本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，具體是一種志賀氏菌含量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

志賀氏菌屬（Shigella）細(xì)菌通稱痢疾桿菌，在引發(fā)我國(guó)感染性腹瀉病的各原菌所占比例中居首位，是一類具有高度感染性和危害嚴(yán)重的革蘭氏陰性腸道致病菌。每年全球有1.6億人因此菌感染患病，約有110萬人死亡，絕大多數(shù)為5歲以下兒童。由于生活污水中含有許多病原微生物，例如來自腸道的細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、寄生蟲等，這些微生物絕大部分都將隨污水處理進(jìn)入剩余污泥，在污泥的農(nóng)業(yè)土地利用過程中，通過污染地表水、地下水、形成氣溶膠等多種途徑而擴(kuò)散到環(huán)境中。這些隨污泥進(jìn)入環(huán)境中的病原微生物對(duì)人體健康和環(huán)境安全造成了巨大的潛在威脅，因此，準(zhǔn)確快速地檢測(cè)污泥中的志賀氏菌，對(duì)防止志賀氏菌傳播擴(kuò)散具有十分重要的意義。志賀氏菌的檢測(cè)通常采用食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB4789.5–2003），即利用鑒別培養(yǎng)基結(jié)合生理生化鑒定。但這種方法應(yīng)用于污泥樣品檢測(cè)時(shí)，一方面由于污泥組成復(fù)雜、含有大量微生物而對(duì)檢測(cè)的靈敏度產(chǎn)生干擾，另一方面存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、漏檢率高、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種志賀氏菌含量檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種志賀氏菌含量檢測(cè)方法，包括如下步驟：（1）取含志賀氏菌的待檢樣品，提取基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5-10min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經(jīng)過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個(gè)稀釋梯度，設(shè)5-7個(gè)稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個(gè)稀釋度設(shè)3-5個(gè)重復(fù)樣，于37℃培養(yǎng)18-24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養(yǎng)，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養(yǎng)：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志賀氏菌增菌肉湯中，37℃培養(yǎng)18-24h；（3）DNA提?。阂迫〔襟E（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反復(fù)凍融3次，然后10000g離心3min取上清液，完成DNA提??；提取后的DNA短時(shí)間內(nèi)4℃保存，長(zhǎng)時(shí)間-20℃保存；（4）建立志賀氏菌的實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增25μL反應(yīng)體系：RNA/DNA組合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用滅菌DEPC水補(bǔ)足體系；所述SYBERGreenⅡ?yàn)?00倍稀釋；將DNA模板、組合引物、Blocker及反應(yīng)緩沖液的混合液經(jīng)99℃，90s處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上58℃反應(yīng)40min，反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)；（5）檢測(cè)分析：分析檢測(cè)數(shù)據(jù)。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述引物選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成為RNA序列，3’端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修飾，中間隨機(jī)加上五個(gè)XNA修飾。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：步驟（1）所述提取DNA方法采用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結(jié)合商業(yè)化試劑盒法。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明方法能克服傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測(cè)方法存在的檢測(cè)周期長(zhǎng)、步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，使檢測(cè)時(shí)間大大縮短到2-3天，操作步驟和勞動(dòng)強(qiáng)度也大為縮減，達(dá)到省時(shí)省力、快速靈敏的要求。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

本發(fā)明實(shí)施例中，一種志賀氏菌含量檢測(cè)方法，包括如下步驟：（1）取含志賀氏菌的待檢樣品，提取基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5-10min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經(jīng)過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個(gè)稀釋梯度，設(shè)5-7個(gè)稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個(gè)稀釋度設(shè)3-5個(gè)重復(fù)樣，于37℃培養(yǎng)18-24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養(yǎng)，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養(yǎng)：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志賀氏菌增菌肉湯中，37℃培養(yǎng)18-24h；（3）DNA提?。阂迫〔襟E（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反復(fù)凍融3次，然后10000g離心3min取上清液，完成DNA提??；提取后的DNA短時(shí)間內(nèi)4℃保存，長(zhǎng)時(shí)間-20℃保存；（4）建立志賀氏菌的實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增25μL反應(yīng)體系：RNA/DNA組合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用滅菌DEPC水補(bǔ)足體系；所述SYBERGreenⅡ?yàn)?00倍稀釋；將DNA模板、組合引物、Blocker及反應(yīng)緩沖液的混合液經(jīng)99℃，90s處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上58℃反應(yīng)40min，反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)；（5）檢測(cè)分析：分析檢測(cè)數(shù)據(jù)。所述引物選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成為RNA序列，3’端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修飾，中間隨機(jī)加上五個(gè)XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。步驟（1）所述提取DNA方法采用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結(jié)合商業(yè)化試劑盒法。

實(shí)施例1：

本發(fā)明志賀氏菌含量檢測(cè)方法，包括如下步驟：（1）取含志賀氏菌的待檢樣品，提取基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經(jīng)過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個(gè)稀釋梯度，設(shè)5-7個(gè)稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)樣，于37℃培養(yǎng)18-24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養(yǎng)，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養(yǎng)：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志賀氏菌增菌肉湯中，37℃培養(yǎng)18h；（3）DNA提?。阂迫〔襟E（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反復(fù)凍融3次，然后10000g離心3min取上清液，完成DNA提??；提取后的DNA短時(shí)間內(nèi)4℃保存，長(zhǎng)時(shí)間-20℃保存；（4）建立志賀氏菌的實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增25μL反應(yīng)體系：RNA/DNA組合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用滅菌DEPC水補(bǔ)足體系；所述SYBERGreenⅡ?yàn)?00倍稀釋；將DNA模板、組合引物、Blocker及反應(yīng)緩沖液的混合液經(jīng)99℃，90s處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上58℃反應(yīng)40min，反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)；（5）檢測(cè)分析：分析檢測(cè)數(shù)據(jù)。所述引物選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成為RNA序列，3’端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修飾，中間隨機(jī)加上五個(gè)XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。步驟（1）所述提取DNA方法采用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結(jié)合商業(yè)化試劑盒法。

實(shí)施例2：

本發(fā)明志賀氏菌含量檢測(cè)方法，包括如下步驟：（1）取含志賀氏菌的待檢樣品，提取基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩10min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經(jīng)過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個(gè)稀釋梯度，設(shè)7個(gè)稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個(gè)稀釋度設(shè)5個(gè)重復(fù)樣，于37℃培養(yǎng)24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養(yǎng)，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養(yǎng)：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志賀氏菌增菌肉湯中，37℃培養(yǎng)24h；（3）DNA提?。阂迫〔襟E（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反復(fù)凍融3次，然后10000g離心3min取上清液，完成DNA提??；提取后的DNA短時(shí)間內(nèi)4℃保存，長(zhǎng)時(shí)間-20℃保存；（4）建立志賀氏菌的實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增25μL反應(yīng)體系：RNA/DNA組合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用滅菌DEPC水補(bǔ)足體系；所述SYBERGreenⅡ?yàn)?00倍稀釋；將DNA模板、組合引物、Blocker及反應(yīng)緩沖液的混合液經(jīng)99℃，90s處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上58℃反應(yīng)40min，反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)；（5）檢測(cè)分析：分析檢測(cè)數(shù)據(jù)。所述引物選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成為RNA序列，3’端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修飾，中間隨機(jī)加上五個(gè)XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。步驟（1）所述提取DNA方法采用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結(jié)合商業(yè)化試劑盒法。

實(shí)施例3：

本發(fā)明志賀氏菌含量檢測(cè)方法，包括如下步驟：（1）取含志賀氏菌的待檢樣品，提取基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩8min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經(jīng)過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個(gè)稀釋梯度，設(shè)6個(gè)稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個(gè)稀釋度設(shè)3-5個(gè)重復(fù)樣，于37℃培養(yǎng)20h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養(yǎng)，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養(yǎng)：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志賀氏菌增菌肉湯中，37℃培養(yǎng)20h；（3）DNA提?。阂迫〔襟E（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反復(fù)凍融3次，然后10000g離心3min取上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短時(shí)間內(nèi)4℃保存，長(zhǎng)時(shí)間-20℃保存；（4）建立志賀氏菌的實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增25μL反應(yīng)體系：RNA/DNA組合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用滅菌DEPC水補(bǔ)足體系；所述SYBERGreenⅡ?yàn)?00倍稀釋；將DNA模板、組合引物、Blocker及反應(yīng)緩沖液的混合液經(jīng)99℃，90s處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上58℃反應(yīng)40min，反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)；（5）檢測(cè)分析：分析檢測(cè)數(shù)據(jù)。所述引物選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成為RNA序列，3’端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修飾，中間隨機(jī)加上五個(gè)XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。步驟（1）所述提取DNA方法采用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結(jié)合商業(yè)化試劑盒法。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。