本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體為唾液抗線粒體抗體M2型的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，旨在建立一種快速、無創(chuàng)檢測人體內(nèi)AMA-M2水平的技術(shù)。

背景技術(shù)：

酶聯(lián)免疫吸附實驗法(ELISA)是分析化學(xué)領(lǐng)域中較為成熟的技術(shù)之一，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種免疫測定技術(shù)。該技術(shù)采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。測量時，抗原(抗體)先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體(抗原)與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物(標(biāo)記物)，此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原(抗體)反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比。這種有色產(chǎn)物可用酶標(biāo)儀加以測定。其方法簡單，方便迅速，特異性強，敏感度高，易于推廣。

PBC是一種自身免疫性肝病，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)小膽管的進(jìn)行性破壞，最終導(dǎo)致肝硬化，甚至肝衰竭，嚴(yán)重危害人類健康。因PBC發(fā)病隱匿，疾病的早期篩查、早期發(fā)現(xiàn)和早期處理，對PBC的治療和病人的預(yù)后十分重要?？咕€粒體抗體(AMA)，特別是抗線粒體抗體M2型(AMA-M2)，是PBC的特異性血清學(xué)標(biāo)志，其特異度和靈敏度都高達(dá)95％以上，是目前臨床用于診斷PBC的重要指標(biāo)?，F(xiàn)有的血液檢測技術(shù)雖十分成熟，但其自身有一定的局限性：1、首先血液的獲取是一種有創(chuàng)的手段，樣本的獲取需要有專業(yè)的技術(shù)；2、血液獲取過程中，受試者易產(chǎn)生不適感和一定感染風(fēng)險；3、血液樣本的獲取和處理成本較高。正因為這些缺陷的存在，血液檢測并不利于原發(fā)性膽汁性肝硬化的大規(guī)模篩查，尋找一種無創(chuàng)便捷的介質(zhì)進(jìn)行AMA-M2檢測是十分必要的。

唾液是一種無色且稀薄的液體，唾液中含有電解質(zhì)，蛋白質(zhì)，酶，細(xì)胞因子等成分。唾液主要由唾液腺分泌，而外周血中的成分可以通過被動擴散，主動運輸，超濾等方式進(jìn)入唾液。因此，唾液可以在一定程度上反映外周血的情況，而且唾液的獲取具有無創(chuàng)，易獲得，技術(shù)要求低，成本低等諸多優(yōu)勢，是一種理想的血清替代品。目前，用于檢測AMA-M2局限于血液途徑，利用唾液進(jìn)行AMA-M2檢測的試劑盒和方法還沒出現(xiàn)。本發(fā)明主要是利用改良的AMA-M2檢測試劑盒進(jìn)行唾液中AMA-M2檢測的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種唾液抗線粒體抗體M2型的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。

為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：

提供一種唾液抗線粒體抗體M2型的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，該試劑盒中包括下述組分：

AMA-M2標(biāo)準(zhǔn)品；

M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；

酶標(biāo)二抗：辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗人IgG；

樣本稀釋液：質(zhì)量濃度0.1％的BSA-PBS溶液；

輔助試劑：底物顯色液、反應(yīng)終止液和清洗緩沖液。

本發(fā)明中，所述樣本稀釋液的配制方法為：取牛血清白蛋白1g，加入pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖溶液1L，充分溶解。

本發(fā)明中，所述底物顯色液為TMB/H₂O₂，是通過下述方法配制獲得：

(1)配制底物顯色液A：

取四甲基聯(lián)苯胺(TMB)20mg、DMSO 2ml、EDTA-Na 20mg、檸檬酸95mg、甘油5ml，以ddH₂O定容至50ml后混勻，避光保存；

(2)配制底物顯色液B：

取醋酸鈉1.36g、檸檬酸0.16g、30％過氧化氫(H₂O₂)30ul，以ddH₂O定容至50ml后混勻；

(3)使用前，將底物顯色液A、B液等體積混勻，即得底物顯色液TMB/H₂O₂。

本發(fā)明中，所述反應(yīng)終止液為：0.5M硫酸。

本發(fā)明中，所述清洗緩沖液是質(zhì)量濃度0.05％的Tween20-PBS溶液；其配制方法為：取吐溫20500ul，加入pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖溶液1L，充分溶解。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)將獲取的唾液樣本離心后吸取上清，用0.1％BSA-PBS溶液按1∶40的體積比稀釋；

(2)用0.1％BSA-PBS溶液稀釋AMA-M2標(biāo)準(zhǔn)品為8個梯度：AMA-M2含量分別為：1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml；第8個(0RU/ml)設(shè)為空白對照孔，直接采用樣本稀釋液；

(3)在M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分別加入100ul稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，室溫孵育30分鐘；棄去孔中液體，每孔加300ul配好洗液，60秒后將微孔板中液體倒出，并在吸水紙上拍打去除殘留液體，重復(fù)清洗3次；

(4)每孔加入100ul酶標(biāo)二抗，室溫孵育30分鐘后，棄去孔中液體，清洗3次；

(5)每孔加入100ul顯色液，室溫孵育15分鐘，再以加顯色液的相同順序加入100ul終止液終止反應(yīng)；

(6)用酶標(biāo)儀在450nm波長讀取OD值，以450nm平均吸光值為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣本中AMA-M2濃度。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)效果在于：

本發(fā)明所用試劑盒使用更為簡便，能夠直接檢測體檢者唾液中的AMA-M2表達(dá)水平，是一種無創(chuàng)的檢測手段，解決了血液途徑檢測存在的不足。本發(fā)明能夠更加安全、方便、快捷地應(yīng)用于PBC的篩查，輔助PBC的診斷，為后期疾病的治療和改善患者預(yù)后提供數(shù)據(jù)支持。

附圖說明

圖1為改良的ELISA試劑盒檢測健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖2為改良的ELISA試劑盒檢測健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表達(dá)水平圖；

圖3為改良的ELISA試劑盒檢測健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表達(dá)水平ROC曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。

統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件分析，各樣本均數(shù)的比較采用t檢驗分析，樣本之間相關(guān)性分析采用pearson相關(guān)分析。

唾液樣本采集管均購自BD公司，離心管和離心機購自Thermo公司，牛血清白蛋白(BSA)購自Amresco公司，酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司。AMA-M2標(biāo)準(zhǔn)品、M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板和酶標(biāo)二抗均可通過正常的商業(yè)渠道獲得。

實施例1

試劑盒靈敏度考察：

A：將AMA-M2標(biāo)準(zhǔn)品用樣本稀釋液(0.1％BSA-PBS溶液)倍比稀釋(1∶2體積比)成8個梯度，使AMA-M2含量分別為：

1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml的標(biāo)準(zhǔn)品；其中第8個(0RU/ml)設(shè)為空白對照孔，直接為樣本稀釋液。

B：抗原-抗體反應(yīng)，在所述M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分別加入100ul稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品兩列，各設(shè)1復(fù)空)，室溫孵育30分鐘后，棄去孔中液體，每孔加300ul配好洗液，60秒后將微孔板中液體倒出，并在吸水紙上拍打去除殘留液體，重復(fù)清洗3次。

C：每孔加入100ul所述酶標(biāo)二抗，室溫孵育30分鐘后，棄去孔中液體，清洗3次，方法同上。

D：顯色反應(yīng)：每孔加入100ul底物顯色液，室溫孵育約15分鐘，再以加底物顯色液相同順序加入反應(yīng)終止液(0.5M硫酸)結(jié)束反應(yīng)。

E：比色：酶標(biāo)儀450nm波長讀取OD值并記錄。

F：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：以450nm平均OD值為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)R2，當(dāng)R2＞0.99時本次測定有效。

計算AMA-M2標(biāo)準(zhǔn)品與空白對照的比值，當(dāng)比值大于2時，說明試劑盒可以測定該濃度的AMA-M2的標(biāo)準(zhǔn)品，最低濃度即為試劑盒的靈敏度，平行試驗五次取平均值，具體結(jié)果如下：

根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品獲得吸光度數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸，得回歸方程為：

y＝0.5241x^1.1382，R²＝0.9984

上述數(shù)據(jù)表明，本試劑盒在0.015625RU/ml濃度下，靈敏度良好。

實施例2

一、利用本發(fā)明所述試劑盒檢測唾液中AMA-M2水平的方法，包括以下步驟：

從參加體檢的人群中獲取唾液樣本。

該步驟具體包括：

A：唾液收集前囑受試者大量清水漱口，漱口完成5分鐘后開始唾液收集。B：囑受試者平躺張嘴，開口器固定，使唾液自然流出并于口底聚集。約60s后用吸引器吸取口中唾液于15ml離心管。重復(fù)多次，得唾液1-3ml。

C：唾液離心，4℃，500g，10min，離心后吸取上清分裝于1.5ml離心管備用。

二、通過酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測唾液中AMA-M2水平

該步驟具體包括：

將離心后的唾液樣本用0.1％BSA-PBS溶液稀釋(1∶40)；

AMA-M2試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品用0.1％BSA-PBS溶液倍比稀釋(1∶2)成8個梯度，其中第8個設(shè)為空白孔，稀釋成AMA-M2含量分別為1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/Ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml的標(biāo)準(zhǔn)品。

在預(yù)先包被有M2抗原的聚苯乙烯ELISA微孔板中分別加入100ul稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品兩列，各設(shè)1復(fù)空)和樣本。室溫孵育30分鐘后，棄去孔中液體，每孔加300ul配好洗液，60秒后將微孔板中液體到處并在吸水紙上拍打去除殘留液體，重復(fù)清洗3次。

每孔加入100ul酶標(biāo)二抗，室溫孵育30分鐘后，棄去孔中液體，清洗3次，方法同上。

每孔加入100ul底物顯色液，室溫孵育約15分鐘，再以加底物顯色液相同順序加入100ul終止液終止反應(yīng)。

酶標(biāo)儀450nm波長讀取OD值，以450nm平均吸光值為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣本中AMA-M2濃度。

該實例中，據(jù)以判斷的數(shù)據(jù)來源是：從2014年9月至2015年12月共收集健康人、PBC患者(臨床已確診)唾液共40例，兩組群體年齡、性別大致匹配，符合PBC的流行病學(xué)特征。實驗證明我們改良后的試劑盒和方法能夠用于檢測唾液中的AMA-M2，實驗比較兩組間唾液中AMA-M2表達(dá)水平后，通過ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)該方法還可應(yīng)用于診斷PBC，并得出其診斷PBC的唾液AMA-M2水平臨界值為0.3965(AUC＝0.8283，95％可信區(qū)間0.6937～0.9628，敏感度83.33％，特異度77.27％)，高于臨界值則視為患原發(fā)性膽汁性肝硬化可能。

應(yīng)用實例

該實施采用具體實例1的操作步驟，收集浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科原發(fā)性膽汁性肝硬化患者10例、國際體檢中心健康體檢者10例的唾液樣本。經(jīng)檢測，PBC患者唾液中AMA-M2均高于臨界值0.3965。而健康體檢者唾液中AMA-M2均低于臨界值0.3965。

基于該分析結(jié)果，本發(fā)明的試劑盒可用于檢測唾液AMA-M2，可以對體檢病人是否患有原發(fā)性膽汁性肝硬化進(jìn)行初步篩查，為后續(xù)檢測提供依據(jù)。