(二)HE染色鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞：

1、用自來水浸泡、沖洗去蓋玻片及熒光染料；

2、蘇木精液染色約5分鐘，自來水清洗染液；

3、分化：1％鹽酸乙醇分化液分化處理3-5秒，自來水洗；

4、伊紅染色：0.5％伊紅液染色1-2分鐘，自來水洗；

5、脫水：80％乙醇沖洗3-5秒，95％乙醇洗3-5分鐘，無水乙醇洗1分鐘；

6、封片：加30ul中性樹脂膠，蓋玻片封片；

7、采集照片，細(xì)胞病理學(xué)專家閱片。

檢測結(jié)果分析：

5例健康志愿者均未查到循環(huán)腫瘤細(xì)胞；在5例非小細(xì)胞肺癌患者外周血檢測到的CTC，5例經(jīng)免疫熒光檢測到其有PDL1表達(dá)，陽性率為100％(表1)。

圖4所示為非小細(xì)胞肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PDL1免疫熒光圖像，細(xì)胞膜顯示明亮的紅色熒光。

圖5所示為非小細(xì)胞肺癌患者外周血分離獲取的循環(huán)腫瘤細(xì)胞HE染色圖，其細(xì)胞核較大，細(xì)胞核形狀不規(guī)則；高核質(zhì)比。

表1實施例檢測結(jié)果(PDL1)

上述實施例僅僅是通過舉例的方式描述。在不偏離本發(fā)明所附權(quán)利要求限定的保護(hù)范圍的情況下，可有各種變體。