本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑卡領(lǐng)域；尤其涉及一種用于檢測(cè)胃蛋白酶濃度的試劑卡、試劑盒和用途。
背景技術(shù)：
：胃蛋白酶是一種消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主細(xì)胞所分泌，功能是將食物中的蛋白質(zhì)分解為小的肽片段。在某些情況下胃液反流時(shí)，胃蛋白酶就會(huì)破壞原有黏膜的正常結(jié)構(gòu)，損害細(xì)胞間或細(xì)胞膜上的蛋白，從而引起一些并發(fā)癥，如咽喉炎癥，或誤吸入肺，引起氣道黏膜損傷，還會(huì)導(dǎo)致肺泡萎縮，咳嗽等。以往對(duì)于胃蛋白酶的檢測(cè)方法有ELISA等，操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。因此，建立一種快速檢測(cè)對(duì)于確定兒童是否是胃液反流引起的咳嗽具有非常重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)胃蛋白酶濃度的試劑卡。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)胃蛋白酶濃度的試劑卡，其特征在于，在PVC底板(6)上依次從一端往另一端粘合著樣品墊(1)，抗體承載膜(2)和吸水紙(3)，其中樣品墊為加樣區(qū)，所述樣品墊上噴有胃蛋白酶抗體1偶聯(lián)標(biāo)記物和生物素偶聯(lián)標(biāo)記物；所述抗體承載膜上有兩條線，靠近樣品墊的一邊是T線(4)，靠近吸水紙的一邊是C線(5)；所述T線為胃蛋白酶的抗體2噴涂在T線位置；所述C線為鏈霉親和素噴涂在C線位置。進(jìn)一步，所述樣品墊為玻璃纖維膜、聚酯膜或者全血過(guò)濾膜。進(jìn)一步，所述樣品墊上噴有胃蛋白酶抗體1偶聯(lián)標(biāo)記物和生物素偶聯(lián)標(biāo)記物，其兩者體積比為1:1，并用含質(zhì)量比為1％的BSA的pH7.4，0.01MPBS稀釋至工作濃度后噴在樣品墊上。進(jìn)一步，所述胃蛋白酶抗體1偶聯(lián)標(biāo)記物和生物素偶聯(lián)標(biāo)記物通過(guò)劃膜噴金儀器噴涂。進(jìn)一步，所述標(biāo)記物為熒光微球或膠體金。進(jìn)一步，所述抗體承載膜為硝酸纖維膜或尼龍膜。進(jìn)一步，所述胃蛋白酶的抗體2通過(guò)劃膜噴金儀器噴涂在T線位置；所述C線為鏈霉親和素劃膜噴金儀器噴涂在C線位置。本發(fā)明還提供一種試劑盒，其特征在于，含所述用于檢測(cè)胃蛋白酶濃度的試劑卡。所述用于檢測(cè)胃蛋白酶濃度的試劑卡或所述試劑盒用于檢測(cè)唾液和支氣管分泌物中胃蛋白酶的用途。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法為免疫層析法，優(yōu)選的為熒光免疫層析法，以熒光免疫層析法為例，其檢測(cè)原理為唾液或者支氣管分泌物經(jīng)過(guò)樣本緩沖液處理后加入試劑卡的加樣口，胃蛋白酶抗原與樣本墊上的胃蛋白酶抗體1偶聯(lián)熒光微球特異性結(jié)合形成胃蛋白酶抗原-胃蛋白酶抗體1-熒光微球，在抗體膜承載上層析，胃蛋白酶抗原-胃蛋白酶抗體-1熒光微球與T線上的胃蛋白酶抗體2形成特異性，最終在T線富集帶有熒光的胃蛋白酶抗體2-胃蛋白酶抗原-胃蛋白酶抗體1-熒光微球，C線上富集鏈霉親和素-生物素-熒光微球。通過(guò)熒光免疫分析儀采集T和C線熒光值。本發(fā)明所提供的應(yīng)用免疫層析法檢測(cè)人唾液、支氣管分泌物中的胃蛋白酶濃度，在檢測(cè)方法上，采用定量免疫層析法，使得操作易捷，提高靈敏度，使檢測(cè)結(jié)果更能滿足診斷要求。對(duì)于確定兒童是否是胃液反流引起的咳嗽具有非常重要的意義。本發(fā)明所述的試劑卡結(jié)構(gòu)構(gòu)造圖見(jiàn)圖1，其中①為樣品墊，所述材料為玻璃纖維膜；②為抗體承載膜，所述材料為硝酸纖維膜；③為吸水紙，④為T(mén)線所在位置；⑤為C線所在位置；⑥為帶粘合劑的PVC底板。采用本發(fā)明的試劑卡進(jìn)行檢測(cè)，快速準(zhǔn)確，靈敏度高，操作方便，穩(wěn)定性好。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明所述試劑卡條的結(jié)構(gòu)構(gòu)造圖。圖2是胃蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品熒光免疫層析分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類(lèi)似的標(biāo)號(hào)表示相同或類(lèi)似的元件或具有相同或類(lèi)似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。以下實(shí)施例中的胃蛋白酶抗體1、胃蛋白酶的抗體2和鏈霉親和素、生物素、胃蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品均可從市面上購(gòu)買(mǎi)到。實(shí)施例1：用于檢測(cè)胃蛋白酶濃度的膠體金法檢測(cè)試劑卡的制備胃蛋白酶抗體1偶聯(lián)膠體金和生物素偶聯(lián)膠體金的制備：1.取0.01質(zhì)量體積％HAuCl4水溶液100ml置于燒杯內(nèi)，加熱煮沸；加入0.75ml1質(zhì)量體積％枸櫞酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱煮沸5min，直至溶液呈橙紅色；2.以目測(cè)法確定膠體金與胃蛋白酶抗體1用量比例，將胃蛋白酶抗體1逐級(jí)稀釋后(由5μg～45μg另設(shè)對(duì)照管)，各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml10質(zhì)量體積％氯化鈉，如下表順序進(jìn)行。表1確定膠體金與胃蛋白酶抗體1用量試驗(yàn)中各試驗(yàn)管中的試劑加量表管數(shù)12345678910膠體金(ml)1111111111生物素(μg)51015202530354045010％NaCl(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1當(dāng)分別加入0.1ml10質(zhì)量體積％氯化鈉后、混勻靜置2h以上觀察結(jié)果。沒(méi)有加入胃蛋白酶抗體1的管為對(duì)照管。未加胃蛋白酶抗體1及加入胃蛋白酶抗體1量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入胃蛋白酶抗體1的量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的試管則膠體金的紅顏色不變。其中含胃蛋白酶抗體1量最低的試管即含穩(wěn)定1ml膠體金的必須胃蛋白酶抗體1量。在此基礎(chǔ)上再加上20質(zhì)量％即為穩(wěn)定所需胃蛋白酶抗體1的實(shí)際用量。按照上述實(shí)驗(yàn)確定的胃蛋白酶抗體1在攪拌下緩慢加入10mL膠體金中，在攪拌下再加入5質(zhì)量體積％的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1質(zhì)量體積％，充分混勻后，于12000轉(zhuǎn)5min離心，取上清并用1mL0.01MpH7.4PBS重懸，形成胃蛋白酶抗體1偶聯(lián)膠體金；以同樣方法，以目測(cè)法確定膠體金與生物素用量比例，將生物素逐級(jí)稀釋后(由5μg～45μg另設(shè)對(duì)照管)，各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml10質(zhì)量體積％氯化鈉，如下表順序進(jìn)行。表2確定膠體金與生物素用量試驗(yàn)中各試驗(yàn)管中的試劑加量表管數(shù)12345678910膠體金(ml)1111111111生物素(μg)51015202530354045010％NaCl(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1當(dāng)分別加入0.1ml10質(zhì)量體積％氯化鈉后、混勻靜置2h以上觀察結(jié)果。沒(méi)有加入生物素的管為對(duì)照管。未加生物素及加入生物素量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入生物素量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的試管則膠體金的紅顏色不變。其中含生物素量最低的試管即含穩(wěn)定1ml膠體金的必須生物素量。在此基礎(chǔ)上再加上20質(zhì)量％即為穩(wěn)定所需生物素的實(shí)際用量。按照上述實(shí)驗(yàn)確定的生物素在攪拌下緩慢加入10mL膠體金中，在攪拌下再加入5質(zhì)量體積％的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1質(zhì)量體積％，充分混勻后，于12000轉(zhuǎn)5min離心，取上清并用1mL0.01MpH7.4PBS重懸，形成生物素偶聯(lián)膠體金。將所述生物素偶聯(lián)膠體金和生物素偶聯(lián)膠體金按體積比1:1混合，并用含質(zhì)量比為1質(zhì)量體積％BSA的pH7.4，0.01MPBS稀釋至工作濃度(100-5000倍稀釋?zhuān)鶕?jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)?zāi)z體金檢出限肉眼可見(jiàn))。T線包被液的配制：用pH7.4，0.01MPBS稀釋液將胃蛋白酶的抗體2稀釋至工作濃度(0.5-5mg/ml據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)調(diào)整)，2-8℃?zhèn)溆?。C線包被液的配制：用pH7.4，0.01MPBS稀釋液將親和素稀釋至工作濃度(0.5-5mg/ml據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)調(diào)整)，2-8℃?zhèn)溆?。T線和C線包被：通過(guò)劃膜噴金儀將T線包被液和C線包被液同時(shí)包被在NC膜上，形成T線、C線，將該包被后的NC膜于45℃2h烘干。樣品墊噴膜：通過(guò)劃膜噴金儀將稀釋至工作濃度的胃蛋白酶抗體1偶聯(lián)膠體金和生物素偶聯(lián)膠體金噴在玻璃纖維素膜上，將該噴膜后的玻璃纖維素膜于45℃2h烘干。按照?qǐng)D1所示將玻璃纖維膜和烘干的包被后的NC膜、吸水紙依次粘貼組裝，組裝完成后用切條機(jī)切成每條寬度為4mm的試條，裝進(jìn)試條卡，壓卡，制備成檢測(cè)卡。干燥環(huán)境下避光備用。圖1中①為樣品墊，所述材料為玻璃纖維膜；②為抗體承載膜，所述材料為硝酸纖維膜；③為吸水紙，④為T(mén)線所在位置；⑤為C線所在位置；⑥為帶粘合劑的PVC底板。實(shí)施例2：用于檢測(cè)胃蛋白酶濃度的熒光定量檢測(cè)試劑卡的制備胃蛋白酶抗體1偶聯(lián)熒光微球和生物素偶聯(lián)熒光微球的制備：選取10mg熒光微球加入1mL含5質(zhì)量％戊二醛的0.01MpH7.4PBS溶液中反應(yīng)1h，12000轉(zhuǎn)5min離心去上清后再加入1mg胃蛋白酶抗體1均勻混合，于4℃反應(yīng)12h，12000轉(zhuǎn)5min離心后去上清，并用1mL0.01MpH7.4PBS重懸，形成胃蛋白酶抗體1偶聯(lián)熒光微球；以同樣方法，選用取10mg熒光微球加入1mL含5質(zhì)量％戊二醛的0.01MpH7.4PBS溶液中反應(yīng)1h，12000轉(zhuǎn)5min離心去上清后再加入1mg生物素混合，于4℃反應(yīng)12h，12000轉(zhuǎn)5min離心后去上清，并用1mL0.01MpH7.4PBS重懸，形成生物素偶聯(lián)熒光微球；將所述胃蛋白酶抗體1偶聯(lián)熒光微球和生物素偶聯(lián)熒光微球按體積比1:1混合，并用含質(zhì)量比為1％BSA的pH7.4，0.01MPBS稀釋至工作濃度(100-5000倍稀釋?zhuān)鶕?jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)的熒光強(qiáng)度及線性趨勢(shì)調(diào)整)。T線包被液的配制：用pH7.4，0.01MPBS稀釋液將胃蛋白酶的抗體2稀釋至工作濃度(0.5-5mg/ml據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)調(diào)整)，2-8℃?zhèn)溆谩線包被液的配制：用pH7.4，0.01MPBS稀釋液將親和素稀釋至工作濃度(0.5-5mg/ml據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)調(diào)整)，2-8℃?zhèn)溆?。T線和C線包被：通過(guò)劃膜噴金儀將T線包被液和C線包被液同時(shí)包被在NC膜上，形成T線、C線，將該包被后的NC膜于45℃2h烘干。樣品墊噴膜：通過(guò)劃膜噴金儀將稀釋至工作濃度的胃蛋白酶抗體1偶聯(lián)熒光微球和生物素偶聯(lián)熒光微球噴在玻璃纖維素膜上，將該噴膜后的玻璃纖維素膜于45℃2h烘干。按照?qǐng)D1所示將玻璃纖維膜和烘干的包被后的NC膜、吸水紙依次粘貼組裝，組裝完成后用切條機(jī)切成每條寬度為4mm的試條，裝進(jìn)試條卡，壓卡，制備成檢測(cè)卡。干燥環(huán)境下避光備用。圖1中①為樣品墊，所述材料為玻璃纖維膜；②為抗體承載膜，所述材料為硝酸纖維膜；③為吸水紙，④為T(mén)線所在位置；⑤為C線所在位置；⑥為帶粘合劑的PVC底板。實(shí)施例3：胃蛋白酶濃度的熒光定量檢測(cè)試劑卡樣本的檢測(cè)檢測(cè)樣本：設(shè)置胃液反流的咳嗽組與正常人群組。使用人唾液或者支氣管分泌物，采集完的樣本儲(chǔ)存4℃?zhèn)溆?。如不能及時(shí)檢測(cè)，2-8℃保存48小時(shí)，樣本在-20℃保存1個(gè)月，在-70℃中可保存6個(gè)月。檢測(cè)條件：(1)儀器：免疫熒光分析儀；(2)工作環(huán)境：室溫，室內(nèi)濕度45％-80％；(3)試劑盒恢復(fù)室溫，試劑卡現(xiàn)測(cè)現(xiàn)拆袋，避免受潮。檢測(cè)方法：取出2-8℃保存的樣本緩沖液，恢復(fù)室溫，吸取20μl臨床樣本加到180-580μl的樣本緩沖液中(具體緩沖液體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)靈敏度＜0.05，測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品0.1-10ng/mL，線性相關(guān)性R2≥0.9801來(lái)確定)，充分混勻，吸取80μl混合液，滴加到檢測(cè)卡的加樣口上，將檢測(cè)卡插入熒光免疫檢測(cè)儀器，按儀器顯屏上的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。樣本緩沖液：含質(zhì)量比為10％的牛血清白蛋白、體積比為10％的TWEEN-20、質(zhì)量比為0.01％的疊氮鈉的0.05MpH7.4PBS溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線：胃蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，檢測(cè)線熒光值的對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)，胃蛋白酶濃度在0.1-10ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(見(jiàn)表3和圖2)。其中C線是用于判斷該試劑卡是否無(wú)效的依據(jù)。如果C線熒光值低于標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)是的C線值的30-100％，則該試劑卡無(wú)效；如果C線熒光值在標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)時(shí)C線值的±30％，則該試劑卡有效，結(jié)果可用；表3胃蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果表濃度T線C線log(濃度)log(T線)1025369189541.0004.404514842187560.6994.17116854197410.0003.8360.5380718658-0.3013.5810.1161419523-1.0003.208檢測(cè)結(jié)果：熒光免疫分析儀檢測(cè)檢測(cè)線的熒光值經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)處理后帶入圖2的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣本濃度。結(jié)果見(jiàn)表4，從表4可以看出，胃液反流的咳嗽組的胃蛋白酶含量明顯高于正常人群組的胃蛋白酶含量。表4正常組與反流咳嗽組結(jié)果比較表實(shí)施例3：精密度、準(zhǔn)確性和靈敏度試驗(yàn)檢測(cè)方法和樣本處理同實(shí)施例2。精密度：批內(nèi)精密度，取同一批的檢測(cè)卡和緩沖液，用同一個(gè)已知濃度的血液平行檢測(cè)20個(gè)檢測(cè)卡，計(jì)算出CV＝8.7％。批間精密度，取3個(gè)批次的檢測(cè)卡和緩沖液，用同一個(gè)已知濃度的血液平行檢測(cè)60個(gè)檢測(cè)卡，計(jì)算出CV＝11.5％。測(cè)試結(jié)果如表5和表6。表520個(gè)檢測(cè)卡進(jìn)行的精密度試驗(yàn)結(jié)果表表660個(gè)檢測(cè)卡進(jìn)行的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表從表5和表6可以看出，本發(fā)明的試劑卡具有較好的精密度，誤差小。準(zhǔn)確性：在樣本中分別加入胃蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品4ng/mL、1ng/mL，回收率分別為101.5％和102.8％。檢測(cè)回收率落入85％-115％之內(nèi)，說(shuō)明本發(fā)明的試劑卡具有良好的準(zhǔn)確度。靈敏度：按20個(gè)測(cè)試0濃度樣本所得對(duì)數(shù)熒光值的均值+2SD計(jì)算，最小檢出限＜0.05ng/mL。說(shuō)明本發(fā)明的試劑卡具有良好的靈敏度。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3