本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c在制備結(jié)核病檢測(cè)試劑、結(jié)核疫苗以及抗結(jié)核藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的人畜共患傳染病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前全球約有1/3的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，其中約有10％有可能發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核。我國(guó)結(jié)核病感染率為44.5％，是全球22個(gè)結(jié)核病流行嚴(yán)重的國(guó)家之一、結(jié)核病人總數(shù)位居第二，僅次于印度。2014年WHO報(bào)告顯示2013年有900萬(wàn)新生病例和150萬(wàn)人死于結(jié)核病，其中36萬(wàn)屬于HIV陽(yáng)性病人，48萬(wàn)屬于多重耐藥結(jié)核病人(MDR-TB)，結(jié)核分枝桿菌合并人類(lèi)免疫缺陷病毒感染以及多重耐藥菌株的出現(xiàn)，使得結(jié)核病成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前，結(jié)核病仍是我國(guó)傳染病中危害最大的一種疾病，高特異性和高敏感性結(jié)核病早期檢測(cè)技術(shù)及試劑，對(duì)于結(jié)核病的早期診斷，及時(shí)隔離和治療，有效切斷傳染途徑，降低結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率至關(guān)重要。結(jié)核的診斷一般是依靠實(shí)驗(yàn)室診斷、影像學(xué)檢查和臨床診斷等，細(xì)菌學(xué)診斷中痰涂片染色鏡檢雖然簡(jiǎn)單易行，但對(duì)樣本的濃度要求較高，通常要含菌量在5000～10000/ml才可檢出陽(yáng)性，故陽(yáng)性率低，容易漏檢，樣本合格與否直接決定痰菌檢出率的陽(yáng)性與否。痰培養(yǎng)是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但周期長(zhǎng)，培養(yǎng)成功率只有80％，不利于快速檢測(cè)。臨床上最常用的是皮膚結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)，但皮膚實(shí)驗(yàn)受卡介苗(BCG)接種和環(huán)境分枝桿菌感染的干擾導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)，使其靈敏度較低，并且需要患者二次就醫(yī)。結(jié)核的影像學(xué)檢查如常規(guī)的X線檢查、CT檢查、MRI檢查、超聲檢查等價(jià)格昂貴，且對(duì)身體產(chǎn)生一定創(chuàng)傷性，特異性低，不適用于常規(guī)的檢查診斷。結(jié)核分枝桿菌侵入人體后寄居在巨噬細(xì)胞內(nèi)，人體對(duì)結(jié)核分枝桿菌主要的免疫反應(yīng)是細(xì)胞免疫，主要參與的細(xì)胞是CD4+和CD8+T細(xì)胞。被病原菌致敏的T淋巴細(xì)胞，再次接觸同種抗原后會(huì)釋放γ干擾素，高水平的γ干擾素反應(yīng)可以提示該病原菌的感染。以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的ELISPOT檢測(cè)方法是通過(guò)IFN-γ特異性抗體捕獲經(jīng)結(jié)核抗原刺激的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后產(chǎn)生的IFN-γ，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式呈現(xiàn)，從斑點(diǎn)的數(shù)量來(lái)確定細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況，從單細(xì)胞水平評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能。以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外γ干擾素的檢測(cè)被用于結(jié)核病的輔助診斷，這種檢測(cè)方法不僅能篩選出活動(dòng)性結(jié)核病人，同時(shí)也能檢測(cè)出潛伏期病人，從而能更好地預(yù)防和控制潛伏期結(jié)核，目前已有以結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)編碼的結(jié)核特異性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽為刺激物的商品化IGRA試劑盒，如QuantiFERON-TBGoldtest和T-SPOT，均呈現(xiàn)較高的靈敏性和特異性。Rv2351c(GI:15609488)是由結(jié)核分枝桿菌基因組差異區(qū)RD7編碼的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，又稱(chēng)膜磷酸酯酶plcA，該抗原蛋白含512個(gè)氨基酸，是可能的相關(guān)毒力因子，該蛋白在所有的BCG(BCG-Danish，BCG-Prague，BCG-Glaxo，BCG-Frappier，BCG-Connauht，BCG-Phipps，BCG-Tice，BCG-Pateur，BCG-Moreau，BCG-Brikhaug，BCG-Sweden，BCG-Japan，BCG-Russian，BCG-Brazil)中均缺失，進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)Rv2351c蛋白存在較多的T細(xì)胞表位，具有潛在的診斷效能，并且Rv2351c只在結(jié)核分枝桿菌和少數(shù)環(huán)境分枝桿菌中存在，能有效區(qū)分結(jié)核病患者、肺部疾患病人和健康人，同時(shí)不受卡介苗接種的影響。結(jié)核的快速和早期診斷為結(jié)核病的早期治療提供了有力保證，但要想在源頭上遏制結(jié)核病還應(yīng)從結(jié)核疫苗的制備方面入手。目前BCG疫苗是使用最廣泛的并且是唯一批準(zhǔn)使用的結(jié)核疫苗，BCG對(duì)嬰幼兒腦膜炎有很好的保護(hù)效率，但是對(duì)成人結(jié)核保護(hù)率高低不一，目前對(duì)結(jié)核疫苗的改造主要分為兩方面：一是新型亞單位疫苗作為加強(qiáng)免疫疫苗，以增強(qiáng)BCG引起的免疫應(yīng)答。二是將BCG缺失的免疫優(yōu)勢(shì)抗原重新重組到BCG疫苗中通過(guò)過(guò)表達(dá)免疫優(yōu)勢(shì)抗原，從而增強(qiáng)BCG引起的保護(hù)性免疫應(yīng)答。BCG疫苗已使用多年，其安全性已經(jīng)得到大量接種人群的驗(yàn)證，因此以上兩種疫苗改造策略均建立在BCG的基礎(chǔ)上有很大的優(yōu)勢(shì)。目前已有抗原如Ag85、Rv3425、HspX等多種免疫優(yōu)勢(shì)抗原被鑒定并正在用于結(jié)核疫苗的研究中。由于結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)菌，在肺泡巨噬細(xì)胞中定植和增殖，細(xì)胞免疫應(yīng)答在清除結(jié)核分枝桿菌中起到重要作用，研究也證實(shí)了體液免疫應(yīng)答引起的抗體能改變結(jié)核分枝桿菌的病程發(fā)展，其中研究證實(shí)IgM、IgG1、IgG3和IgA等是保護(hù)性抗體，因此細(xì)胞免疫和體液免疫在結(jié)核感染中都至關(guān)重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c在制備結(jié)核病檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。其中，所述抗原蛋白R(shí)v2351c的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有相同免疫原性和相同抗原性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供由所述抗原蛋白R(shí)v2351c衍生的蛋白或其類(lèi)似物。本發(fā)明還提供編碼所述抗原蛋白R(shí)v2351c的DNA分子。本發(fā)明還提供含有所述DNA分子的表達(dá)載體、表達(dá)盒。本發(fā)明還提供含有所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明還提供含有所述DNA分子的重組菌及其表達(dá)純化的重組蛋白。優(yōu)選利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)所述抗原蛋白R(shí)v2351c，優(yōu)選的原核表達(dá)載體為pET-30a載體，優(yōu)選的原核細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴(kuò)增出Rv2351c的目的片段，目的片段膠回收后連接到T4載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測(cè)序正確后，將質(zhì)粒雙酶切連接到pET-30a載體上轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，37℃，IPTG誘導(dǎo)后得到包涵體蛋白，經(jīng)純化復(fù)性后，得到有活性的Rv2351c蛋白。本發(fā)明還提供一種結(jié)核病檢測(cè)試劑，所述檢測(cè)試劑中含有結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c，或編碼所述抗原蛋白R(shí)v2351c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產(chǎn)生的重組蛋白。本發(fā)明還提供含有上述檢測(cè)試劑的結(jié)核ELISPOT檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒中還包括：①一抗：抗人或動(dòng)物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。②酶標(biāo)試劑：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人或動(dòng)物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標(biāo)準(zhǔn)品：培養(yǎng)板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應(yīng)板，陽(yáng)性對(duì)照孔中含有結(jié)核非特異性刺激抗原(如PHA等)，本地對(duì)照含有PBS或基底液。④其他ELISPOT檢測(cè)所需的試劑及耗材。優(yōu)選地，一抗固定在上述微孔反應(yīng)板上。本發(fā)明還提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c在制備結(jié)核疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種結(jié)核疫苗，其有效成分為結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c，或編碼所述抗原蛋白R(shí)v2351c的DNA分子，或由含有所述DNA分子的重組菌產(chǎn)生的重組蛋白。本發(fā)明還提供結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c在制備抗結(jié)核藥物中的應(yīng)用。以結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c作為免疫原，輔以佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備多克隆抗體；或者以結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c作為免疫原，輔以佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用雜交瘤技術(shù)和DNA重組技術(shù)，制備出識(shí)別結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c的人源化單克隆抗體。本發(fā)明還提供一種抗結(jié)核藥物，其有效成分是以結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c作為免疫原，輔以佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備的多克隆抗體，或者以結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c作為免疫原，輔以佐劑免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用雜交瘤技術(shù)和DNA重組技術(shù)，制備的識(shí)別結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c的人源化單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供所述抗原蛋白R(shí)v2351c在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染引起的特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。其是將人或動(dòng)物的淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原蛋白R(shí)v2351c刺激后，檢測(cè)T細(xì)胞或B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。其中，結(jié)核特異性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包括：γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等。B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包括抗體。針對(duì)結(jié)核特異性T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫膠體金試驗(yàn)、細(xì)胞因子內(nèi)染色和T細(xì)胞增殖試驗(yàn)等。B細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。所述淋巴細(xì)胞來(lái)自人或動(dòng)物的外周血、靜脈血、腦脊液、胸腔積液或胸水等。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(一)本發(fā)明提供一種新的結(jié)核檢測(cè)抗原，與以往采用單一抗原的檢測(cè)手段相比，可減少因單一抗原特異性T細(xì)胞造成的假陰性，從而提高檢測(cè)靈敏度。(二)本發(fā)明的抗原蛋白R(shí)v2351c存在于RD7區(qū)，在所有結(jié)核分枝桿菌和Mycobacteriumbovis中缺失，使檢測(cè)不受BCG接種的影響，有利于提高檢測(cè)的特異度。(三)本發(fā)明利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化蛋白R(shí)v2351c，適合大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，且成本較低。(四)本發(fā)明的抗原蛋白R(shí)v2351c是結(jié)核毒力相關(guān)因子，細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)的高強(qiáng)度顯示該抗原具有較強(qiáng)的免疫原性，可用作新型結(jié)核疫苗候選抗原。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中目的基因Rv2351c的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中蛋白R(shí)v2351c的SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果；其中，1為含空質(zhì)粒的BL21(DE3)菌，2為誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21(DE3)，3為純化的Rv2351c蛋白。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白R(shí)v2351c的ELISPOT試驗(yàn)斑點(diǎn)圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中Rv2351c結(jié)核病人和健康志愿者的ELISPOT實(shí)驗(yàn)斑點(diǎn)圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中各組血清抗體滴度的檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。實(shí)施例1結(jié)核分枝桿菌抗原基因Rv2351c的克隆及蛋白的表達(dá)純化1.引物設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI上結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組序列，利用軟件Primer5設(shè)計(jì)引物，上游引物：GCGCGGATCCATGTCACGTCGAGAGTTTTTG(含BamH1酶切位點(diǎn))，下游引物：ATATAAGCTTTCAGCTGCACAGCCCGCTGG(含HindⅢ酶切位點(diǎn))。2.目的基因的擴(kuò)增：利用CTAB法提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組DNA，以DNA為模板，進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)的體系如下：PCR反應(yīng)程序：95℃熱啟動(dòng)5min；94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃溫育10min。3.目的基因的鑒定：取7μlPCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用DL1000DNAMarker為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用凝膠成像系統(tǒng)查看結(jié)果并拍照保存。4.PCR產(chǎn)物的回收與純化：PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳，用消毒過(guò)的手術(shù)刀對(duì)目的條帶進(jìn)行切割，將含有目的片段的瓊脂塊置于2mlEP管中。A(1)向100mg膠塊中加入3倍體積的BufferPG，50℃孵育10分鐘，其間每隔2～3分鐘溫和地上下顛倒離心管，以確保膠塊完全溶解。A(2)加入1倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻。A(3)柱平衡：向已裝入收集管中的吸附柱中加入200μlBufferPS，16200g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。A(4)將步驟(1)得到的溶液加入到已裝收集管的吸附柱中，室溫放置2分鐘，16200g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回到收集管中。A(5)將吸附柱放到一個(gè)新的1.5ml離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50μlBufferEB，室溫放置2分鐘，16200g離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。5.質(zhì)粒的擴(kuò)增：將空質(zhì)粒pET-30a轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α中，在含氨芐霉素的LB固體平皿上37℃過(guò)夜后，挑取單個(gè)菌落，置于氨芐抗性的液體LB中過(guò)夜培養(yǎng)，次日用試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒)提取質(zhì)粒，步驟如下：B(1)取5～15ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液，加入離心管中，＞6200g離心3分鐘收集細(xì)菌，盡量棄去全部上清。B(2)向留有菌體沉淀的離心管中加入500μlBufferP1，使用移液器或渦旋振蕩器充分混勻，懸浮細(xì)菌沉淀。B(3)向離心管中加入500μlBufferP2，溫和地上下顛倒混勻6～8次，使菌體充分裂解，室溫放置3～5分鐘，向離心管中加入500μlBufferE3，立即上下顛倒混勻6～8次，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，室溫放置5分鐘，16200g離心10分鐘，吸取上清，將上清加入過(guò)濾柱中，16200g離心1分鐘過(guò)濾，將收集管中的濾液轉(zhuǎn)移到離心管中。向?yàn)V液中加入450μl異丙醇，上下顛倒混勻。B(4)柱平衡：向已裝入收集管的吸附柱中加入200μlBufferPS，16200g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。B(5)將步驟B(3)中濾液與異丙醇的混合溶液轉(zhuǎn)移到平衡好的吸附柱中。16200ⅹg離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。B(6)向吸附柱中加入750μlBufferPW，16200g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱重新放回到收集管中，16200g離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫干燥5分鐘。B(7)將吸附柱置于一個(gè)新的離心管中，向吸附膜的中間部位加入100～300μlEndo-FreeBufferEB，室溫放置2～5分鐘，16200g離心2分鐘，-20℃保存質(zhì)粒。6.將得到的DNA產(chǎn)物和質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切。DNA產(chǎn)物的酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒的酶切反應(yīng)體系為：分別37℃孵育1小時(shí)后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒(天根生化科技有限公司)對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，步驟如下：C(1)柱平衡步驟：向吸附柱CB2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2重新放回收集管中。C(2)向其中加入5倍體積的結(jié)合液PB，充分混勻。將所得溶液加入一個(gè)吸附柱CB2中，室溫放置2min，12000rpm離心30～60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。C(3)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm離心30～60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。C(4)重復(fù)操作上述步驟。C(5)將吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，將吸附柱CB2于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。C(6)將吸附柱CB2放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30～50μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min收集DNA溶液。7.重組質(zhì)粒和重組菌的獲得：連接：將酶切后純化得到的DNA和pET-30a質(zhì)粒用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接體系如下：16℃過(guò)夜連接。轉(zhuǎn)化：將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DN5α中，將5μl質(zhì)粒加入到裝有50μl感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，用槍吹打均勻，冰浴30min，42℃水浴90sec，冰浴2min，加400μl37℃預(yù)熱的不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃搖床中培養(yǎng)45min，150r/min,使細(xì)胞恢復(fù)抗藥性，4000r離心2min。棄去400μl上清，余下55μl混勻，涂LB平皿。置于室溫4～5min后，倒置平皿于37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)。測(cè)序：挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行菌液PCR(圖1)，驗(yàn)證陽(yáng)性的單克隆置于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)后，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確菌種再次擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中(步驟同上)。對(duì)轉(zhuǎn)化后的BL21(DE3)進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性后，一部分用甘油存放于-70℃作為菌種，一部分?jǐn)U大培養(yǎng)獲得蛋白。8.結(jié)核分枝桿菌抗原在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)：將1ml新鮮菌液加到300ml含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中于37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)后，次日再加入300mlLB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)后，測(cè)定OD值在0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)使其終濃度為1mmol/ml，37℃誘導(dǎo)3小時(shí)后，12000rpm離心5分鐘收集菌體，用含1％TritonX-100的PBS重懸菌體，混勻后，用功率300W超聲儀，工作5s，停止5s，超聲30min。12000rpm離心5min，將上清保留，沉淀用PBS重懸后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。確定蛋白以包涵體的形式表達(dá)在菌體沉淀中。9.Rv2351c蛋白的純化與復(fù)性：收集培養(yǎng)液，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集沉淀的菌體，每100ml菌液中加入4ml破碎緩沖液(pH8.550mMTris-HCL，2mMEDTA，100MmNaCl，0.5％TritonX-100，1mg/ml溶菌酶)，冰上混合45分鐘，混合菌體在冰水中用300W超聲儀工作5s，停止5s，超聲10分鐘，然后12000g離心10分鐘，棄去沉淀，用pH7.4的50mM磷酸緩沖液(含0.5MNaCl，8M尿素，10mM咪唑)重懸沉淀，并用0.45μm的濾膜過(guò)濾，避免堵柱。具體操作如下：(1)取1ml鎳NTA瓊脂糖凝膠預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，破碎上清以0.5ml/min上樣，然后2ml/管分裝。(2)用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1～2ml/min，2ml/管收集。(3)用5ml洗滌緩沖液(含0.5MNaCl，8M尿素，25mM咪唑)洗去未吸附的樣品，流速1～2ml/min，2ml/管收集。(4)用5ml洗滌緩沖液(含0.5MNaCl，8M尿素，40mM咪唑)洗去吸附的雜蛋白，流速1～2ml/min，2ml/管收集。(5)用5ml洗滌緩沖液(含0.5MNaCl，8M尿素，60mM咪唑)洗去目的蛋白，流速1～2ml/min，2ml/管收集。(6)用5ml洗脫緩沖液(含0.5MNaCl，8M尿素，300mM咪唑)洗去目的蛋白，流速1～2ml/min，2ml/管收集。(7)用5ml平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20％乙醇，封閉。將收集到的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖2)后，將目的蛋白用蛋白復(fù)性試劑盒進(jìn)行復(fù)性，并用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)復(fù)性的蛋白R(shí)v2351c進(jìn)行定量。蛋白R(shí)v2351c的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。實(shí)施例2結(jié)核ELISPOT檢測(cè)試劑盒的制備所述試劑盒基本組成如下：①實(shí)施例1制備的蛋白抗原Rv2351c。②一抗：抗人或動(dòng)物IFN-γ的小鼠IgG單克隆抗體。酶標(biāo)試劑：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人或動(dòng)物IFN-γ不同表位的另一種小鼠IgG單克隆抗體。③標(biāo)準(zhǔn)品：培養(yǎng)板：含有PVDF膜或硝酸纖維素膜的96孔微孔反應(yīng)板，陽(yáng)性對(duì)照孔中含有結(jié)核非特異性刺激抗原(如PHA等)，本地對(duì)照含有PBS或基底液。④其他ELISPOT檢測(cè)所需的試劑及耗材。將一抗固定在上述微孔反應(yīng)板上。該試劑盒是基于雙抗體夾心原理設(shè)計(jì)的，采用ELISPOT法檢測(cè)抗原，實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：PVDF膜上包被的一抗作為捕獲抗體能夠結(jié)合細(xì)胞上清中的IFN-γ，而IFN-γ又能被酶標(biāo)二抗捕獲、顯色。兩種抗體為識(shí)別IFN-γ不同抗原表位的單克隆抗體。實(shí)施例3抗原蛋白R(shí)v2351c用于結(jié)核感染的臨床檢測(cè)1.外周血淋巴細(xì)胞的分離1.1受試對(duì)象志愿者病例的篩選標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)癥狀、體征及胸部影像學(xué)檢查診斷為肺結(jié)核的，且痰培養(yǎng)為陽(yáng)性的肺結(jié)核患者。肺部疾病患者的篩選標(biāo)準(zhǔn)：痰培養(yǎng)和痰涂片為陰性的肺部其他疾病，如塵肺、慢阻肺等肺部疾病患者。健康志愿者的篩選標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)結(jié)核臨床癥狀、無(wú)結(jié)核病人密切接觸史、無(wú)其他疾病或感染。入選的結(jié)核病患者和志愿者年齡在15-80歲之間，從到結(jié)核病室就診的連續(xù)時(shí)間樣本中隨機(jī)選取。共采集了60例結(jié)核病志愿者、33例肺部疾病患者及60例健康志愿者血液樣本，采血時(shí)使用無(wú)內(nèi)毒素的肝素抗凝真空采血管采集外周靜脈血，每名志愿者采血約5ml～10ml。1)樣品于4小時(shí)內(nèi)用Ficoll-Hypaque分離液分離PBMCs。2)先將全血用RPMI-1640培養(yǎng)基1:1稀釋混勻，在離心管中加入一定體積的分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方，保持兩液面界面清晰，分離液、抗凝未經(jīng)稀釋全血、RPMI1640培養(yǎng)基體積比為1:1:1，室溫(18～26℃)，800g，離心20分鐘。3)離心結(jié)束后，管底是紅細(xì)胞，中間層是分離液，最上層是血漿層，血漿層與分離液層之間是白色云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)層。用吸管吸取白色云霧狀細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移至15ml無(wú)菌離心管中，加入RPMI1640培養(yǎng)基至10ml，室溫條件下800g離心10分鐘。4)棄上清，重懸后加入7mlRPMI1640培養(yǎng)基，700g離心10分鐘。5)棄上清加0.5mlAIM-V培養(yǎng)基重懸沉淀。6)利用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，用AIM-V培養(yǎng)基配制500μL細(xì)胞濃度為2.5×106/ml的細(xì)胞懸液。2.ELISPOT檢測(cè)抗原蛋白R(shí)v2351c特異性T細(xì)胞采用實(shí)施例2的試劑盒，向預(yù)包被一抗的微孔板中加入以下試劑，每個(gè)病人分別設(shè)4個(gè)檢測(cè)孔：陽(yáng)性對(duì)照孔(加100μL植物血凝素PHA作為陽(yáng)性刺激物)、陰性對(duì)照孔(加100μLPBS作為陰性對(duì)照)、檢測(cè)孔(加100μL終濃度為20μg/ml的Rv2351c)，每個(gè)孔中加入100μL上述稀釋好的PBMC，使每孔中PBMC的數(shù)量達(dá)25萬(wàn)個(gè)，將抗原與PBMC細(xì)胞置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20個(gè)小時(shí)。3.ELISPOT洗板及結(jié)果判定洗去PBMC細(xì)胞和抗原刺激物，加100μL一抗室溫下孵育1小時(shí)，用PBS洗5遍，加二抗室溫孵育1小時(shí)，再用PBS洗5遍，加底物避光顯色7分鐘后，用純化水終止顯色，將培養(yǎng)板放在通風(fēng)口處晾干觀察板上的斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果判定：空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)＝N、檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)＝T、陽(yáng)性質(zhì)控孔斑點(diǎn)數(shù)＝P。結(jié)果見(jiàn)表1、圖3和圖4。表1ELISPOT結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)60例結(jié)核病人、33例肺部其他疾病患者和60個(gè)健康人的結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。其中，60個(gè)健康人中有5人由于結(jié)果無(wú)法判定而被排除，總計(jì)55個(gè)健康人、60個(gè)結(jié)核病人和33個(gè)肺部其他疾病患者納入統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。表2Rv2351c人群檢測(cè)結(jié)果肺結(jié)核診斷陽(yáng)性肺結(jié)核診斷陰性總計(jì)檢測(cè)陽(yáng)性37845檢測(cè)陰性2380103總計(jì)6088148經(jīng)計(jì)算得出抗原蛋白R(shí)v2351c檢測(cè)結(jié)核病人的靈敏度為61.67％，特異度為90.91％。檢測(cè)靈敏度＝(結(jié)核病患者檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)/結(jié)核病患者總數(shù))×100％檢測(cè)特異度＝1-(肺結(jié)核病患者檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)+健康志愿者檢測(cè)陽(yáng)性數(shù))/(肺部疾病患者總數(shù)+健康志愿者總數(shù))實(shí)施例4Rv2351c的免疫原性檢測(cè)1、免疫小鼠篩選6周齡的雌性BALB/c小鼠30只，分為5組，PBS陰性對(duì)照組(PBS)，佐劑對(duì)照組(DP)，結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白Ag85B20μg低劑量組(Ag85b-L)、Ag85B50μg高劑量組(Ag85B-H)、Rv2351c20μg低劑量組(2351c-L)、Rv2351c50μg高劑量組(2351c-H)，將每組抗原與相應(yīng)的佐劑--多聚肌苷酸poly(I:C)50μL和雙十八烷基二甲基溴化銨(DDA)100μL充分乳化后采用皮下接種的方式免疫小鼠，每隔3周免疫一次，共免疫三次，末次免疫4周后進(jìn)行檢測(cè)。2、小鼠血清的分離小鼠眼球采血500μL，將血液置于37℃溫箱中2小時(shí)，之后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中過(guò)夜。次日，將血液3000rpm離心5分鐘后吸取上清。3、血清抗體滴度檢測(cè)1)將酶標(biāo)板用2μg/ml的Rv2351c蛋白4℃過(guò)夜包被，次日，用PBST洗滌5遍。2)用含2％BSA的PBS液37℃封閉2小時(shí)，用PBST洗滌5遍。3)用PBS將各組血清按20000、40000、80000、160000、320000、640000、1280000、2560000倍稀釋?zhuān)靠字屑尤?00μL稀釋后的血清，37℃孵育1小時(shí)后，用PBST洗5遍。4)分別加入5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的IgG、IgG1、IgG2a抗體，每孔100μL，37℃孵育1小時(shí)后，用PBST洗5遍。5)加入TMB37℃顯色15分鐘后，加入2M硫酸作為終止液。6)酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450nm的吸管光度值。7)判斷標(biāo)準(zhǔn)：OD≥2.1×OD(陰性對(duì)照)的判定為陽(yáng)性。8)結(jié)果分析：各組血清的抗體滴度見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，Rv2351c高、低劑量組產(chǎn)生的IgG、IgG1、IgG2a抗體滴度均很高，Rv2351c-L、Rv2351c-H分別比Ag85b-L、Ag85B-H組引起更高濃度的IgG，Rv2351c-L和Rv2351c-H組IgG2a/IgG1的比值分別是2.5和3.5，Rv2351c更傾向于誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，能刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的體液免疫應(yīng)答。實(shí)施例5Rv2351c的細(xì)胞免疫原性檢測(cè)1、將實(shí)施例4中免疫的小鼠處死后，在75％酒精中浸泡5分鐘，將小鼠固定在超凈臺(tái)中的泡沫板上，剪開(kāi)腹膜，分離出脾臟，將其置于裝有1640的平皿中。2、在200目的尼龍網(wǎng)上，用注射器內(nèi)芯輕輕研磨小鼠脾臟，將研磨的細(xì)胞通過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾。1000r/min離心5分鐘棄上清，獲得細(xì)胞。3、將細(xì)胞輕輕振蕩使其松動(dòng)，按照2mL/只加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后，置于37℃溫箱中孵育10分鐘后，加入2倍體積于紅細(xì)胞裂解液的1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)，1000r/min離心5分鐘棄上清，獲得脾細(xì)胞。4、用1640培養(yǎng)基2ml/只重懸脾細(xì)胞，1000r/min離心5分鐘棄上清，獲得脾細(xì)胞。用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定細(xì)胞濃度。5、用含有10％FBS的1640培養(yǎng)基稀釋脾細(xì)胞，使其濃度為2×106/mL。每組取500μL脾細(xì)胞置于24孔培養(yǎng)板中，PBS組和DP佐劑組脾細(xì)胞分別用5μg/mL的Ag85B和5μg/mL的Rv2351c抗原共同刺激，Ag85B-L和Ag85B-H組分別用500μL5μg/mL的Ag85B抗原共同孵育，2351c-L和2351c-H組分別用500μL5μg/mL的Rv2351c抗原共同孵育，每組加入500μL的無(wú)菌PBS和500μL濃度為5μg/mL的植物血凝素(PHA)作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)檢測(cè)孔都做2個(gè)重復(fù)。將脾細(xì)胞與相應(yīng)的刺激物在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)后，收集細(xì)胞上清，ELISA方法檢測(cè)上清中的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10。6、將IFN-γ單抗、IL-2單抗、IL-4單抗等用碳酸包被液(pH＝9.6)，L-10單抗用碳酸緩沖液(pH＝6.5)按照1:500倍稀釋后，按100μL/孔加入到96微孔板中，4℃包被過(guò)夜。7、用PBTS洗滌3遍后，拍干，加入10％FBS的PBS室溫封閉1個(gè)小時(shí)。8、用PBST洗滌5遍后，將IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的標(biāo)準(zhǔn)品按照對(duì)應(yīng)的比例稀釋成相應(yīng)濃度，分別加入到每個(gè)ELISA板上，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。其余加入100μL需要檢測(cè)的細(xì)胞上清，室溫孵育2小時(shí)。9、用PBST稀釋5遍后，分別加入100μLIFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10各自的檢測(cè)抗體+HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。10、用PBST洗滌7遍后，加入TMB顯色液100μL，室溫孵育30分鐘后，加入終止液50μL終止反應(yīng)。11、酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的吸光值，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)570nm的吸光值作為對(duì)照。12、結(jié)果分析：根據(jù)細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將檢測(cè)孔的OD值代入公式，計(jì)算每組小鼠各種細(xì)胞因子的終濃度。結(jié)果如表3所示。表3四種細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果(pg/mL)分組/細(xì)胞因子IFN-γIL-2IL-4IL-10PBS組29.6±11.811.9±47.8±2.422.1±6DP佐劑組40.3±11.417.5±1112.1±3.434.6±10.2Ag85B-L4098.6±593.5ab45±10.3ab20.8±6ab1590.3±438.1abAg85B-H5257.4±818.5ab43.4±19.6ab38.4±19.4ab3884.6±972.4ab2351c-L3805.3±1061.2ab31.4±12.936.1±8.9ab2860.9±485.2ab2351C-H4978.7±596.7ab33±12.168.3±15.5ab4733.7±629.2ab注：a表示實(shí)驗(yàn)組與PBS組相比，有顯著性差異，b表示實(shí)驗(yàn)組與DP佐劑組相比，有顯著性差異。結(jié)果顯示，與PBS組和佐劑組相比，Rv2351c高低劑量組均能產(chǎn)生較高濃度的IFN-γ(P＜0.001)、IL-4(P＜0.001)、IL-10(P＜0.001)，IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子，可以通過(guò)激活巨噬細(xì)胞從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除。IL-4和IL-10是Th2型細(xì)胞因子，促進(jìn)結(jié)核感染過(guò)程中的抗體產(chǎn)生。在結(jié)核感染中起到免疫調(diào)節(jié)作用。綜上所述，Rv2351c可以作為一種診斷試劑用于結(jié)核病的診斷檢測(cè)，且Rv2351c能引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，是一種免疫優(yōu)勢(shì)抗原，可以用于結(jié)核疫苗的構(gòu)建和制備。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3