專(zhuān)利名稱(chēng)：線粒體肌酸激酶抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床檢查領(lǐng)域，尤其涉及測(cè)定肌酸激酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)CK)同功酶的定量法、測(cè)定中使用的抗體、測(cè)定用試劑以及測(cè)定用試劑的配套。
這些同功酶的電泳遷移率，從陰極一側(cè)開(kāi)始的順序?yàn)閙CK(8倍體)、mCK(2倍體)＝CK-MM、CK-MB、CK-BB。為證明mCK(2倍體)的遷移率與CK-MM相同，在保存血液中電泳狀態(tài)下把其作為CK-MM來(lái)測(cè)定。其他不是同功酶的還有免疫球蛋白結(jié)合生成的大CK。這些都可以用遷移率從酶電泳相中確認(rèn)。
CK、CK同功酶的定量在臨床檢查方面廣泛應(yīng)用。其中CK-MB作為心肌梗塞的標(biāo)記非常重要。CK-MB的定量可用EIA法、免疫阻遏法、電泳法來(lái)實(shí)施。EIA法能高效測(cè)定CK-MB，但需要專(zhuān)用機(jī)器，速度較低。電泳法操作煩瑣，需要熟練技藝，得出結(jié)果前，需要用密度計(jì)測(cè)出CK-MB的存在比率，也有速度缺陷。免疫阻遏法能用自動(dòng)分析裝置迅速簡(jiǎn)便的測(cè)定，但在測(cè)定特異性方面有缺陷。
但是為了早期診斷急性心肌梗塞，廣泛使用了能夠迅速簡(jiǎn)便的測(cè)定免疫阻遏法。這種方法用針對(duì)CK-M輔助單元的特異抗體(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“抗CK-M抗體”)使CK-M輔助單元失去活性，然后測(cè)定CK-B輔助單元的活性。用此法，同時(shí)也測(cè)定了CK-MB以外的CK-BB和mCK(2倍體+8倍體)。其中的CK-BB在血中基本不存在，可以忽略，而且CK-BB脫離的疾病有腦挫傷、多臟器不全，但這類(lèi)離子并不多。但是，mCK在健康人的血清中具有和CK-MB基本相同的活性量，并且肝病等細(xì)胞壞死、惡性腫瘤等也混亂了mCK脫離所引起的結(jié)果的判定。最近，由軸狀病毒引起的腸炎、新生兒假死等疾病中mCK脫離事件被報(bào)道出來(lái)。(星野忠，臨床病理，46，總會(huì)號(hào)，57，(1998)、金光房江，臨床病理，46，總會(huì)號(hào)，56，1998)。另外還報(bào)道了由于mCK的存在，使酶阻遏法測(cè)出的CK-MB測(cè)定值受到影響。(第22次千葉臨床衛(wèi)生檢查學(xué)會(huì)抄錄6-7，平成13年2月開(kāi)幕)。因此，報(bào)道了一種更準(zhǔn)確的測(cè)定CK-MB的方法，方法為制造針對(duì)mCK活性的特異抗體(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“抗mCK抗體”)，而且針對(duì)CK同功酶，使抗CK-M抗體之外的抗mCK起作用來(lái)阻遏CK-M輔助單元活性和mCK活性。
據(jù)報(bào)道，mCK中有遍在(ubiquitous)型mCK(umCK)和肌節(jié)(sarcomeric)型mCK(smCK)的同步形態(tài)。從mCK的基因分析得出人的mCK和CK-M以及CK-B之間的氨基酸排列的相同性有62-66％，umCK和smCK之間具有80％的相同性，(J.Biol.Chem，265，6921-6927.1998)。此外，把umCK和smCK分離調(diào)查各自性狀的結(jié)果是umCK和smCK分別形成2倍體和8倍體，pI略有不同，8倍體中在各個(gè)抗原性方面沒(méi)有的差別，2倍體被識(shí)別出來(lái)。(金光房江，臨床病理，47，總會(huì)號(hào)，306，1999)。
mCK的脫離與疾病的關(guān)系如上所述，已有許多報(bào)道。但是mCK的測(cè)定一般采取瓊脂糖凝膠泳動(dòng)法，由于umCK和smCK的泳動(dòng)基本一樣，因此兩者被無(wú)區(qū)別的報(bào)道出來(lái)。雖然報(bào)道了具有抗umCK性的抗體(特開(kāi)2002-270公開(kāi)公報(bào))，但沒(méi)有關(guān)于抗umCK抗體的報(bào)告，因此兩者很難區(qū)分開(kāi)來(lái)進(jìn)行解析。
為完成上述課題而進(jìn)行的研究結(jié)果認(rèn)為，由于推測(cè)正常人體mCK同功酶中大多數(shù)是umCK，因此只要得到特異阻遏umCK活性的抗體，就能很容易的對(duì)umCK和smCK進(jìn)行分別測(cè)定。因此，從事此項(xiàng)研究的研究人員們不斷努力，成功的制造了能特異阻遏umCK活性的抗體，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明由以下各項(xiàng)構(gòu)成1.阻遏線粒體肌酸激酶(mCK)同功酶中umCK活性的抗mCK抗體。
2.在1中記述的至少60％阻遏umCK活性的抗體。
3.在肌酸激酶(CK)同功酶的分別定量方面，單獨(dú)或和其他抗mCK的抗體并用時(shí)，實(shí)際上在不影響測(cè)定mCK同功酶以外的CK同功酶的情況下，還能阻遏mCK活性的在1和2中記述的抗體。
4.以單克隆抗體為特征的、在1-3中任一項(xiàng)中記述的抗體。
5.根據(jù)受委托號(hào)FERM P-18760號(hào)，被委托處理的混合體所產(chǎn)生的單克隆抗體。
6.根據(jù)受委托號(hào)FERM P-18760號(hào)，被委托處理的混合體。
7.利用1-5中任一項(xiàng)中記述的抗mCK抗體來(lái)測(cè)定mCK量的免疫測(cè)定法。
8.利用阻遏mCK同功酶中smCK(smCK)活性的抗mCK抗體來(lái)測(cè)定mCK量的免疫測(cè)定法。
9.在7或8中記述的mCK量為umCK量以及/或者smCK量的免疫測(cè)定法。
10.包括用在1-5中任一項(xiàng)中記述的抗體進(jìn)行試劑處理和有選擇地排除mCK活性這兩個(gè)工序的CK同功酶的分別定量法。
11.包括用阻遏smCK活性的抗體單獨(dú)處理、或者用該抗mCK抗體與1-5任一項(xiàng)中記述的抗體合用進(jìn)行處理有選擇地排除mCK活性這兩個(gè)工序的CK同功酶的分別定量法。
12.在抗體處理前測(cè)定試劑中的CK活性，然后把阻遏umCK活性的mCK抗體、阻遏smCK活性的抗mCK抗體、抗CK-M輔助單元抗體中的任一個(gè)或兩個(gè)以上組合起來(lái)處理，以測(cè)定殘存活性為特征的、在10或11中記述的CK同功酶的分別定量法。
13.包括以針對(duì)CK-M輔助單元的抗體進(jìn)行試劑處理、有選擇地排除CK-M活性這兩個(gè)工序的在10-12的任一項(xiàng)中記述的CK同功酶的分別定量法。
14.把以有選擇的排除CK-M活性和mCK活性的處理在同一工序中同時(shí)完成為特征的，在13中記述的CK同功酶的分別定量法。
15.把以有選擇的排除CK-M活性和mCK活性這一處理過(guò)程在兩個(gè)以上的工序中、在不同時(shí)間進(jìn)行為特征的，在13中記述的CK同功酶的分別定量法。
16.先使針對(duì)CK-M輔助單元的抗體起作用，測(cè)定殘存的CK活性，然后使抗umCK抗體以及/或者抗smCK抗體起作用，測(cè)定殘存的CK活性，包括以上工序的在15中記述的CK-MB活性和mCK活性的分別定量法。
17.以把從10-16任一項(xiàng)中記述的CK同功酶的分別定量法中得出的測(cè)定值與全身疾患想關(guān)聯(lián)為特征的CK同功酶的檢查方法。
18.在7-17任一項(xiàng)中記述的CK同功酶活性測(cè)定法中，把必要的測(cè)定用試劑配套化或由單品構(gòu)成的CK同功酶測(cè)定用試劑。
圖2是抗umCK單克隆抗體(UI-1881)的酶活性阻遏能力示意3是抗smCK單克隆抗體(mCKI-578)的酶阻遏能力示意圖。
符號(hào)說(shuō)明-○-umCK酶活性阻遏效果-△-smCK酶活性阻遏效果-◆-CK-MM酶活性阻遏效果-■-CK-BB酶活性阻遏效果本發(fā)明的抗mCK抗體是指阻遏mCK活性的抗體，阻遏smCK活性是指能特異識(shí)別smCK型蛋白質(zhì)并能特異阻遏其酶活性的抗體。同樣，阻遏umCK活性的抗體是指能特異識(shí)別umCK型蛋白質(zhì)并能特異阻遏其酶活性的抗體。在本發(fā)明的CK同功酶的分別定量法中，使用的抗體以實(shí)際上不影響測(cè)定mCK以外的CK同功酶的情況下，還能阻遏mCK活性的抗體為佳。mCK在大多數(shù)情況下，在試劑中含5-20U/L，如能阻遏80％以上的mCK，則可在臨床檢查中使用。阻遏umCK活性的抗體(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“抗umCK抗體”)如單獨(dú)使用，對(duì)mCK的阻遏能力低。但如與阻遏smCK活性的抗體或其他抗體復(fù)合物或與能阻遏mCK的化合物共同使用，實(shí)際上能獲得阻遏80％以上的mCK的效果。本發(fā)明的抗umCK抗體能阻遏80％以上的umCK活性，較理想的是70％以上，更理想的是90％以上。
此外，本發(fā)明的抗體為多克隆抗體或單克隆抗體均可，但單克隆抗體更為理想。
抗體的制作本發(fā)明的抗體，不僅來(lái)源于小鼠，還有白鼠、倉(cāng)鼠、兔、山羊、馬等，最理想的是實(shí)驗(yàn)小鼠。抗體不局限于IgG，也可使用IgM等。
本發(fā)明的抗體可用以往眾所周知的免疫學(xué)手法。比如用作為抗原的umCK蛋白質(zhì)，最好是和佐劑混合在一起對(duì)哺乳類(lèi)進(jìn)行免疫，從免疫后的動(dòng)物血清等中提取。此外，單克隆抗體和產(chǎn)生單克隆抗體的雜交細(xì)胞瘤可通過(guò)使來(lái)源于免疫后的B淋巴球和各種骨髓細(xì)胞相融合的方法制作。具體如下抗體制作中使用的抗原在本發(fā)明中，例如在對(duì)umCK有特異親和性且能阻遏其酶活性的抗體制作中，使用的抗原一般是人或哺乳類(lèi)動(dòng)物的umCK。為提高特異性，使用目的測(cè)定對(duì)象物和種特異抗原為好。
具體為在能得到對(duì)人體umCK有特異親和性且能阻遏其酶活性的抗體的情況下，最好使用人體umCK作為抗原。umCK抗原可從生體組織中精制而成，也可用基因工程學(xué)的手法獲得。市場(chǎng)上出售的抗原，如細(xì)胞生物研究所(Institute of Cell Biology，Swiss Federal Instituteof Techonology(ETH))的產(chǎn)品。
免疫方法把精制umCK蛋白質(zhì)或用以其氨基酸排列為基礎(chǔ)的基因工程學(xué)手法發(fā)現(xiàn)的umCK蛋白質(zhì)或其部分縮氨基在磷酸緩沖液(PBS)等適當(dāng)緩沖液中溶解或懸浮，用這樣制成的液體作為抗原液。把抗原液中抗原物質(zhì)調(diào)制成50-500μg/mL的濃度為好?？s氨基抗原等只用其一種，抗原性低的情況下，可與清蛋白、KLH等適當(dāng)運(yùn)載蛋白質(zhì)聯(lián)合使用。用該抗原進(jìn)行免疫制作的動(dòng)物有實(shí)驗(yàn)小鼠、白鼠、山羊、倉(cāng)鼠、馬、羊、兔等。較理想的是實(shí)驗(yàn)小鼠，最理想的是BALB/C實(shí)驗(yàn)小鼠。
這時(shí)，為提高對(duì)免疫動(dòng)物的抗原應(yīng)答性，可把該抗原溶液與佐劑混合投藥。這里可使用的佐劑有弗羅因德氏完全佐劑(FCA)、弗羅因德氏不完全佐劑、Ribi(MPL)、Ribi(TDM)、Ribi(MPL+TDM)、百日咳疫苗(Boredetella pertussis vaccine)、MDP、鋁佐劑(ALCM)以及它們的混合物。初次免疫時(shí)用FCA，追加免疫時(shí)用FIA或Ribi佐劑，這些混合更為理想。
免疫方法中，根據(jù)使用抗原的種類(lèi)或佐劑是否混合，可對(duì)注射部位、時(shí)間等做適宜調(diào)整。比如，用小鼠作免疫動(dòng)物時(shí)，把佐劑混合抗原液0.05～1ml(抗原物質(zhì)10～200μg)注射到腹腔皮下、肌肉或(尾)靜脈中，從初次免疫開(kāi)始約每4～21天實(shí)行1～4次追加免疫，1～4周后實(shí)行最終免疫。如對(duì)腹腔注射的抗原量很多，那么該抗原溶液可不使用佐劑便可投藥?？贵w價(jià)通過(guò)追加免疫后約5～10天采血進(jìn)行調(diào)查。抗體價(jià)的測(cè)定以下述的化驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，可采用通常方法進(jìn)行。最終免疫后約3～5天，從該免疫動(dòng)物中分離脾細(xì)胞獲得抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
單克隆抗體的制作單克隆抗體(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“MoAb”)用開(kāi)勒和密爾斯特因(Kohierand Milstein，Nature，256，495～495，1995)的方法制成。作為骨髓瘤細(xì)胞的來(lái)源，有實(shí)驗(yàn)小鼠、白鼠、和人。例如圖示實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓瘤、P3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-4、SP2/0-Ag14、P3X63-Ag8·653等株化骨髓瘤細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞中含有產(chǎn)生免疫球蛋白輕鏈的物質(zhì)，把它作為融合對(duì)象，就可以把抗體產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白和這種輕鏈結(jié)合，因此特別適合用于不產(chǎn)生球蛋白的輕鏈的骨髓瘤細(xì)胞如P3X63-Ag8、653、SP2/3-Ag1等?？贵w產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞最好來(lái)源于同種動(dòng)物，尤其是同系統(tǒng)動(dòng)物。骨髓瘤細(xì)胞的保存方法用眾所周知的方法即可。如在添加了馬、兔、或牛胎兒血清的一般培養(yǎng)基中，對(duì)繼代培養(yǎng)的物質(zhì)凍結(jié)保存。另外，在細(xì)胞融合方面，用對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞為好。
使抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合來(lái)制作雜交細(xì)胞瘤的方法有使用聚氧乙烯(PEG)的方法、使用聚甘醇的方法和使用電場(chǎng)融合裝置的方法等。例如用PEG法，在含有約30～60％的PEG(平均分子量1,000～6,000)的適當(dāng)培養(yǎng)基或緩沖液中，使脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞以1～10∶1，最好是5～10∶1的混合比懸浮，溫度25～37℃，pH6～8的條件下使其反應(yīng)約30秒～3分鐘即可。反應(yīng)結(jié)束后，沖洗細(xì)胞，去除PEG溶液在培養(yǎng)基中再懸浮，然后在微量滴定實(shí)驗(yàn)板上播種繼續(xù)培養(yǎng)。
融合操作后的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實(shí)行雜交細(xì)胞瘤的選擇。選擇培養(yǎng)基是能使親細(xì)胞株死亡、只讓融合細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基，通常使用次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基。通常融合操作1-7天后，培養(yǎng)基的一部分，最好是大約一半與選擇培養(yǎng)基進(jìn)行交換，每2～3天以同樣的培養(yǎng)基反復(fù)交換來(lái)培養(yǎng)。通過(guò)顯微鏡觀察可確認(rèn)雜交細(xì)胞瘤的菌落生長(zhǎng)。
為了知道生長(zhǎng)的雜交細(xì)胞瘤是否產(chǎn)生所期望的抗體，采取培養(yǎng)上清，用眾所周知的方法研究抗體效價(jià)。例如，把階段稀釋后的該上清加入固相化抗原蛋白質(zhì)中使其反應(yīng)，然后使用熒光物質(zhì)、酶或放射性同位體(RI)等做過(guò)標(biāo)記的二次抗體(抗球蛋白抗體、抗IgG抗體、抗IgM抗體等)使其再起反應(yīng)，就可測(cè)出該上清中產(chǎn)生的抗體，也可測(cè)定抗體價(jià)。如抗原是酶等，這種酶和該上清起反應(yīng)后，使適當(dāng)?shù)幕|(zhì)起反應(yīng)，根據(jù)是否存在酶阻遏活性，檢測(cè)出抗體且測(cè)定出抗體價(jià)。這樣，對(duì)各洞穴中的培養(yǎng)上清進(jìn)行甄別，得到產(chǎn)生適當(dāng)抗體的雜交細(xì)胞瘤。
此外，用界限稀釋法、軟寒天法、利用熒光激起細(xì)胞分類(lèi)器法等可分離出單一純系。例如，界限稀釋法為使雜交細(xì)胞瘤的菌落分離成單個(gè)細(xì)胞/洞穴前后，通過(guò)在培養(yǎng)基中階段培養(yǎng)，可使產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交細(xì)胞瘤菌落單離。把活動(dòng)的抗體產(chǎn)生雜交細(xì)胞瘤菌落與10％(v/v)的DMSO或丙三醇等凍結(jié)保護(hù)劑共存的情況下凍結(jié)，在一70～-196℃下保存，可以約半年～半永久保存。細(xì)胞在使用時(shí)，在37℃上下的恒溫槽中急速溶解使用。為了不使凍結(jié)保護(hù)劑的細(xì)胞毒性殘存，要認(rèn)真沖洗后再使用。
為調(diào)查雜交細(xì)胞瘤產(chǎn)生的抗體的免疫球蛋白輔助類(lèi)，可把該雜交細(xì)胞瘤在一般條件下培養(yǎng)，然后用市場(chǎng)上出售的抗體類(lèi)輔助類(lèi)判定用配套品對(duì)在培養(yǎng)上清中分泌出的抗體分析便可查出。
從雜交細(xì)胞瘤中提取MoAb的方法可根據(jù)需要量和雜交細(xì)胞瘤的性狀進(jìn)行適當(dāng)選擇。例如，從移植了該雜交細(xì)胞瘤的小鼠腹水中取得的方法、通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)從培養(yǎng)上清中取得的方法。如果小鼠腹腔內(nèi)有可能增殖的雜交細(xì)胞瘤，就可以從腹水中獲得數(shù)mg/mL的高濃度MoAb。在活體內(nèi)不能增殖的雜交細(xì)胞瘤可從細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)上清中獲取。用細(xì)胞培養(yǎng)獲取MoAb的方法抗體產(chǎn)生量雖比在活體內(nèi)低，但混入的小鼠腹腔內(nèi)的免疫球蛋白和其他雜質(zhì)很少，具有易于精制的優(yōu)點(diǎn)。
從移植了雜交細(xì)胞瘤的小鼠腹腔內(nèi)獲取抗體的情況，如向預(yù)先投入了具有普日斯烷(2，6，10，14-四甲苯基十五烷)等免疫抑制作用的物質(zhì)的BALB/C小鼠的腹腔內(nèi)移植雜交細(xì)胞瘤(約106個(gè)以上)，約1～3周后采取貯留下的腹水。不同種雜交細(xì)胞瘤(如小鼠和白鼠)的情況下，使用裸鼠或放射線處理過(guò)的小鼠為好。
另一方面，從細(xì)胞培養(yǎng)上清中取得抗體情況下，如除了用于細(xì)胞維持的靜置培養(yǎng)法，還可用高密度培養(yǎng)上清法或旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)法來(lái)培養(yǎng)該雜交細(xì)胞瘤且活動(dòng)含有抗體的培養(yǎng)上清。培養(yǎng)液中的血清含有其他抗體和清蛋白等雜質(zhì)，抗體精制很煩瑣。因此，向培養(yǎng)液中少添加物質(zhì)為好。最理想的是用常法在無(wú)血清培養(yǎng)基中，將雜交細(xì)胞瘤馴化，使用無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)法。用無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)使抗體精制變的容易。
從腹水或培養(yǎng)上清中提取MoAb的精制，可用眾所周知的方法進(jìn)行。如用以下方法可很容易的完成作為免疫球蛋白的精制法的用已知的硫酸銨、硫酸鈉進(jìn)行鹽析的分離法，聚甘醇分離法，乙醇分離法，DEAE離子交換色層分析法，凝膠過(guò)濾法等。應(yīng)用這些，可以很容易地達(dá)成目的。
如MoAb是小鼠IgG，可使用蛋白質(zhì)結(jié)合單體或小鼠免疫球蛋白結(jié)合單體用親和色譜法精制，很簡(jiǎn)便。
本發(fā)明以人體umCK(細(xì)胞生物研究所(Institute of Cell Biology)制，Lot No.ETH010122)為抗原，作為能用上述手法對(duì)umCK進(jìn)行特異識(shí)別并阻遏的MoAb。該抗體來(lái)源于小鼠且是IgG類(lèi)的抗體，是對(duì)能特異阻遏umCK酶活性的物質(zhì)進(jìn)行甄別而得的。阻遏力分別為60％以上，更好的為80％以上，最理想的是90％。該抗體是根據(jù)委托通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所處理的雜交細(xì)胞瘤而生產(chǎn)的，受托號(hào)FERM P-18760號(hào)，日期為平成14年3月13日，命名為UI-1881。本發(fā)明的抗體并不局限于具體例子，只要能對(duì)人體umCK進(jìn)行特異識(shí)別，并能特異阻遏起酶活性的抗體均可。另外，本發(fā)明的抗umCK抗體，用于阻遏mCK酶活性時(shí)，單獨(dú)使用也可，復(fù)數(shù)的mCK抗體，如把識(shí)別部位不同的抗體適當(dāng)組合使用也可。同樣，用于阻遏umCK時(shí)，單獨(dú)使用也可，如把識(shí)別部位不同的復(fù)數(shù)抗umCK抗體適當(dāng)組合使用也可。
另外，本發(fā)明的測(cè)定方法中，也可使用能夠特異識(shí)別并阻遏肌節(jié)mCK(smCK)的抗體(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“抗smCK抗體”)。作為smCK抗體的例子，可使用如有通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程學(xué)技術(shù)研究所委托處理的雜交細(xì)胞瘤中產(chǎn)生的命名為mCKI-578的MoAb。(特開(kāi)2002-270號(hào)公開(kāi)公報(bào))，受托號(hào)FERM BP-7133號(hào)，日期平成12年4月13日。這種MoAb可單獨(dú)或組合使用。
因此，通過(guò)把抗umCK抗體和抗smCK抗體單獨(dú)或組合使用，便可有選擇的去除試劑中的mCK、umCK或smCK酶活性。另外，如能與可有選擇的排除CK-M輔助單元的抗體共同使用，便可對(duì)CK同功酶進(jìn)行分別定量，CK同功酶即CK-MB、CK-MM、CK-BB及Mck，更具體的說(shuō)是可以區(qū)分umCK酶活性和smCK酶活性。
免疫學(xué)測(cè)定法本發(fā)明的抗umCK抗體和抗smCK抗體可用于EIA、KIA法，免疫凝集反應(yīng)及其他一切能用抗體測(cè)定的所有測(cè)定方法。這樣可根據(jù)測(cè)定對(duì)象的不同適當(dāng)選擇固定在載體上的抗體、標(biāo)識(shí)抗體、及其他試劑等在最佳條件下使用。如，用免疫手法對(duì)umCK抗體和抗smCK抗體單獨(dú)測(cè)定，就可以把以往用電泳動(dòng)法不能區(qū)別的umCK和smCK區(qū)別開(kāi)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
利用免疫阻遏法的同功酶測(cè)定法CK同功酶測(cè)定法的基本原理是利用根據(jù)免疫阻遏法有選擇的測(cè)定CK同功酶酶活性異活性抗體。一般這種方法按照以下步驟來(lái)測(cè)定C-K-MB的活性。即，使用人類(lèi)CK-M中特異活性抗體，阻遏試劑中CK-MM和MB輔助單元活性(MB約一半的活性抗體被阻遏)之后，把殘存的B輔助單元活性擴(kuò)大2倍，以此來(lái)測(cè)定CK-MB活性。CK-MB活性的測(cè)定，采用如下程序進(jìn)行。下述化學(xué)式1的左行反應(yīng)生成ATP，把ATP再與乙糖激酶(HK)和葡萄糖6磷酸脫水酶(G-6-PDH)共同反應(yīng)生成NADPH，再對(duì)NADPH的量的變化進(jìn)行定量(化學(xué)式2)。
化學(xué)式1化學(xué)式2在上述發(fā)明的CK-MB測(cè)定法中，可把抗CK-M抗體和抗umCK抗體和/或抗smCK抗體在同一工序中使用，進(jìn)行測(cè)定試劑的處理。例如，上述抗體包含于測(cè)定用酶液中，因此可以在同一工序中處理試劑。另一方面，在不同工序中處理的情況下，如向基質(zhì)液中添加抗umCK抗體和/或抗smCK抗體，由于測(cè)定用酶液中含有抗CK-M抗體，也可以進(jìn)行處理。以測(cè)定活性為目的的同功酶是CK-MB的情況下，用抗CK-M抗體和抗mCK抗體(抗umCK抗體和/或抗smCK抗體)在同一工序中處理試劑并進(jìn)行測(cè)定，這樣較為簡(jiǎn)便。
此外，本發(fā)明由于使用抗umCK抗體和/或抗smCK抗體對(duì)試劑進(jìn)行處理，這就提供了以有選擇的排除mCK酶活性為特征的mCK的測(cè)定法。而且，由于使用抗umCK抗體和/或抗smCK抗體對(duì)試劑進(jìn)行處理，提供了以有選擇的排除umCK或smCK的酶活性為特征的umCK或smCK的測(cè)定方法。也就是說(shuō)，在本發(fā)明的mCK或umCK或smCK的測(cè)定法中，把試劑中的對(duì)含有mCK的肌酸激酶活性的測(cè)定與對(duì)上述發(fā)明使用抗umCK抗體和抗smCK抗體，這些mCK以外的肌酸激酶的活性測(cè)定同時(shí)進(jìn)行，從所得的2種測(cè)定值的差中求得mCK或umCK或smCK活性。這時(shí)，對(duì)測(cè)定試劑中含有mCK的肌酸激酶的測(cè)定和上述本發(fā)明的用抗mCK抗體對(duì)mCK以外的肌酸激酶的測(cè)定，既可用含有抗CK-M抗體的測(cè)定用試劑，也可用抗CK-M抗體的試劑。兩種測(cè)定只要在同一條件下進(jìn)行即可。
例如，對(duì)試劑中的全CK活性進(jìn)行測(cè)定，測(cè)完后加入本發(fā)明的抗umCK抗體和/或抗smCK抗體，再次測(cè)定，把所得的2種測(cè)定值做差，就求得了mCK活性。具體還可求得umCK和/或smCK活性。
先將試劑用抗CK-M抗體進(jìn)行處理，CK-MM活性CK-MB的約一半活性被阻遏后，先測(cè)定一次，能測(cè)定出1/2CK-MB+mCK的酶活性(測(cè)定值A(chǔ))，測(cè)完后再加入本發(fā)明的umCK抗體和/或抗smCK抗體再次測(cè)定，就測(cè)定出了1/2CK-MB酶活性(測(cè)定值B)。這樣不僅mCK或umCK或抗smCK而且CK-MB活性也能用同一試劑同時(shí)簡(jiǎn)便迅速的測(cè)出。即把測(cè)定值B乘以2得出CK-MB活性，通過(guò)測(cè)定值A(chǔ)與測(cè)定值B的差求出mCK或umCK或smCK的活性。
例如，把含有試劑中mCK的CK活性與試劑中mCK以外的CK活性分別進(jìn)行測(cè)定，從所得二者的差中得出mCK活性。再如，象下面這樣用配套A和B分別測(cè)出各自活性，從兩者差中可得mCK活性。這時(shí)，如使用在配套A中添加了抗CK-M抗體的CK-MB活性測(cè)定試劑，不僅mCK活性，CK-MB活性也可求得。
A.含有試劑中mCK的全CK活性測(cè)定用試劑配套。
B.在配套A中添加了抗umCK抗體和/或抗smCK抗體的試劑中的mCK(具體為umCK和/或smCK活性)以外的活性測(cè)定用試劑配套。
另外，用本發(fā)明的CK同功酶的分別定量法，先用抗umCK抗體和/或抗smCK抗體對(duì)抗mCK(具體為umCK和/或smCK活性)以外的肌酸激酶活性進(jìn)行測(cè)定(測(cè)定值C)，再用抗CK-M抗體和抗umCK抗體和/或抗smCK抗體對(duì)mCK、CK-MM，和1/2CK-MB以外的CK活性進(jìn)行測(cè)定(測(cè)定值D)，把測(cè)定值C和D分別乘以2再做差，便求得CK-MM活性。
用本發(fā)明的方法測(cè)定的試劑沒(méi)有特殊的限制，通常在臨床檢查領(lǐng)域里進(jìn)行的測(cè)定CK同功酶的方法和試劑都使用。以往的CK同功酶的分離活性中mCK的異常出現(xiàn)可在心肺停止、外傷、小兒腹瀉、惡性腫瘤、肝硬化、淤血性心不全等疾病中觀察到。(檢查和技術(shù)，vol，28，no.13，p.1499-1504，2000)從前，由于umCK和smCK在電泳動(dòng)下泳動(dòng)狀態(tài)相同所以不能區(qū)分開(kāi)，但采用本發(fā)明的測(cè)定法，除上述疾病以外，對(duì)umCK和smCK的異常出現(xiàn)以及其比例的調(diào)查也成為可能。因此，本發(fā)明的測(cè)定方法提供了作為多疾病指標(biāo)的umCK和/或smCK的檢查方法。
另外，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的CK同功酶測(cè)定法、CK-MB測(cè)定法、mCK測(cè)定法中所必須的有配套試劑或單一試劑構(gòu)成的CK同功酶活性測(cè)定用的試劑。本發(fā)明的CK同功酶測(cè)定用試劑是由含有抗mCK酶活性阻遏MoAb或單品構(gòu)成的。這里所說(shuō)的試劑當(dāng)中，包括全CK活性測(cè)定試劑和用于急性心肌梗塞的生化診斷的CK-MB測(cè)定用試劑，但不局限于這些。
下面實(shí)施例具體解釋了本發(fā)明，但并不說(shuō)明本發(fā)明的應(yīng)用范圍僅限于此。
實(shí)施例1產(chǎn)生單克隆抗體(MoAb)的雜交細(xì)胞瘤的制作(1)免疫原(抗原)的調(diào)制本發(fā)明以人體umCK為抗原(細(xì)胞生物研究所制Lot No.ETH010122)。
(2)把被免疫的5-8周齡的近交系BALB/c系雌鼠放在飼養(yǎng)動(dòng)物的室內(nèi)(23±1℃，溫度70％)，用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼養(yǎng)，任意給水。
(3)用免疫方法上述(1)中調(diào)制出的以人體umCK為抗原的精制品，用PBS調(diào)制成100μg/0.5mL濃度與等量(0.5mL)的弗羅因德氏完全佐劑(frend’s complete adjubantDifco公司制)混合并乳化。把這種乳化抗原給5周齡大雌BALB/C小鼠的腹腔內(nèi)每只注射200μL，然后每2周把用Ribi佐劑調(diào)制成的100μg/mL的上述抗原向每只小鼠中每次注射20μg，共四次。然后，一個(gè)月后用Ribi佐劑調(diào)制成的100μg/mL濃度的上述抗原進(jìn)行追加免疫后，測(cè)定小鼠的抗體價(jià)，對(duì)抗體價(jià)高的小鼠要在2周后，用PBS調(diào)制成100μg/mL的精制人體mCK抗原向小鼠尾靜脈注射，實(shí)行最終免疫。
(4)抗體價(jià)測(cè)定(抗體價(jià)驗(yàn)定)從免疫開(kāi)始的時(shí)候就定期的從小鼠眼底網(wǎng)膜少量采血，分離血清后，用umCK酶活性抗體法對(duì)針對(duì)umCK的抗體價(jià)進(jìn)行調(diào)查。
把用PBS稀釋各個(gè)鼠的抗血清10-1000倍調(diào)制的抗體液251μL與25μL的umCK酶液(200U/L)加入到96個(gè)孔的微孔板中，室溫下反應(yīng)10分鐘后，將100μL的酶試劑[100mM咪唑、2mM EDTA、10mM乙酸鎂、2mM腺苷-5-二磷酸(ADP)、5mM腺苷-5’-磷酸(AMP)、40μM P1P5、P5-二(腺苷)5磷酸(AP5A)、30mM 1-硫化甘油、28mMD-葡萄糖、2mM NADP、3U/ml HK、2U/ml、葡萄糖-6-磷酸脫水酶、30mM肌氨酸磷酸二鈉、0.3mg/mL硝基溴氯化四唑、0.6U/ml DIA、pH 6.6]加入到96個(gè)孔的微孔板中，37℃溫度下反應(yīng)10分鐘。
隨機(jī)地，參照試劑盲檢，在波長(zhǎng)570nm下測(cè)定吸光度。而且，取代作為抗體陰性控制的抗血清，添加非免疫鼠，進(jìn)行陰性控制。
表1

如果umCK酶活性阻遏特異抗體在血液中產(chǎn)生，將阻遏umCK酶活性，抑制基質(zhì)反應(yīng)使吸光度的變化量降低。從所得的吸光度中可以確認(rèn)umCK酶活性阻遏特異抗體的存在。結(jié)果如

圖1所示，確認(rèn)了在每一個(gè)鼠上的umCK的酶活性的阻遏。
(5)用于細(xì)胞融合的細(xì)胞從最終免疫開(kāi)始三天后，進(jìn)行BALB/c鼠的摘脾，使脾細(xì)胞浮游在EMEM培養(yǎng)液上面。接著，將脾細(xì)胞用EMEM培養(yǎng)液清洗四次后，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，得到7.0×108個(gè)脾細(xì)胞。細(xì)胞融合，以從8-氮鳥(niǎo)嘌呤(2-amino-6-oxy-8 azapurine)抗性的BALB/c鼠得到的骨髓瘤培養(yǎng)細(xì)胞株(P3X63-Ag8·653、以下稱(chēng)為“X63細(xì)胞”)作為親細(xì)胞株來(lái)使用。X63細(xì)胞，用含有10％的滅活小牛血清(festal calfserumFCS)的RPMI-1640培養(yǎng)液(20μg/mL，含有8-氮鳥(niǎo)嘌呤)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。從細(xì)胞融合的三天前用含有不含8-氮鳥(niǎo)嘌呤的10％的FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)一步培養(yǎng)，使用對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞。將X63細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液清洗三次后，計(jì)算細(xì)胞數(shù)目，得到7.0×107個(gè)細(xì)胞。
在RPNI-1640培養(yǎng)液中，把聚甘醇-4000溶解成50(w/v％的濃度把上述脾細(xì)胞和X63細(xì)胞按10∶1混合，按照開(kāi)勒和密爾斯特因氏的方法(Nature第256卷，495-497，1995)以及Eur.J.Immunol.，第6卷，511-519，1996))進(jìn)行細(xì)胞融合。
之后，在添加了10％的FCS的RPMI-1640培養(yǎng)上清中，在含有1×10-4M的次黃嘌呤、4×10-7氨基蝶呤和1.6×10-5M的胸苷(HAT)的HAT選擇培養(yǎng)基中，脾細(xì)胞以2.0×106個(gè)/mL的密度浮游。接著把這種細(xì)胞浮游液分別注入96穴的微量滴定實(shí)驗(yàn)板的每個(gè)穴中，每個(gè)注入50μL，然后放在二氧化碳無(wú)菌培養(yǎng)箱中在溫度37℃、濕度95％、8％的二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)開(kāi)始后，第一天和第二天向每個(gè)穴中添加一滴，第七天和第九天添加二滴，繼續(xù)對(duì)HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。之后，在不含HAT的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，約10天～2周后，用選擇培養(yǎng)基來(lái)確認(rèn)雜交細(xì)胞瘤。
(6)甄別上述所得的雜交細(xì)胞瘤中，把能產(chǎn)生具有阻遏人體umC K酶活性的抗體通過(guò)以下方法選擇出來(lái)。
把25μL的雜交細(xì)胞瘤培養(yǎng)上清和25μL的人體um C K酶液(200U/L)滴入96穴微量滴定實(shí)驗(yàn)板，在溫室中反應(yīng)10分鐘后，再把200μL的酶試劑(100mM咪唑，2mM EDTA，10mM酢酸鎂，2mM二磷酸腺苷，5mM一磷酸腺苷，40μM P1，P5-(五磷酸腺苷)，30mM1-硫甘油，28Mmd-葡萄糖，2mM NADP，3U/mLHK，2U/mL葡萄糖6磷酸鹽脫水素酶，30mM磷酸肌酸二鈉，0.3mg/mL藍(lán)四唑氯，0.6U/mL心肌黃酶，pH6.6)滴加到96穴微量滴定實(shí)驗(yàn)板上，37℃下使其反應(yīng)10分鐘。然后，在波長(zhǎng)570nm下，對(duì)照試劑育檢，測(cè)定吸光度。作為抗體陰性對(duì)照，不用雜交細(xì)胞瘤培養(yǎng)上清，而是只添加培養(yǎng)液，形成陰性對(duì)照。從所得的吸光度中可以對(duì)產(chǎn)生的抗人體umCKMoAb的雜交細(xì)胞瘤進(jìn)行測(cè)定。
對(duì)確認(rèn)了雜交細(xì)胞瘤的96穴微量滴定實(shí)驗(yàn)板的2469穴進(jìn)行甄別，結(jié)果確認(rèn)了有7穴產(chǎn)生人體umCKMoAb的雜交細(xì)胞瘤。
實(shí)驗(yàn)例1關(guān)于培養(yǎng)上清的酶阻遏特異性關(guān)于上述甄別得出的7穴中的雜交細(xì)胞瘤產(chǎn)生細(xì)胞的培養(yǎng)上清，用人體umCK和人體smCK，人體CK-MM，人體CK-BB或人體CK-MB調(diào)查各酶活性阻遏，確認(rèn)了對(duì)人體CK同功酶的特異性。為了核對(duì)，還調(diào)查了根據(jù)受托號(hào)FERM BP-7133號(hào)被委托處理的雜交細(xì)胞瘤產(chǎn)生的mCKI-578(特開(kāi)2002-270公開(kāi)公報(bào))的MoAb。
其結(jié)果如圖1所示。純系號(hào)UI-178、UI-281、UI-956、UI-1111、UI-1125、UI-1881以及UI-1299的上清，可阻遏82％以上的umCK酶活性，但對(duì)smCK、CK-MM、CK-BB、CK-MB的酶活性完全沒(méi)有阻遏。尤其是UI-1881的上清可阻遏94％的umCK酶活性。另一方面mCKI-578能阻遏94％的smCK酶活性，但對(duì)umCK酶活性和其他同功酶的酶活性沒(méi)有阻遏。
實(shí)驗(yàn)例2產(chǎn)生MoAb雜交細(xì)胞瘤株的建立(選擇建立)對(duì)上述通過(guò)甄別得出的7穴中的雜交細(xì)胞瘤用極限稀釋法進(jìn)行篩選，選擇1純系的能穩(wěn)定產(chǎn)生顯示mCK酶活性阻遏的雜交細(xì)胞瘤。以這個(gè)細(xì)胞為建立株，委托通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所進(jìn)行處理，受托號(hào)FERM P-18760號(hào)。
實(shí)驗(yàn)例3小鼠免疫球蛋白輔助類(lèi)的同定受托號(hào)FERM P-18760號(hào)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的MoAb(UI-1881)的小鼠免疫球蛋白輔助類(lèi)用Zymed公司制的。MONOAb驗(yàn)明工具(MONOAbtyping kit)進(jìn)行同定。結(jié)果證明UI-1881是免疫球蛋白G(IgG2b，k)。
實(shí)驗(yàn)例4UI-1881對(duì)人體CK同功酶的特異性為確認(rèn)UI-1881對(duì)人體CK同功酶的特異性，用人體umCK、人體smCK、人體CK-MM、或人體CK-MB，對(duì)個(gè)酶活性阻遏進(jìn)行了確認(rèn)。并調(diào)查mCKI-578(抗smCK MoAb)進(jìn)行了核查。
其結(jié)果如圖2和圖3所示。UI-1881可阻遏約90％的umCK酶活性，但對(duì)smCK、CK-MM、CK-BB和CK-MB的酶活性完全沒(méi)有阻遏。另一方面，mCKI-578能阻遏約90％的smCK酶活性，對(duì)umCK、CK-MM、CK-BB、和CK-MB的酶活性完全沒(méi)有阻遏。
如上所述，本發(fā)明的抗體能夠特異阻遏umCK酶活性，而不阻遏其他同功酶的活性。另一方面，抗smCK抗體能特異阻遏smCK酶活性，而不阻遏其他同功酶的活性。把這些抗體組合使用，可以對(duì)試劑中的各同功酶進(jìn)行分別測(cè)定。另外，通過(guò)分別測(cè)定的umCK和smCK，就可以檢查出它們的異常出現(xiàn)和比例，與起因于此的疾病之間的關(guān)系也可以查明。這樣就使從臨床檢查測(cè)定值中診斷各種疾病和早期治療成為可能。
權(quán)利要求
1.阻遏線粒體肌酸激酶(mCK)同功酶中umCK活性的抗mCK抗體。
2.在權(quán)利要求1中記述的至少60％阻遏umCK活性的抗體。
3.在肌酸激酶(CK)同功酶的分別定量方面，單獨(dú)或和其他抗mCK的抗體并用時(shí)，實(shí)際上在不影響測(cè)定mCK同功酶以外的CK同功酶的情況下，還能阻遏mCK活性的在權(quán)利要求1和2中記述的抗體。
4.以單克隆抗體為特征的、在權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)中記述的抗體。
5.根據(jù)受委托號(hào)FERM P-18760號(hào)，被委托處理的混合體所產(chǎn)生的單克隆抗體。
6.根據(jù)受委托號(hào)FERM P-18760號(hào)，被委托處理的混合體。
7.利用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)中記述的抗mCK抗體來(lái)測(cè)定mCK量的免疫測(cè)定法。
8.利用阻遏mCK同功酶中smCK(smCK)活性的抗mCK抗體來(lái)測(cè)定mCK量的免疫測(cè)定法。
9.在權(quán)利要求7或8中記述的mCK量為umCK量以及/或者smCK量的免疫測(cè)定法。
10.包括用在權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)中記述的抗體進(jìn)行試劑處理和有選擇地排除mCK活性這兩個(gè)工序的CK同功酶的分別定量法。
11.包括用阻遏smCK活性的抗體單獨(dú)處理、或者用該抗mCK抗體與權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中記述的抗體合用進(jìn)行處理有選擇地排除mCK活性這兩個(gè)工序的CK同功酶的分別定量法。
12.在抗體處理前測(cè)定試劑中的CK活性，然后把阻遏umCK活性的mCK抗體、阻遏smCK活性的抗mCK抗體、抗CK-M輔助單元抗體中的任一個(gè)或兩個(gè)以上組合起來(lái)處理，以測(cè)定殘存活性為特征的、在權(quán)利要求10或11中記述的CK同功酶的分別定量法。
13.包括以針對(duì)CK-M輔助單元的抗體進(jìn)行試劑處理、有選擇地排除CK-M活性這兩個(gè)工序的在權(quán)利要求10-12的任一項(xiàng)中記述的CK同功酶的分別定量法。
14.把以有選擇的排除CK-M活性和mCK活性的處理在同一工序中同時(shí)完成為特征的，在權(quán)利要求13中記述的CK同功酶的分別定量法。
15.把以有選擇的排除CK-M活性和mCK活性這一處理過(guò)程在兩個(gè)以上的工序中、在不同時(shí)間進(jìn)行為特征的，在權(quán)利要求13中記述的CK同功酶的分別定量法。
16.先使針對(duì)CK-M輔助單元的抗體起作用，測(cè)定殘存的CK活性，然后使抗umCK抗體以及/或者抗smCK抗體起作用，測(cè)定殘存的CK活性，包括以上工序的在權(quán)利要求15中記述的CK-MB活性和mCK活性的分別定量法。
17.以把從權(quán)利要求10-16任一項(xiàng)中記述的CK同功酶的分別定量法中得出的測(cè)定值與全身疾患想關(guān)聯(lián)為特征的CK同功酶的檢查方法。
18.在權(quán)利要求7-17任一項(xiàng)中記述的CK同功酶活性測(cè)定法中，把必要的測(cè)定用試劑配套化或由單品構(gòu)成的CK同功酶測(cè)定用試劑。
全文摘要
通過(guò)對(duì)遍在型mCK(umCK)活性和肌節(jié)型mCK(smCK)活性進(jìn)行區(qū)別測(cè)定，提供一種更準(zhǔn)確的mCK同功酶定量方法以及CK同功酶的分別定量法。這通過(guò)使用能特異識(shí)別umCK蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行測(cè)定來(lái)完成，也可使用其他抗mCK抗體(如smCK)抗體)或抗體CK－M阻遏抗體。上述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。象這樣的抗體的例子有可特異識(shí)別umCK的IgG類(lèi)單克隆抗體，是從委托處理號(hào)FERM P－18760號(hào)特定的雜交細(xì)胞瘤中產(chǎn)生的單克隆抗體。
文檔編號(hào)C12N5/20GK1454902SQ0312212
公開(kāi)日2003年11月12日 申請(qǐng)日期2003年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月30日
發(fā)明者白波瀨泰史, 梶田忠宏, 岸浩司, 山下和昭 申請(qǐng)人:國(guó)際試藥株式會(huì)社