本發(fā)明涉及一種用于檢測亞精胺/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(spermidine/spermineN1-actyltransferase，簡稱SSAT)含量的方法，特別是一種檢測SSAT含量的體外檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：多胺是人體中一類重要的含高密度正電荷的小分子有機(jī)化合物，包括腐胺、亞精胺和精胺，參與細(xì)胞內(nèi)眾多重要的生物學(xué)過程，如基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、細(xì)胞周期等。SSAT是多胺代謝途徑的速度限制酶，含171個氨基酸殘基，其同源二聚體為SSAT的活性形式，表面含有兩個酶活性位點(diǎn)。SSAT為胞質(zhì)酶，半衰期非常短(20-40min)，能被泛素化和蛋白酶體快速降解。研究表明，多胺水平的高低與癌癥、炎癥、中風(fēng)、腎衰和糖尿病等多種疾病密切相關(guān)，其含量的增加能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。SSAT在維持體內(nèi)多胺代謝平衡中起重要作用。SSAT催化亞精胺/精胺的乙?；磻?yīng)，分別將它們轉(zhuǎn)化為N1-乙酰亞精胺和N1-乙酰精胺，還可繼續(xù)將N1-乙酰精胺乙酰化，生成N1,N12-二乙酰精胺。反應(yīng)所需的乙?；梢阴oA提供。亞精胺和精胺被轉(zhuǎn)化為乙酰多胺，從而有效降低了細(xì)胞內(nèi)的多胺水平。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)SSAT含量極低，但在高多胺水平、多胺類似物處理和多種病理性刺激下，SSAT表達(dá)水平迅速增加，因?yàn)槎喟坊蚨喟奉愃莆锱cSSAT結(jié)合后，SSAT的半衰期大大延長。SSAT含量的高低還與胰腺炎、再生組織生長障礙、肥胖、糖尿病等相關(guān)。有研究指出，SSAT持續(xù)性高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤發(fā)生，而急性誘導(dǎo)性SSAT高表達(dá)則能抑制腫瘤生長和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。有報道患有伴X染色體病——棘狀禿發(fā)性毛囊炎的病人的SSAT基因片段重復(fù)，因此推斷可能與SSAT過表達(dá)有關(guān)；此外，還有研究顯示自殺傾向的精神病人的SSAT表達(dá)有所減少。SSAT含量的高低與人類健康密切相關(guān)。因此，SSAT定量檢測具有十分重要的意義。如果通過測定乙酰多胺產(chǎn)物的量間接測定SSAT含量，測定結(jié)果往往偏高，因?yàn)闊o法將SSAT乙?；a(chǎn)物與其他蛋白的乙?；a(chǎn)物區(qū)分；也可以測定SSAT專一催化的亞精胺N1位乙?；a(chǎn)物的量，但需要結(jié)合使用SSAT抗血清，測定過程比較繁雜；有報道用14C標(biāo)記乙酰輔酶A，進(jìn)而測定含有14C的乙酰多胺產(chǎn)物來測定細(xì)胞粗提物中SSAT的含量，但此方法不適用于檢測大量樣本，且成本較高。目前用于直接測定SSAT含量的方法報道較少，本研究開發(fā)的利用全自動生化分析儀檢測SSAT含量的納米金檢測試劑盒，是一種廉價、方便的檢測技術(shù)，能夠一次對大量樣本進(jìn)行檢測，并且其檢測的含量范圍廣。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種檢測SSAT含量的體外檢測試劑盒及其檢測方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種檢測SSAT含量的體外檢測試劑盒，包括R1、R2試劑、SSAT標(biāo)準(zhǔn)品和SSAT質(zhì)控品；R1、R2試劑為納米金標(biāo)記物R1、R2試劑，其中，R1試劑與R2試劑為1:3至3:1。所述納米金標(biāo)記物R1、R2試劑是針對重組人SSAT抗原所制備的鼠抗人單克隆抗體經(jīng)納米金標(biāo)記所得。所述R1試劑為單偶聯(lián)5F4的納米金的保存液，R2試劑為單偶聯(lián)2D6的納米金的保存液；其中，R1試劑中5F4的添加量為5-40μg/mL，R2試劑中2D6的添加量為5-40μg/mL。其中，納米金標(biāo)記物R1、R2試劑是針對重組人SSAT抗原所制備的鼠抗人單克隆抗體經(jīng)納米金標(biāo)記所得，鼠抗人單克隆抗體包含2D6和5F4。所述鼠抗人單克隆抗體2D6和5F4均與SSAT抗原特異性結(jié)合。R1和R2試劑的具體制備方法為：取1mL納米金加0-10.5μL的0.2MK2CO3，混勻后再加入10-25μg的5F4或2D6抗體，迅速混勻靜置10-20min，加入10-20μLBSA，再次混勻靜置10-20min，7000-9000r/min離心5-10min，棄上清，沉淀用1-2mL復(fù)溶液復(fù)溶即得R1、R2試劑。所述R1、R2試劑中保存液按重量百分比計(jì)，均為Tris0-0.6％、BSA0.2-3％、PEG-200000.1-0.5％、海藻糖0.5-8％、PVP-400-1.5％、Tween-800-0.5％、疊氮鈉0.02-0.1％，PEG60001-5％，NaCl0.6-1.6％，余量組分為水。所述SSAT標(biāo)準(zhǔn)品為重組人SSAT抗原經(jīng)純化所得的精胺/精瞇N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)的重組酶；SSAT質(zhì)控品為重組人SSAT抗原經(jīng)純化所得的精胺/精瞇N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)的重組酶或含有該酶的樣本。所述重組人SSAT抗原經(jīng)純化所得的精胺/精瞇N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)的重組酶為將產(chǎn)精胺/精瞇N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)的重組大腸桿菌BL21(DE3)接種于種子培養(yǎng)基中，于30～37℃振蕩培養(yǎng)8～12h，而后將種子培養(yǎng)液按體積比3～10％的接種量接種至表達(dá)培養(yǎng)基，于30～37℃振蕩培養(yǎng)4～6h小時，搖床轉(zhuǎn)速150～200r/min；而后向表達(dá)培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑，于20～30℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)14～22h，搖床轉(zhuǎn)速150～200r/min，所得培養(yǎng)液離心后收集上清液，即為胞外粗提重組酶SSAT；沉淀離心收集菌體細(xì)胞沉淀并超聲破碎，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內(nèi)粗提重組酶SSAT；將獲得胞外和胞內(nèi)粗提重組酶經(jīng)純化，即可。所述產(chǎn)精胺/精瞇N1-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(SSAT)的重組大腸桿菌BL21(DE3)為將經(jīng)密碼子優(yōu)化的精胺/精瞇N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)基因(SEQIDNo.1)兩端進(jìn)行修飾，而后與pET-39b(+)載體連接，連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到重組大腸桿菌，待用。所述表達(dá)培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為：蛋白胨9～11g，酵母粉5～24g，MgCl20～0.83g，KCl0～0.186g，ZnCl20～0.186g，50％的甘油0～20％，50％的蔗糖0～20％，50％的葡萄糖0～20％，精氨酸0～10mM，半胱氨酸0～10mM，其余成分為0.25mol/LTris-HCl。所述表達(dá)培養(yǎng)基中添加的誘導(dǎo)劑為每升所述表達(dá)培養(yǎng)基0～5g，其中誘導(dǎo)劑為IPTG或乳糖。種子培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為：蛋白胨9～11g，酵母粉4～6g，NaCl9～11g，其余成分為水。一種利用檢測SSAT含量的體外檢測試劑盒檢測的方法，利用抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生凝集，再通過納米金和乳膠顆粒經(jīng)微粒放大信號的原理檢測樣本中SSAT的含量。原理：本試劑盒采用雙抗體夾心免疫比濁法原理，SSAT抗原與標(biāo)記在納米金上的抗SSAT單克隆抗體特異性結(jié)合，使納米金聚集形成免疫復(fù)合物，通過生化分析儀可測定溶液濁度，濁度與復(fù)合物的含量成正比，可通過測定標(biāo)準(zhǔn)品，建立一條反應(yīng)度對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可測定SSAT含量。其中R1和R2分別標(biāo)記可同SSAT特異性結(jié)合的抗體，試劑盒中的SSAT標(biāo)準(zhǔn)品用于檢測過程中的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，SSAT質(zhì)控品用于的標(biāo)準(zhǔn)曲線及試劑盒進(jìn)行質(zhì)量控制。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明所采用的體外檢測試劑盒的內(nèi)容物中包括針對SSAT的特異性單克隆抗體和納米金標(biāo)記測定所需試劑，與新型納米金免疫檢測方法相結(jié)合，用于檢測人體SSAT含量的體外檢測，具有操作簡便、檢測速度快、精密度高、重復(fù)性好、檢測結(jié)果不受操作影響等優(yōu)勢。附圖說明圖1是SSAT生化檢測產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為SSAT酶SDS-PAGE圖；其中，M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1號泳道為SSAT酶表達(dá)沉淀、2號泳道為SSAT酶表達(dá)上清。圖3為誘導(dǎo)劑濃度圖；其中，M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1號泳道為加入0.1g/L乳糖誘導(dǎo)的SSAT酶表達(dá)沉淀、2號泳道為0.1g/L乳糖誘導(dǎo)的SSAT酶表達(dá)上清、3號泳道為加入0.7mMIPTG誘導(dǎo)的SSAT酶表達(dá)沉淀、4號泳道為0.7mMIPTG誘導(dǎo)的SSAT酶表達(dá)上清、5號泳道為未加入誘導(dǎo)劑的SSAT酶表達(dá)沉淀、6號泳道為未加入誘導(dǎo)劑的SSAT酶表達(dá)上清。具體實(shí)施方式下列實(shí)施例應(yīng)被理解被僅僅是舉例說明性的，而不是以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1試劑盒包括R1試劑，R2試劑，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品；其中R1試劑與R2試劑體積比為＝150：150；其中，R1試劑為2mL納米金、20μg5F4抗體和2mLR1保護(hù)液；R2試劑為2mL納米金、20μg2D6抗體和2mLR1保護(hù)液；R1、R2保護(hù)液按重量百分比計(jì)為：0.5％Tris、0.5％BSA、0.5％PEG-20000、5％海藻糖、1％PVP-40、0.01％Tween-80、4％PEG6000、1％NaCl、0.05％的疊氮鈉，余量組分為水。所述R1試劑的配制，取2mL納米金加7μL的0.2MK2CO3；混合后加入20μg5F4抗體，混勻靜置10min；再加10μL封閉液(20％BSA)進(jìn)行封閉，再次混勻靜置10min；離心5min，轉(zhuǎn)速為8000r/min，棄上清，沉淀用2mLR1保護(hù)液復(fù)溶。所述R2試劑的配制，取2mL納米金加7μL的0.2MK2CO3；混合后加入20μg2D6抗體，混勻靜置10min；再加10μL封閉液(20％BSA)進(jìn)行封閉，再次混勻靜置10min；離心5min，轉(zhuǎn)速為8000r/min，棄上清，沉淀用2mLR1保護(hù)液復(fù)溶。精胺/精瞇N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)基因密碼子的優(yōu)化，根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性表和經(jīng)驗(yàn)，對精胺/精瞇N1-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(SSAT)基因密碼子的優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果如序列所示。精胺/精瞇N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)基因的克隆，優(yōu)化的精胺/精瞇N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)由生物技術(shù)有限公司合成。在該基因的兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，分別為BamHI和XhoI，將該基因連接在pET-39b(+)載體上。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pET39b-p.MD-SSAT轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)中，在培養(yǎng)平板上篩選陽性克隆。將上述鑒定正確的重組陽性克隆接種于種子培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h小時。將上述培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比6％的接種量接種至3瓶表達(dá)培養(yǎng)基，于30℃振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速180r/min；培養(yǎng)至1號瓶OD600＝0.639、2號瓶OD600＝0.667和3號瓶OD600＝0.633，再向2號瓶中添加0.7mM的誘導(dǎo)劑IPTG，3號瓶中添加0.1g/L的誘導(dǎo)劑乳糖，1號瓶中不添加任何誘導(dǎo)劑，于20℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)18h，搖床轉(zhuǎn)速160r/min表達(dá)完畢；8000r/min離心5min收集菌體，稱重后加入濕菌種(g)×20倍的PBS緩沖液，進(jìn)行超聲破碎；12000r/min、4℃離心10min，收集上清。將上述超聲破碎后離心收集的發(fā)酵菌體，使用PBS緩沖液(pH7.4)重懸菌體，重懸后對菌體進(jìn)行冰浴，同時進(jìn)行超聲破碎。收集破碎產(chǎn)物12000rpm，4℃離心20min，收集離心上清，0.45μm過濾。使用PBS緩沖液平衡Ni-NTA色譜柱，將過濾后含有SSAT重組蛋白的樣本上樣，上樣完成后使用PBS+25mM咪唑緩沖液(pH7.4)漂洗色譜柱，使用PBS+250mM咪唑緩沖液(pH7.4)洗脫目的蛋白，觀察紫外吸收變化情況，收集蛋白。使用PBS(pH7.4)緩沖液平衡SephadexG25色譜柱，將目的蛋白上樣，上樣完成后使用PBS緩沖液沖洗色譜柱，觀察紫外吸收變化情況，收集SSAT蛋白純品，并使用蛋白濃度檢測試劑盒對SSAT濃度進(jìn)行確認(rèn)。上述，種子培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，其余成分為水。表達(dá)培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為：蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，MgCl20.39g，KCl0.186g，50％的甘油2％，半胱氨酸80mM，其余成分為0.25mol/LTris-HCl。5F4、2D6的獲得：1選擇純種BalB/C小鼠，SSAT抗原加佐劑：初次免疫，抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射(0.4ml,0.1ml/點(diǎn))；3周后第二次，免疫劑量同上，佐劑使用弗氏不完全佐劑；3周后第三次免疫，劑量及試劑同第二次免疫，(7天后采血測其效價)；3周后加強(qiáng)免疫，劑量50～100μg為宜，靜脈內(nèi)注射；3天后無菌取脾臟，使用RPMI1640無血清培養(yǎng)液洗一次，脾臟研碎，過細(xì)胞篩，離心，脾細(xì)胞用RPMI1640無血清培養(yǎng)液洗2次，計(jì)數(shù)，取1×108脾淋巴細(xì)胞懸液備用。(細(xì)胞融合前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞，使用BalB/C鼠，向其腹腔注入10mlRPMI1640無血清培養(yǎng)液，按揉3分鐘，吸出培養(yǎng)液洗一次，計(jì)數(shù)，按每孔2萬個飼養(yǎng)細(xì)胞量鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，備用)2制備骨髓瘤細(xì)胞取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心，用RPMI1640無血清培養(yǎng)液洗2次，計(jì)數(shù)，取得1×107細(xì)胞備用。3融合①骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按細(xì)胞個數(shù)比1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用RPMI1640無血清培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min；棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇(PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動。②90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml45％PEG(分子量4000)溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。③加37℃預(yù)熱的RPMI1640無血清培養(yǎng)液，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。④離心，800rpm,6min。⑤棄上清，用含20％小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。⑥將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。⑦將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，在用HAT選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量骨髓瘤細(xì)胞死亡，3～4天后瘤細(xì)胞消失，雜交瘤細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。5使用ELISA方法對抗體活性進(jìn)行鑒定。6亞克隆(1)克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層(同細(xì)胞融合)。(2)將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹吸成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。(3)調(diào)整細(xì)胞濃度為10～40個細(xì)胞/ml。(4)取前一天準(zhǔn)備好飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞100μl。孵育于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中。(5)在第7天換液，以后每2～3天換液1次。(6)8～9天可見細(xì)胞克隆形成，及時檢測抗體活性。(7)將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。(8)再將細(xì)胞擴(kuò)至175培養(yǎng)瓶中，備制備腹水用。(9)向BalB/C鼠腹腔注射0.5ml液體石蠟，1周后腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水。(10)腹水經(jīng)純化后可得單克隆SSAT抗體純品。通過免疫層析方法篩選不同克隆的抗體，經(jīng)篩選配對使用5F4、2D6作為本試劑盒使用配對抗體。將純化后的不同克隆的抗體分別標(biāo)記在納米金和包被NC膜上，所有抗體標(biāo)記工藝均為1mL納米金中加入7μL0.2MK2CO3后加入20μg抗體，標(biāo)記后離心加入100μL復(fù)溶液懸浮，復(fù)溶液成分為40mMtris、1g/LPEG20000、1g/LPVP40、40g/L海藻糖，懸浮后噴在玻璃纖維上，45℃烘干30min,所有包被工藝均使用10mMPBSPH＝7.2將抗體稀釋至1mg/mL后包被在NC膜上，37℃烘干15min,將結(jié)合了不同抗體的納米金-玻璃纖維和NC膜配對做成試紙條后加入濃度為10μg/mLSSAT樣本和0.5％Casein-na，挑選0.5％Casein-na不顯色，同時10μg/mLSSAT樣本顯色最深的配對抗體。按照該方法進(jìn)行篩選得出5F4、2D6最佳配對。所述SSAT標(biāo)準(zhǔn)品是使用含20％BSA、120mM殼聚糖溶液梯度稀釋SSAT重組蛋白純品濃度為0、5、10、15、20μg/mL5個濃度。所述質(zhì)控品是使用小牛血清稀釋SSAT重組蛋白至10μg/mL、15μg/mL兩個濃度。納米金為按照現(xiàn)有檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備獲得。SEQIDNo.1(a)序列特征：*長度：513bp*類型：核苷酸*鏈型：單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：直鏈(b)分子類型：cDNA(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來源：人工設(shè)計(jì)實(shí)施例2采用上述實(shí)施例的體外檢測試劑盒進(jìn)行體外檢測：(1)采取人體靜脈血4mL于EDTA或肝素鈉抗凝管中，再加入4mL淋巴細(xì)胞分離液混合，4℃2500rpm離心10min，分離淋巴細(xì)胞，分離后用生理鹽水洗滌3次，每次4℃、1500rpm離心10min，最后一次離心后的細(xì)胞用生理鹽水重懸，細(xì)胞破碎儀破碎處理后4℃2500rpm離心10min，吸取上清備用。(2)取出R1試劑、R2試劑放置室溫下至溫度平衡；(3)將R1、R2試劑和SSAT標(biāo)準(zhǔn)品放在生化分析儀相應(yīng)的位置，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1和參見圖1)；表1濃度(μg/mL)05101520反應(yīng)度(第一次)0.00450.01190.02380.04110.0758反應(yīng)度(第二次)0.00260.01100.02460.04260.0751平均值0.00360.01150.02420.04190.0755(4)通過全自動生化分析儀檢測SSAT質(zhì)控品，設(shè)置加入R1試劑150μL，R2試劑150μL，加入樣本5μL，第22點(diǎn)作為第一點(diǎn)檢測，第45點(diǎn)為第二點(diǎn)檢測，以兩點(diǎn)差值為檢測值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸，確定檢測結(jié)果有效性(參見表2)；表2(5)用全自動生化分析儀檢測SSAT樣本，設(shè)置加入R1試劑150μL，R2試劑150μL，加入樣本5μL，第22點(diǎn)作為第一點(diǎn)檢測，第45點(diǎn)為第二點(diǎn)檢測，以兩點(diǎn)差值為檢測值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸得出最終結(jié)果；(6)檢測SSAT樣本檢測結(jié)果如下表3所示表3從表3可以看出，本方法檢測樣本的SSAT含量于理論值的相差不大，相對偏差不超過±10％。其它未舉例的試劑盒成分的制備方法，在上述制備方法的指引下能很容易地實(shí)現(xiàn)，此處不再冗述。應(yīng)當(dāng)理解的是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明的權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可以做出替換、簡單組合等多種變行，本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3