本發(fā)明涉及一種基于二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)α和β地中海貧血點(diǎn)突變的方法及試劑盒，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
地中海貧血( thalassemia)，即珠蛋白生成障礙性貧血，是一組由珠蛋白基因缺失或點(diǎn)突變致使珠蛋白肽鏈合成部分或完全抑制的遺傳性溶血性貧血疾病。臨床表現(xiàn)根據(jù)病情嚴(yán)重程度不同而有所差異，患者主要以貧血、黃疸、肝脾腫大為突出表現(xiàn)。珠蛋白肽鏈分為α、β、γ、δ 種，而地中海貧血主要有 α、 β、 δβ、 δ 四種類型，以前兩種( α、 β 地中海貧血) 最常見。在我國(guó)廣西地區(qū)人群中總的攜帶率高達(dá)24.5%。此病目前缺乏有效治療手段，應(yīng)用相應(yīng)分柝技術(shù)通過人群篩查及產(chǎn)前診斷阻止重癥患兒出生是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的首選預(yù)防措施。
在我國(guó)南方地區(qū)主要以α缺失型突變?yōu)橹?，但是點(diǎn)突變也占有很大比率，在廣西人群攜帶率高達(dá)9.64%，且不同的點(diǎn)突變對(duì)應(yīng)的表型存在明顯的差異。然而目前世界上已經(jīng)報(bào)道的α基因非缺失突變超過200種，β基因超過500種類型。但是目前針對(duì)非缺失型地中海貧血的分子診斷的PCR-反向斑點(diǎn)雜交法，其檢測(cè)范圍十分有限，包括我國(guó)常見的17種β點(diǎn)突變以及3種α點(diǎn)突突（αWS、αQS、αCS），極有可能造成漏診，導(dǎo)致重癥患兒出生。因此，現(xiàn)在迫切的需要一種方法對(duì)多種點(diǎn)突變進(jìn)行快速檢測(cè)。
檢索到以下關(guān)于地中海貧血基因點(diǎn)突變的檢測(cè)方法的專利：
1、中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)枺?01310528510.1；申請(qǐng)人：蘇州發(fā)士達(dá)生物科技有限公司；發(fā)明名稱：一種用于 β- 地中海貧血 β17(A →T) 點(diǎn)突變的檢測(cè)試劑盒及 ARMS-QPCR 檢測(cè)方法；摘要：本發(fā)明公開了一種用于 β-地中海貧血β17(A →T) 點(diǎn)突變的檢測(cè)試劑盒及 ARMS-QPCR檢測(cè)方法，其特征在于：檢測(cè)試劑盒包括 PCR 反應(yīng)液Ⅰ、PCR 反應(yīng)液Ⅱ、混合酶液、DNA 提取液、陰性對(duì)照液和陽性對(duì)照品；ARMS-QPCR 檢測(cè)方法包括樣品采集、ARMS 引物設(shè)計(jì)、樣品處理等步驟。本發(fā)明提供的一種用于 β- 地中海貧血 β17(A →T)點(diǎn)突變的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)待檢 β- 地中海貧血β17(A → T) 點(diǎn)突變的 DNA 樣品時(shí)，只需 3 小時(shí)即可完成檢測(cè)，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法檢測(cè) β- 地中海貧血 β17(A→T) 點(diǎn)突變基因特異性較強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高，方法簡(jiǎn)單，誤差小，準(zhǔn)確度高。
2、中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)枺?201410510185.0；申請(qǐng)人：廣東省婦幼保健院；發(fā)明名稱：一組基于鎖核酸增敏的液相芯片檢測(cè)地中海貧血基因點(diǎn)突變的探針、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法；摘要：本發(fā)明公開一組基于鎖核酸增敏的液相芯片檢測(cè)地中海貧血基因點(diǎn)突變的探針、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明利用鎖核酸能靈活修飾探針的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出用于檢測(cè)地中海貧血基因點(diǎn)突變的探針，這些探針分別與不同編碼的微珠進(jìn)行耦聯(lián)；然后設(shè)計(jì)本發(fā)明的特異性引物對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增得到 PCR 產(chǎn)物，將其與耦聯(lián)有探針的微珠進(jìn)行雜交，再用熒光標(biāo)記試劑進(jìn)行熒光標(biāo)記，最后通過液相芯片檢測(cè)儀進(jìn)行突變位點(diǎn)的檢測(cè)。本發(fā)明基于 LNA 增敏的探針較常規(guī)的探針長(zhǎng)度縮短，但仍能保持較高的 Tm 值，使得完全匹配的探針和錯(cuò)配的探針雜交信號(hào)比值從原來的不到 2 倍提高到超過 4 倍以上的差異，因而容易區(qū)分。
3、中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)枺?01510900715.7；申請(qǐng)人：海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；發(fā)明名稱：HBB 基因突變和 HLA 分型檢測(cè)試劑盒；摘要：本發(fā)明提供了一種基于高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)HBB 基因突變和 HLA 分型的方法及相應(yīng)的試劑盒。其中，所用的引物組合物包括特異性擴(kuò)增人類胚胎 β- 地中海貧血 HBB 基因上下游 1Mb 范圍內(nèi)緊密連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）的引物和特異性擴(kuò)增人類白細(xì)胞抗原系統(tǒng) HLA-A 基因上游、HLA-A 基因與 HLA-B 基因之間、HLA-B 基因與 HLA-DRA 基因之間、HLA-DRA 基因與 HLA-DQB1 基因之間以及HLA-DQB1 基因下游范圍內(nèi)緊密連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）的引物。本發(fā)明的方法具有通用性、多位點(diǎn) SNP 測(cè)序、高通量、成本低、高靈敏度、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
雖然本發(fā)明與上述三份專利檢測(cè)的內(nèi)容相似，但是跟本發(fā)明相比，前者檢測(cè)范圍更廣；并且檢測(cè)PCR擴(kuò)增所用的引物序列也不一樣；檢測(cè)所用儀器也不一同，本發(fā)明用的是第二代測(cè)序儀。第二代測(cè)序技術(shù)是一種突破性技術(shù)，能同時(shí)快速地對(duì)多條DNA片段進(jìn)行測(cè)序，支持研究人員同時(shí)對(duì)多種突變進(jìn)行分析。其技術(shù)原理是在不同的DNA片段兩端連接特異的序列構(gòu)建測(cè)序所需的DNA文庫，通過雜交和橋式PCR將DNA固定到芯片，再通過邊合成邊測(cè)序技術(shù)讀取DNA堿基信息。利用數(shù)據(jù)分析軟件快速發(fā)現(xiàn)文庫DNA上的各種突變。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種操作步驟簡(jiǎn)單，且檢測(cè)特導(dǎo)性高，檢測(cè)范圍廣的能快速針對(duì)α和β地中海貧血點(diǎn)突變的檢測(cè)方法。本發(fā)明還提供檢測(cè)α和β地中海貧血點(diǎn)突變的試劑盒。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
第一方面，本發(fā)明提供一種基于二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)α和β地中海貧血點(diǎn)突變的方法，其中包括針對(duì)檢測(cè)α和β地中海貧血點(diǎn)突變檢測(cè)用的PCR擴(kuò)增引物序列SEQ ID NO1-17和5’端PCR標(biāo)記引物序列SEQ ID NO18-115以及3’端PCR標(biāo)記引物序列SEQIDNO116-213。
優(yōu)選地，所述的檢測(cè)方法還包括檢測(cè)范圍，所述檢測(cè)范圍為α和β地中海貧血累及的HBA1和HBA2以及HBB三個(gè)基因的外顯子、調(diào)控和轉(zhuǎn)錄區(qū)間上的點(diǎn)突變。
第二方面，本發(fā)明還涉及基于二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)α和β地中海貧血點(diǎn)突變的方法，具體步驟如下：
（1）、構(gòu)建第二代測(cè)序文庫；
（2）、第二代測(cè)序文庫純化；
（3）、第二代測(cè)序儀測(cè)序；
（4）、生物信息學(xué)分析，獲得結(jié)果。
所述的步驟（1）構(gòu)建第二代測(cè)序文庫，包括1）、準(zhǔn)備樣品DNA；2）、準(zhǔn)備引物和3）、多重PCR構(gòu)建測(cè)序文庫；其中，PCR 檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性5min；然后95℃變性45s，60℃退火1.5min，72℃延伸1min擴(kuò)增20循環(huán)。
第三方面，本發(fā)明涉及一種基于二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)α和β地中海貧血點(diǎn)突變的試劑盒，所述的試劑盒包括上述所述的引物序列。
優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括第二代測(cè)序儀，所述測(cè)序儀為solexa測(cè)序儀。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是：
1、檢測(cè)范圍廣、靈敏度高，本發(fā)明PCR擴(kuò)增區(qū)間覆蓋HBA1和HBA2以及HBB三個(gè)基因的外顯子、調(diào)控和轉(zhuǎn)錄區(qū)間，基于第二代測(cè)序技術(shù)可對(duì)Clinvar數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）關(guān)于HBB、HBA1和HBA2三個(gè)基因已報(bào)道801個(gè)點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)區(qū)間內(nèi)未報(bào)道過罕見突變，然而DNA起始量?jī)H需5μg；
2、操作簡(jiǎn)單，ilumina 標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增子文庫構(gòu)建的試劑盒需要末端修復(fù)、3’端加A、接頭鏈接、PCR擴(kuò)增四個(gè)步驟而每步都需要純化，而本發(fā)明只需一次PCR擴(kuò)增和一次純化就可完成文庫構(gòu)建；
3、通量高，基于高通量測(cè)序技術(shù)，通過在每個(gè)樣品上加上不同的標(biāo)簽序列，可以一次地對(duì)大量樣品進(jìn)行分析。本發(fā)明設(shè)計(jì)5’端和3’端特異標(biāo)簽序列各96種，能同時(shí)進(jìn)行96×96個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)；
4、檢測(cè)靈敏度高、特異性高，本發(fā)明DNA起始量?jī)H需5μg，即可完成超過801種點(diǎn)突變檢測(cè)，基于二代測(cè)序技術(shù)，可能擴(kuò)增序列進(jìn)行特異識(shí)別，檢測(cè)特異性極高；
5、成本低，本發(fā)明建庫方法簡(jiǎn)單，而且隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和測(cè)序成本的不斷降低，以及一次對(duì)大量樣品進(jìn)行分析，檢測(cè)成本也在不段下降；
6、結(jié)果分析簡(jiǎn)單，本發(fā)明通過生物信息分析，結(jié)果直接生成文本格式，便于自動(dòng)化操作。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解為：這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如：sambrook等分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)見New York Cold Spring Harbor Laboratory 出版社1989年版中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1
本實(shí)施例的寡核苷酸引物序列由英濰捷基公司生產(chǎn)。
（1）、構(gòu)建第二代測(cè)序文庫：
1）、準(zhǔn)備樣品DNA，用常規(guī)方法提取全基因組DNA；
2）、準(zhǔn)備引物：將合成的引物序列加TE溶液稀釋到10uM。將點(diǎn)突變引物序列按下體系混合成MIX：
3）、多重PCR構(gòu)建測(cè)序文庫：在PCR體系中，加入2ulDNA、25ul2×Multiplex PCR Buffer和0.25ulMultiplex PCR Enzyme Mix(TAKARA Multiplex PCR Assay Kit Ver.2)，以及2ul點(diǎn)突變的PCR擴(kuò)增引物MIX和5’端和3’端特異標(biāo)記引物各1ul，最后加去離子水至50ul進(jìn)行PCR反應(yīng)，預(yù)變性5min；然后95℃變性45s，60℃退火1.5min，72℃延伸1min擴(kuò)增20循環(huán)。
（2）、第二代測(cè)序文庫純化：向50ulPCR產(chǎn)物中，加入35ul貝克曼磁珠，移入1.5mlPE管，漩渦振蕩混勻，室溫靜止5min后，移入磁力架，待液體澄清后，除去上清，加入70%酒精500ul，靜置1min后移險(xiǎn)上清，再加入500ul 70%的酒精，1min后移除。室溫干燥5min，待酒精揮發(fā)后，將標(biāo)本移下磁力架后，加入27ul TB溶液，充分混勻后，靜置3min。再次振蕩混勻，再靜置3min后，將標(biāo)本上磁力架，待澄清后，取25ul上清保存。
（3）、第二代測(cè)序儀測(cè)序：本實(shí)施例利用illumina MiSeq Reagent Kit(300 cycles PE)試劑盒測(cè)序，將200個(gè)標(biāo)本等量混合后，文庫混合液稀釋到12pmol/ul，并使其變性，制備所需的預(yù)填充試劑盒，將文庫混合液裝到指定槽的試劑盒中，設(shè)置實(shí)驗(yàn)步驟并檢查各運(yùn)行參數(shù)，選擇Sequence開始運(yùn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后查看測(cè)序結(jié)果。
（4）、生物信息學(xué)分析，獲得結(jié)果；首先對(duì)新一代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括剪除3'端質(zhì)量值低于20的序列、去除平均質(zhì)量值低于20的序列；然后使用bwa將質(zhì)控后的序列比對(duì)到參考基因組序列上(版本號(hào)hg19)，利用GATK工具判讀SNP和Indel位點(diǎn)；利用SNPnexus工具注釋SNP，找到可能性的功能性位點(diǎn)，最后利用dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫、HGMD等數(shù)據(jù)庫、clinvar數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋和比較，從而檢測(cè)后α和β地中海貧血點(diǎn)突變。本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度，范圍廣。
序列表
<110> 廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院
<120>基于二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)α和β地中海貧血點(diǎn)突變的方法及試劑盒
<160> 213
<170> PatentIn version 3.5
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<223> 人工序列
<400> 203
caagcagaag acggcatacg agatgttggc ggtctcgtgg gctcgg 46
<210> 204
<211> 46
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列
<400> 204
caagcagaag acggcatacg agatttgaat tgtctcgtgg gctcgg 46
<210> 205
<211> 46
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列
<400> 205
caagcagaag acggcatacg agatccagcc ggtctcgtgg gctcgg 46
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<211> 46
<212> DNA
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caagcagaag acggcatacg agatattaga cgtctcgtgg gctcgg 46
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> 人工序列
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caagcagaag acggcatacg agatatacca tgtctcgtgg gctcgg 46